General InformationSite-directed mu

General Information

Site-directed mutagenesis can be used to change particular base pairs in a piece of DNA. There are a number of methods for achieving this. The approach described here is adapted from the Stratagene site-directed mutagenesis kit, the manual can be found here. Even when using a kit it will be necessary to design primers that are suitable for the specific changes you want to make to your DNA. Most of the contents of the kit can be found in your favorite labs stocks so you may not need to buy the kit itself. If you have problems with this procedure, you can try 'Round-the-horn site-directed mutagenesis which uses PCR to amplify the desired mutant product.
General Procedure

Purify template plasmid DNA from a dam+ Escherichia coli strain (to ensure that all GATC sites are methylated for later digestion with DpnI).
Design forward and reverse primers that will bind to the region of DNA you want to mutate but that contain the modifications you wish to make. See the CAD tool PrimerX.
Run a primer-extension reaction with a proof-reading, non-displacing polymerase such as Pfu DNA polymerase. This results in nicked circular strands of the plasmid.
Cut up the template DNA with DpnI.
Transform the circular nicked DNA into a highly competent strain such as XL1-Blue. These cells will repair the nicks and not restrict the unmodified product DNA.
Select colonies with the correct DNA.

Specific Protocols

Endy:Site-directed Mutagenesis
Knight:Site-directed mutagenesis
Richard Lab:Site-directed Mutagenesis
'Round-the-horn site-directed mutagenesis
Overlap Extension PCR

Notes

This protocol is at a very early stage of development. Any contributions welcome!
Although the manual recommends only 12 cycles for point mutations, I usually do more (at least 18 cycles). --Reshma 05:28, 14 Jul 2005 (EDT)
I disagree here, further rounds of the reaction favor end-filling instead of primer extension on the template. This is not PCR! You need to primer extend on the original template each time. As the primers become depleted, the polymerase will find other things to extend. Smoore 18:52, 14 Sep 2005 (EDT)
I tried using this protocol to do an insertion/deletion and I believe it failed suggesting that point mutations are easier to accomplish than insertions/deletions. --Reshma 05:28, 14 Jul 2005 (EDT)
Leon Chan suggested that attempting to modify three consecutive bases is difficult. He suggested using 4-5 more cycles than recommended by Stratagene.
See my 'Round-the-horn site-directed mutagenesis protocol to get around these limitations. Smoore 18:52, 14 Sep 2005 (EDT)
Leon also recommended letting the DpnI digestion run for 2-3 hours.
Doing a PNK step on the primers should boost efficiency.
It is not necessary to use XL1-Blue cells. Any highly competent cells should be ok.
Stratagene recommends trying various concentrations of template DNA in the PCR step.
It IS NOT PCR people!Smoore 18:52, 14 Sep 2005 (EDT)
I've had great luck with Overlap Extension PCR which uses a two-step PCR method to introduce substitutions as long as 7 - 8bp at a time. - Nandita
For enhanced amplification try using the primer design from this paper[1]. To reduce self-primer annealing it uses oligos that do not completely overlap. I've made up to 60bp deletions with QuickChange, but it can be really, really painful. Point mutants are much easier. -Ian
For multiple non-adjacent mutations, you can use a method that incorporates PCR and Type IIs restriction systems to incorporate multiple mutations [2]. --Sri Kosuri (talk) 15:27, 10 November 2006 (EST)
Note that the primer design in the protocol of Stratagen is not very perfect. Cause it has a limitation on the Tm of the primers.Here I found a good reference which shows a better method to design the primers and expands the use of QCM. Learn more: http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/32/14/e115
I've found that the method is very sensitive to the reagents. If you are having trouble, and are confident its not a problem with primer sequence, try using fresh reagents for everything; polymerase, buffer, dntps (never freeze thaw more than once), primers (same re freezing), competent cells. Just because your reagents work on a standard PCR or transformation doesn't mean that they are not the problem in your QuikChange rxn. Presumably this is because (as already pointed out above) QuikChange is not a PCR method i.e. where product increases exponentially. I've found that the most robust components are the template plasmid (froze/thawed same aliquot for 4 years!) and dpn1. Another tip is to use a PCR clean up kit after the Dpn1 digest step (this removes traces of detergeant from the PCR buffer which the cells are extremely sensitive to), elute with 30ul and then add 7-8ul of this to 50ul competent cells. - Fergal

References

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ข้อมูลทั่วไปMutagenesis ไซต์โดยตรงสามารถใช้เปลี่ยนแปลงคู่ฐานเฉพาะในชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ มีหลายวิธีการเพื่อให้บรรลุนี้ วิธีที่อธิบายไว้ที่นี่จะปรับจากชุด mutagenesis โดยตรงเว็บไซต์ Stratagene คู่มือสามารถพบได้ที่นี่ แม้ว่าจะใช้ชุด มันจะจำเป็นในการออกแบบไพรเมอร์ที่เหมาะสมสำหรับการเปลี่ยนแปลงเฉพาะที่คุณต้องการทำให้ดีเอ็นเอของคุณ ส่วนใหญ่ของเนื้อหาของชุดสามารถพบในหุ้นแล็บที่ชื่นชอบของคุณดังนั้นคุณอาจไม่ต้องซื้อชุดเอง ถ้าคุณมีปัญหาเกี่ยวกับขั้นตอนนี้ ' ปัดเดอะฮอร์นตรงไซต์ mutagenesis ซึ่งใช้ PCR ขยายผลิตภัณฑ์เต่าต้องการขั้นตอนทั่วไป บริสุทธิ์แม่ plasmid DNA จากเขื่อน + ต้องใช้ Escherichia coli (เพื่อให้แน่ใจว่า เว็บไซต์ GATC ทั้งหมดเป็น methylated สำหรับย่อยอาหารต่อด้วย DpnI) ต้องออกไปข้างหน้า และย้อนกลับไพรเมอร์ที่จะผูกกับภูมิภาคของดีเอ็นเอคุณกลายพันธุ์ แต่ที่ประกอบด้วยการปรับเปลี่ยนที่คุณต้องการให้ ดูเครื่องมือ CAD PrimerX ทำปฏิกิริยาต่อรองพื้น ด้วยเป็นหลักฐานอ่าน ฎพยัคฆ์ไม่พอลิเมอเรสเช่น Pfu ดีเอ็นเอพอลิเมอเรส ซึ่งผล strands nicked กลมของ plasmid ตัดค่าแบบดีเอ็นเอกับ DpnI แปลง DNA nicked กลมเป็นต้องใช้ความสามารถสูงเช่นบลู XL1 เซลล์เหล่านี้จะซ่อมแซม nicks และไม่จำกัด DNA unmodified ผลิตภัณฑ์ เลือกอาณานิคมกับดีเอ็นเอถูกต้อง โพรโทคอเฉพาะ Endy: Mutagenesis ไซต์โดยตรง อัศวิน: ไซต์-mutagenesis โดยตรง ริชาร์ด Lab: ไซต์-Mutagenesis โดยตรง ' ปัดเดอะฮอร์น mutagenesis ไซต์โดยตรง ทับซ้อนนามสกุล PCR หมายเหตุ โพรโทคอลนี้เป็นในระยะมากแรก ๆ ของการพัฒนา ผลงานใด ๆ ยินดีต้อนรับ แม้ว่าคู่มือแนะนำรอบ 12 สำหรับกลายพันธุ์จุด ฉันมักจะทำเพิ่มเติม (รอบที่ 18) -Reshma 05:28, 14 2005 jul (EDT) ฉันไม่เห็นด้วยที่นี่ โปรดปรานปฏิกิริยาสิ้นสุดถมแทนส่วนขยายของพื้นแบบรอบต่อไป นี่ไม่ใช่ PCR คุณต้องการรองพื้นขยายแบบเดิมแต่ละครั้ง เป็นไพรเมอร์ที่พร่อง พอลิเมอเรสจะหาสิ่งอื่น ๆ เพื่อขยาย แสดงผลที่สมบูรณ์ 18:52, 14 กันยายน 2005 (EDT) ฉันพยายามใช้โพรโทคอลนี้จะทำการแทรก/ลบ และผมเชื่อว่า มันไม่สามารถแนะนำกลายพันธุ์จุดง่ายต่อการทำมากกว่าการแทรก/ลบ -Reshma 05:28, 14 2005 jul (EDT) Leon Chan แนะนำว่า พยายามจะปรับเปลี่ยนฐานสามต่อเนื่องกันเป็นเรื่องยาก เขาแนะนำใช้ 4-5 รอบมากขึ้นกว่าที่แนะนำ โดย Stratagene ดูของฉัน ' โพรโทคอลโดยตรงไซต์ mutagenesis กลมเดอะฮอร์นเลี่ยงข้อจำกัดเหล่านี้ แสดงผลที่สมบูรณ์ 18:52, 14 กันยายน 2005 (EDT) ลีออนยังแนะนำให้ย่อยอาหาร DpnI ที่ทำงาน 2-3 ชั่วโมง ทำขั้นตอน PNK บนไพรเมอร์ที่จะเพิ่มประสิทธิภาพ ไม่จำเป็นต้องใช้เซลล์สีน้ำเงิน XL1 ทุกเซลล์มีความสามารถสูงควรจะตกลง Stratagene แนะนำพยายามที่ความเข้มข้นต่าง ๆ ของดีเอ็นเอต้นแบบในขั้นตอนของ PCR มันไม่ได้ PCR คนแสดงผลที่สมบูรณ์ 18:52, 14 กันยายน 2005 (EDT) เคยโชคดีกับซ้อนนามสกุล PCR ซึ่งใช้วิธี PCR สองขั้นตอนแนะนำทดแทนนาน 7 - 8bp ครั้ง -Nandita สำหรับขยายเพิ่มลองใช้แบบรองพื้นจากกระดาษนี้ [1] ลดพื้นตนเอง การอบเหนียวมันใช้ oligos ที่สมบูรณ์ไม่ทับซ้อน ผมได้ทำการลบ 60bp กับ QuickChange แต่มันสามารถจริง ๆ เจ็บปวดจริง ๆ จุดสายพันธุ์ได้ง่ายมาก -เอียน การกลายพันธุ์ไม่ติดกันหลาย ๆ คุณสามารถใช้วิธีที่ PCR และ IIs ชนิดระบบข้อจำกัดการรวมหลายกลายพันธุ์ [2] -Kosuri ศรี (พูด) 15:27, 10 2006 พฤศจิกายน (EST) โปรดสังเกตว่า การออกแบบพื้นในโพรโทคอล Stratagen ไม่สมบูรณ์แบบมาก สาเหตุที่มีข้อจำกัดใน Tm ของไพรเมอร์ที่ที่นี่พบการอ้างอิงที่ดีซึ่งแสดงวิธีการออกแบบไพรเมอร์ที่ดี และขยายการใช้งานของ QCM เรียนรู้เพิ่มเติม: http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/32/14/e115 ได้พบว่าวิธีการสำคัญมากการ reagents ถ้าคุณมีปัญหา มีความมั่นใจไม่ปัญหาลำดับรองพื้น ลองใช้ reagents สดทุกอย่าง พอลิเมอเรส บัฟเฟอร์ dntps (ไม่เคยหยุด thaw มากกว่าครั้ง) ไพรเมอร์ (เหมือนกำลังถึงจุดเยือกแข็ง), เซลล์ที่เชี่ยวชาญ เพียง เพราะคุณ reagents ทำ PCR มาตรฐาน หรือการเปลี่ยนแปลงไม่ได้หมายความ ว่า จะไม่ปัญหา rxn QuikChange ของคุณ สันนิษฐานว่าเป็นเพราะ (เป็นชี้ออกข้าง) QuikChange คือวิธี PCR ไม่เช่น ตำแหน่งผลิตภัณฑ์เพิ่มขึ้นเป็นทวีคูณเมื่อ ได้พบว่า ส่วนประกอบที่แข็งแกร่งที่สุดเป็น plasmid แม่ (froze/thawed เหมือน aliquot 4 ปี) และ dpn1 คำแนะนำที่อื่นเป็น การใช้ PCR ล้างชุดหลังจากขั้นตอนแยกย่อย Dpn1 (ลบร่องรอยของ detergeant จากบัฟเฟอร์ PCR ซึ่งอ่อนไหวมากกับเซลล์), elute กับ 30ul 7-8ul นี้ 50ul เซลล์มีอำนาจ -Fergal การอ้างอิง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ข้อมูลทั่วไปฉับเว็บไซต์ที่กำกับสามารถใช้ในการเปลี่ยนฐานคู่โดยเฉพาะอย่างยิ่งในชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ มีหลายวิธีการในการบรรลุเป้าหมายนี้เป็น วิธีการที่อธิบายที่นี่ถอดแบบมาจากเว็บไซต์ที่กำกับชุดฉับ Stratagene คู่มือที่สามารถพบได้ที่นี่ แม้เมื่อใช้ชุดมันจะมีความจำเป็นในการออกแบบไพรเมอร์ที่มีความเหมาะสมสำหรับการเปลี่ยนแปลงเฉพาะที่คุณต้องการให้กับดีเอ็นเอของคุณ ส่วนใหญ่ของเนื้อหาของชุดที่สามารถพบได้ในหุ้นที่คุณชื่นชอบห้องปฏิบัติการดังนั้นคุณอาจไม่จำเป็นต้องซื้อชุดตัวเอง ถ้าคุณมีปัญหาเกี่ยวกับขั้นตอนนี้คุณสามารถลอง 'รอบที่ฮอร์นเว็บไซต์กำกับการกลายพันธุ์ที่ใช้วิธี PCR ในการขยายผลิตภัณฑ์กลายพันธุ์ที่ต้องการทั่วไปขั้นตอนเพียวริฟายดีเอ็นเอแม่แบบพลาสมิดจากเขื่อน + สายพันธุ์ Escherichia coli (เพื่อให้แน่ใจว่าทุกเว็บไซต์ GATC ถูก methylated สำหรับการย่อยอาหารต่อมากับ DpnI) การออกแบบไปข้างหน้าและไพรเมอร์ที่จะผูกกับภูมิภาคของดีเอ็นเอของคุณต้องการที่จะกลายพันธุ์ แต่ที่มีการปรับเปลี่ยนที่คุณต้องการที่จะทำให้กลับ ดูเครื่องมือ CAD PrimerX เรียกปฏิกิริยาประถมศึกษาขยายที่มีหลักฐานการอ่านโพลิเมอร์ไม่แทนที่เช่น Pfu ดีเอ็นเอโพลิเมอร์ ซึ่งส่งผลให้เส้นวงกลมจับของพลาสมิดตัดขึ้นดีเอ็นเอแม่แบบที่มี DpnI แปลงดีเอ็นเอแหว่งวงกลมเป็นสายพันธุ์ที่มีความสามารถสูงเช่น XL1 สีฟ้า เซลล์เหล่านี้จะซ่อมแซมชื่อเล่นและไม่ จำกัด สินค้าที่ยังไม่แปรดีเอ็นเอเลือกโคโลนีที่มีดีเอ็นเอที่ถูกต้องโปรโตคอลเฉพาะEndy: เว็บไซต์กำกับการกลายพันธุ์อัศวิน: ฉับเว็บไซต์กำกับริชาร์ด Lab: เว็บไซต์กำกับการกลายพันธุ์'รอบที่ฮอร์น Site- ฉับกำกับซ้อนขยาย PCR หมายเหตุโปรโตคอลนี้อยู่ในช่วงเริ่มต้นของการพัฒนา การมีส่วนร่วมใด ๆ ยินดีต้อนรับแม้ว่าคู่มือแนะนำเพียง 12 รอบสำหรับการกลายพันธุ์จุดฉันมักจะทำมากขึ้น (อย่างน้อย 18 รอบ) --Reshma 05:28, 14 กรกฎาคม 2005 (EDT) ผมไม่เห็นด้วยที่นี่รอบต่อไปของที่ระลึกปฏิกิริยาจบเติมแทนรองพื้นขยายแม่แบบ นี้ไม่ได้ PCR! คุณจำเป็นต้องรองพื้นขยายแม่แบบเดิมในแต่ละครั้ง เป็นไพรเมอร์กลายเป็นหมด, โพลิเมอร์จะได้พบกับสิ่งอื่น ๆ ที่จะขยาย Smoore 18:52, 14 กันยายน 2005 (EDT) ฉันพยายามใช้โปรโตคอลนี้จะทำแทรก / ลบและผมเชื่อว่ามันจะไม่แสดงให้เห็นว่าการกลายพันธุ์จุดที่ง่ายต่อการประสบความสำเร็จกว่าการแทรก / ลบ --Reshma 05:28, 14 กรกฎาคม 2005 (EDT) ลีอองจันบอกว่าความพยายามที่จะปรับเปลี่ยนฐานสามติดต่อกันเป็นเรื่องยาก เขาแนะนำให้ใช้ 4-5 รอบมากขึ้นกว่าที่แนะนำโดย Stratagene ดูรอบที่ฮอร์นเว็บไซต์ที่กำกับโปรโตคอลการกลายพันธุ์ของฉันที่จะได้รับรอบข้อ จำกัด เหล่านี้ Smoore 18:52, 14 กันยายน 2005 (EDT) ลีออนยังแนะนำให้ใช้การย่อยอาหาร DpnI 2-3 ชั่วโมงทำขั้นตอน PNK กับไพรเมอร์ควรจะเพิ่มประสิทธิภาพมันไม่จำเป็นที่จะใช้เซลล์ XL1 สีฟ้า เซลล์ใด ๆ ที่มีความสามารถสูงควรจะ ok Stratagene แนะนำพยายามที่ความเข้มข้นต่างๆของแม่แบบดีเอ็นเอในขั้นตอนวิธี PCR ก็ไม่ได้เป็นคน PCR! Smoore 18:52, 14 กันยายน 2005 (EDT) ฉันเคยโชคดีกับการทับซ้อนขยาย PCR ซึ่งใช้ สองขั้นตอนวิธี PCR ที่จะแนะนำแทนตราบเท่าที่ 7 - 8BP ในเวลา - Nandita สำหรับการขยายเพิ่มขึ้นลองใช้การออกแบบไพรเมอร์ที่ได้จากงานวิจัยนี้ [1] เพื่อลดการหลอมตนเองรองพื้นจะใช้ oligos ที่ไม่สมบูรณ์ทับซ้อน ฉันได้ทำขึ้นเพื่อลบ 60bp กับ QuickChange แต่มันสามารถจริงๆเจ็บปวดจริงๆ การกลายพันธุ์จุดที่ง่ายมาก -Ian สำหรับการกลายพันธุ์ที่ไม่ติดกันหลาย ๆ คุณสามารถใช้วิธีการที่รวมเอาวิธี PCR และประเภท IIs ระบบข้อ จำกัด ในการรวมการกลายพันธุ์หลาย [2] --Sri Kosuri (พูดคุย) 15:27, 10 พฤศจิกายน 2006 (EST) หมายเหตุว่าการออกแบบไพรเมอร์ในโปรโตคอลของ Stratagen ไม่สมบูรณ์มาก สาเหตุก็มีข้อ จำกัด ในการ Tm ของ primers.Here ฉันพบการอ้างอิงที่ดีซึ่งแสดงให้เห็นวิธีที่ดีกว่าในการออกแบบไพรเมอร์และขยายการใช้ QCM รายละเอียดเพิ่มเติม: http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/32/14/e115 ฉันได้พบว่าวิธีการที่มีความสำคัญมากที่จะน้ำยา หากคุณกำลังมีปัญหาและมีความมั่นใจที่จะไม่เกิดปัญหากับลำดับรองพื้นให้ลองใช้น้ำยาสำหรับทุกอย่าง; โพลิเมอร์, บัฟเฟอร์ dntps (ไม่เคยแช่แข็งละลายมากกว่าหนึ่งครั้ง), ไพรเมอร์ (แช่แข็งอีกครั้งเดียวกัน) เซลล์ที่มีความสามารถ เพียงเพราะน้ำยาของคุณทำงานบนมาตรฐาน PCR หรือเปลี่ยนแปลงไม่ได้หมายความว่าพวกเขาจะไม่ได้เป็นปัญหาใน rxn QuikChange ของคุณ น่าจะเป็นเพราะ (ตามที่อยู่แล้วชี้ให้เห็นด้านบน) QuikChange ไม่ใช่วิธีคือวิธี PCR ที่เพิ่มขึ้นของผลิตภัณฑ์ชี้แจง ฉันได้พบว่าองค์ประกอบที่แข็งแกร่งมากที่สุดคือแม่แบบพลาสมิด (แช่แข็ง / ละลาย aliquot เดียวกันเป็นเวลา 4 ปี) และ dpn1 เคล็ดลับก็คือการใช้ทำความสะอาดชุด PCR หลังจาก Dpn1 ย่อยขั้นตอน (นี้เอาร่องรอยของ detergeant จากบัฟเฟอร์ PCR ที่เซลล์มีความไวมาก) ชะใน 30ul แล้วเพิ่ม 7-8ul นี้จะ 50ul เซลล์ที่มีความสามารถ - Fergal อ้างอิง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ข้อมูลทั่วไป

ของเว็บไซต์ที่สามารถใช้ในการเปลี่ยนเฉพาะคู่เบสในชิ้นส่วนของดีเอ็นเอ มีจำนวนของวิธีการเพื่อให้บรรลุนี้ วิธีการที่อธิบายที่นี่จะดัดแปลงจาก stratagene เว็บไซต์โดยตรงของชุดคู่มือที่สามารถพบได้ที่นี่แม้เมื่อใช้ชุดก็จะต้องออกแบบไพรเมอร์ที่จำเพาะเหมาะสมสำหรับการเปลี่ยนแปลงที่คุณต้องการทำ DNA ของคุณ ส่วนใหญ่เนื้อหาของชุดสามารถพบได้ในหุ้น Labs โปรดของคุณดังนั้นคุณอาจต้องการที่จะซื้อชุดเอง ถ้าคุณมีปัญหากับกระบวนการนี้คุณสามารถลองรอบฮอร์นเว็บไซต์กำกับการใช้ PCR ซึ่งเป็นการกลายพันธุ์ที่ต้องการสินค้า ขั้นตอนทั่วไป


ทำให้พลาสมิดดีเอ็นเอแม่แบบจากเขื่อน Escherichia coli สายพันธุ์ ( เพื่อให้แน่ใจว่าเว็บไซต์ gatc ทั้งหมด methylated ภายหลังการย่อยด้วย
dpni )ไปข้างหน้าและย้อนกลับออกแบบไพรเมอร์ที่จะผูกกับภูมิภาคของ DNA ที่คุณต้องการเปลี่ยนแปลง แต่ที่มีการปรับเปลี่ยนที่คุณต้องการเพื่อให้ เห็นเครื่องมือ CAD primerx .
เรียกปฏิกิริยาการรองพื้นด้วยหลักฐานการอ่านไม่แทนที่การเช่นดีเอ็นเอพอลิเมอเรสพีเอฟยู . ผลนี้ในการถักวงกลมแหว่งของพลาสมิด
ตัดแม่แบบดีเอ็นเอด้วย
dpni .แปลงวงกลมแหว่งดีเอ็นเอเป็นสายพันธุ์ที่มีความสามารถสูง เช่น xl1 สีฟ้า เซลล์เหล่านี้จะซ่อมแซมบาดแผล และไม่จํากัดดีเอ็นเอผลิตภัณฑ์แปร .
เลือกอาณานิคมกับดีเอ็นเอที่ถูกต้อง



endy โปรโตคอลเฉพาะเว็บไซต์ที่ : อัศวินของ
: เว็บไซต์กำกับการ
ริชาร์ด Lab : เว็บไซต์กำกับการ
' รอบฮอร์นเว็บไซต์กำกับการขยาย PCR


ซ้อนกันหมายเหตุ

ขั้นตอนนี้ เป็นขั้นตอนมากในช่วงต้นของการพัฒนา ผลงานใด ๆยินดีต้อนรับ
ถึงแม้ว่าคู่มือแนะนำเพียง 12 รอบสำหรับจุดกลายพันธุ์ ฉันมักจะทำมากกว่า ( อย่างน้อย 18 ครั้ง ) -- reshma 05:28 14 ก.ค. 2548 ( EDT )
ผมไม่เห็นด้วยที่นี่อีกรอบของปฏิกิริยาชอบปลายไส้แทนรองพื้นส่วนขยายในแม่แบบ นี่ไม่ใช่เทคนิค !คุณต้องใช้เพิ่มในแม่แบบเดิมในแต่ละครั้ง เป็นไพรเมอร์จะไม่พร่อง การจะหาสิ่งอื่น ๆเพื่อขยาย smoore 18:52 , 14 กันยายน 2005 ( EDT )
ฉันพยายามใช้โปรโตคอลนี้จะแทรก / ลบและผมเชื่อว่ามันไม่ได้บอกว่าจุดกลายพันธุ์จะง่ายต่อการบรรลุกว่าแทรก / ลบ . -- reshma 05:28 14 ก.ค. 2548 ( EDT )
ลีออน ชาน แนะนำว่าพยายามที่จะปรับเปลี่ยนฐานสามติดต่อกันยาก เขาแนะนำการใช้ 4-5 รอบกว่าที่แนะนำโดย stratagene .
เห็นรอบฮอร์นเว็บไซต์กำกับการรับรอบข้อระเบียบเหล่านี้ smoore 18:52 , 14 กันยายน 2005 ( EDT )
ลีออนยังแนะนำให้ dpni การย่อยอาหารทำงาน 2-3 ชั่วโมง .
ทำขั้นตอนที่ ปิ่นเกล้า บนชนิดควรเพิ่มประสิทธิภาพ .
ไม่จําเป็นต้องใช้เซลล์สีฟ้า xl1 . มีความสามารถสูง เซลล์น่าจะโอเค .
stratagene แนะนำพยายามความเข้มข้นต่างๆของแม่แบบดีเอ็นเอใน PCR ขั้นตอน .
ไม่ใช่โดยคน smoore 18:52 , 14 กันยายน 2005 ( EDT )
ฉันมีโชคกับซ้อนขยาย PCR ซึ่งใช้วิธี PCR 2 ขั้นตอนแนะนำแทนตราบเท่าที่ 7 - 8bp ครั้ง - nandita
สำหรับเพิ่มขยายลองใช้แนวทางการออกแบบจากบทความนี้ [ 1 ] เพื่อลดขนาดมันใช้รองพื้นตัวโอลิโกสที่ไม่สมบูรณ์ที่ทับซ้อนกัน ฉันได้สร้างขึ้นเพื่อ 60bp ลบด้วย quickchange แต่มันสามารถจริงๆ เจ็บปวดจริงๆจุดกลายพันธุ์จะง่ายขึ้นมาก - เอียน
ไม่ติดกันหลายเรื่อง คุณสามารถใช้วิธีการที่ประกอบด้วยเทคนิคและระบบจำกัด IIS ประเภทรวมหลายเรื่อง [ 2 ] -- ศรี kosuri ( คุย ) 15 : 27 , 10 พฤศจิกายน 2006 ( EST )
ทราบว่ารองพื้นออกแบบโปรโตคอลของ stratagen ไม่ค่อยสมบูรณ์ เพราะมันมีข้อจำกัดในด้านของรองพื้นที่นี่ฉันพบการอ้างอิงที่ดีที่แสดงวิธีการที่ดีกว่าการออกแบบไพรเมอร์ และขยายการใช้ QCM . เรียนรู้เพิ่มเติม : http://nar.oxfordjournals.org/cgi/content/full/32/14/e115
ผมพบว่าวิธีการที่อ่อนไหวมากกับสารเคมี . ถ้าคุณมีปัญหา มั่นใจไม่น่ามีปัญหาอะไร มีลำดับ ไพรเมอร์ ลองใช้สารเคมี สดทุกอย่าง การบัฟเฟอร์dntps ( ไม่แช่แข็งละลายมากกว่าหนึ่งครั้ง ) , ไพรเมอร์ ( กันหนาว ) , เซลล์ที่มีความสามารถ เพราะสารเคมีของคุณทำงานบนมาตรฐาน PCR หรือเปลี่ยนแปลงไม่ได้หมายความว่าพวกเขาไม่ได้มีปัญหาใน rxn quikchange ของคุณ สันนิษฐานว่าเป็นเพราะ ( ตามที่บอกข้างบน ) quikchange ไม่ใช่วิธีพีซีอาร์ได้แก่ผลิตภัณฑ์ที่เพิ่มขึ้นชี้แจงฉันพบว่า องค์ประกอบที่แข็งแกร่งที่สุดเป็นแม่แบบพลาสมิด ( แข็ง / ละลายเดียวกันส่วนลงตัว 4 ปี ! ) และ dpn1 . อีกเคล็ดลับคือการใช้ PCR ทำความสะอาดชุดหลัง dpn1 ย่อยขั้นตอนนี้ ( ลบร่องรอยของ detergeant จาก PCR buffer ซึ่งเซลล์มีความไวต่อ ) elute กับ 30ul แล้วเพิ่ม 7-8ul นี้ 50ul เซลล์ที่มีความสามารถ - fergal

อ้างอิง