2. Materials and methods2.1. Chemic

2. Materials and methods
2.1. Chemical reagents
HPLC-grade methanol, 2-propanol, sodium acetate, boric acid,
zinc chloride (ZnCl2), o-phtaldehyde (OPA) and amino acid standards
were obtained from Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA). All
other reagents were of the highest purity available and water was
Milli-Q deionized water.
2.2. Equipment and chromatographic conditions
The HPLC system used in the present work was a Shimadzu
model (LC-10 AD, Tokyo, Japan) with a 20 l injection loop and
a fluorescent detector (RF-10AXL) coupled to an LC-20AT pump.
The system was equipped with a Shimadzu C18 analytical column
(Shim-pack VP-ODS 4.6*250LC, internal diameter 4.6 mm) and a
pre-packed column holder. The column was heated to 29 ◦C with a
thermostat system (CTO-20A). An integrator was also used to analyze
the chromatographic data. The mobile phase was composed of
50 mM sodium acetate, methanol 5% and 2-propanol (pH 5.67) as
phase A and methanol 70% as phase B. These phases were eluted
in a low-pressure gradient as follows: Initially 100% phase A, after
20 min 50%, and back to 100% at 25 min elution time. Mobile phases
were filtered with Millipore 0.22 m Durapore membrane filters
before use. The fluorescent detector was set at 340 nm (excitation
wavelength) and 460 nm (emission wavelength).
2.3. Derivatization procedure and glutamate quantification
The derivatization process was performed by mixing 60 l of
sample or glutamate standard solution, 10 l of freshly prepared
methanolic OPA (13 mg), and 40 l borate buffer (pH 9.5). This final
solution was vortexed and analyzed after 5 min.
2.4. Analytical curves and method validation
The stock solutions of glutamate and internal standard
(homoserine) were dissolved in ultra pure water at 100 g/mL.
The working solutions for glutamate (0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0
and 20.0 g/mL) and homoserine (6 g/mL) were used. Retention
time, linearity, calibration, selectivity, Limit of Detection (LOD) and
Quantification (LOQ), accuracy, precision, recovery and stability
were determined in accordance with Guideline for validation methods
described by Brazilian National Agency of Sanitary Vigilance
(BANVISA) and US Food and Drug administration (US FDA) [24–25].
The selectivity was performed by comparing between matrix with
and without glutamate. Working solution and calibration solution
were used to determine the linearity and calibration curve, respectively.
We used the Hank’s buffer after retinal incubations periods to
perform calibration curve. The values of the curves were calculated
by the ratio between the peak areas corresponding to glutamate
and the internal standard, respectively, utilizing the LC solution
software. Linear regression curve (y = ax + b) was performed to
obtain the correlation coefficient and equation of the line.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. Materials and methods2.1. Chemical reagentsHPLC-grade methanol, 2-propanol, sodium acetate, boric acid,zinc chloride (ZnCl2), o-phtaldehyde (OPA) and amino acid standardswere obtained from Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA). Allother reagents were of the highest purity available and water wasMilli-Q deionized water.2.2. Equipment and chromatographic conditionsThe HPLC system used in the present work was a Shimadzumodel (LC-10 AD, Tokyo, Japan) with a 20 l injection loop anda fluorescent detector (RF-10AXL) coupled to an LC-20AT pump.The system was equipped with a Shimadzu C18 analytical column(Shim-pack VP-ODS 4.6*250LC, internal diameter 4.6 mm) and apre-packed column holder. The column was heated to 29 ◦C with athermostat system (CTO-20A). An integrator was also used to analyzethe chromatographic data. The mobile phase was composed of50 mM sodium acetate, methanol 5% and 2-propanol (pH 5.67) asphase A and methanol 70% as phase B. These phases were elutedin a low-pressure gradient as follows: Initially 100% phase A, after20 min 50%, and back to 100% at 25 min elution time. Mobile phaseswere filtered with Millipore 0.22 m Durapore membrane filtersbefore use. The fluorescent detector was set at 340 nm (excitationwavelength) and 460 nm (emission wavelength).2.3. Derivatization procedure and glutamate quantificationThe derivatization process was performed by mixing 60 l ofตัวอย่างหรือ glutamate สารละลายมาตรฐาน l 10 ของลิ้มmethanolic OPA (13 mg), และ 40 l borate บัฟเฟอร์ (pH 9.5) สุดท้ายนี้โซลูชันที่ถูก vortexed และวิเคราะห์หลังจาก 5 นาที2.4 การเส้นโค้งที่วิเคราะห์และตรวจสอบวิธีโซลูชั่นหุ้นของ glutamate และมาตรฐานภายใน(homoserine) ที่ละลายในน้ำบริสุทธิ์ที่ 100 g/mLโซลูชั่นการทำงานสำหรับ glutamate (0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0และ 20.0 g/mL) และ homoserine (6 g/mL) ใช้ เงินวางประกันเวลา แบบดอกไม้ ปรับเทียบ วิธี ข้อจำกัดของการตรวจหารายการ (ลอด) และนับ (LOQ), ความแม่นยำ ความแม่นยำ การกู้คืน และความมั่นคงถูกกำหนดตามหลักเกณฑ์วิธีการตรวจสอบอธิบายโดยบราซิลแห่งชาติหน่วยงานของสุขาภิบาลระมัดระวัง(BANVISA) และการจัดการเราอาหารและยา (เรา FDA) [24-25]วิธีการทำ โดยการเปรียบเทียบระหว่างเมตริกซ์ด้วยโดย glutamate โซลูชั่นการทำงานและการแก้ไขปรับเทียบถูกใช้เพื่อกำหนดเส้นโค้งแบบดอกไม้และปรับเทียบ ตามลำดับเราใช้ของแฮงก์บัฟเฟอร์หลังจากรอบระยะเวลา incubations จอประสาทตาจะดำเนินการเทียบเส้นโค้ง มีคำนวณค่าของเส้นโค้งโดยอัตราส่วนระหว่างพื้นที่สูงสุดที่สอดคล้องกับ glutamateและ มาตรฐานภายใน ตามลำดับ ใช้โซลูชัน LCซอฟต์แวร์ ถดถอยเชิงเส้นโค้ง (y = ax + b) ทำให้หาสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์และสมการของเส้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สารเคมีเมทานอล HPLC เกรด 2 โพรพานน้ำนมโซเดียมกรดบอริก, สังกะสีคลอไรด์ (ZnCl2) o-phtaldehyde (OPA) และมาตรฐานกรดอะมิโนที่ได้รับจากSigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) ทั้งหมดสารเคมีอื่น ๆ ของความบริสุทธิ์สูงสุดและน้ำเป็นพัน-Q น้ำ deionized. 2.2 อุปกรณ์และเงื่อนไขสารระบบ HPLC เพื่อใช้ในการทำงานในปัจจุบันเป็น Shimadzu รูปแบบ (LC-10 AD, กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) กับ 20 วงฉีดลิตรและเครื่องตรวจจับเรืองแสง (RF-10AXL) คู่กับปั๊ม LC-20AT ระบบได้รับการติดตั้ง Shimadzu C18 คอลัมน์วิเคราะห์(Shim แพ็ค VP-ODS 4.6 * 250LC เส้นผ่าศูนย์กลางภายใน 4.6 มิลลิเมตร) และผู้ถือคอลัมน์ก่อนบรรจุ คอลัมน์ถูกความร้อนถึง 29 ◦Cด้วยระบบเทอร์โม(CTO-20A) รวบรวมยังถูกใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลที่โครมา เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยacetate โซเดียม 50 มิลลิเมทานอล 5% และ 2 โพรพาน (pH 5.67) ขณะที่เฟสA และเมทานอล 70% เป็นระยะ B. ขั้นตอนเหล่านี้ถูกชะในการไล่ระดับความดันต่ำดังนี้ขั้นต้นขั้นตอน100% หลังจาก20 นาที 50% และกลับมาถึง 100% ในเวลา 25 นาทีชะ ขั้นตอนที่มือถือถูกกรองด้วยค 0.22? m กรองเมมเบรน Durapore ก่อนการใช้งาน เครื่องตรวจจับเรืองแสงตั้งอยู่ที่ 340 นาโนเมตร (กระตุ้นความยาวคลื่น) และ 460 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นปล่อยก๊าซเรือนกระจก). 2.3 ขั้นตอนอนุพันธ์และการหาปริมาณกลูตาเมตกระบวนการอนุพันธ์ได้ดำเนินการโดยการผสม 60 ลิตรตัวอย่างหรือกลูตาเมตสารละลายมาตรฐาน, 10 ลิตรที่เตรียมสดใหม่เมทานอลOPA (13 มก.) และ 40 ลิตรบอเรตบัฟเฟอร์ (pH 9.5) สุดท้ายนี้การแก้ปัญหาได้รับการ vortex และวิเคราะห์หลังจาก 5 นาที. 2.4 เส้นโค้งการวิเคราะห์และการตรวจสอบวิธีการแก้ปัญหาสต็อกของกลูตาเมตและมาตรฐานภายใน(homoserine) ถูกละลายในน้ำบริสุทธิ์พิเศษที่ 100 กรัม / มล. โซลูชั่นการทำงานสำหรับกลูตาเมต (0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 และ 20.0? กรัม / มิลลิลิตร) และ homoserine (6 กรัม / มิลลิลิตร) ถูกนำมาใช้ การเก็บรักษาเวลาเป็นเชิงเส้น, การสอบเทียบหัวกะทิ จำกัด ของการตรวจจับ (LOD) และปริมาณ(LOQ) ความถูกต้องแม่นยำการกู้คืนและความมั่นคงได้รับการพิจารณาให้สอดคล้องกับแนวทางการใช้วิธีการตรวจสอบการอธิบายโดยสำนักงานแห่งชาติของบราซิลสุขาภิบาลระมัดระวัง(BANVISA) และสหรัฐอเมริกา อาหารและยา (FDA สหรัฐ) [24-25]. การเลือกดำเนินการโดยการเปรียบเทียบระหว่างเมทริกซ์ที่มีและไม่มีกลูตาเมต วิธีการแก้ปัญหาการทำงานและการแก้ปัญหาการสอบเทียบที่ถูกใช้ในการกำหนดเส้นตรงและเส้นโค้งการสอบเทียบตามลำดับ. เราใช้บัฟเฟอร์ของแฮงค์หลังจากระยะเวลาฟักตัวของเชื้อที่จอประสาทตาที่จะดำเนินการสอบเทียบโค้ง ค่าของเส้นโค้งนี้จะถูกคำนวณจากอัตราส่วนระหว่างพื้นที่สูงสุดที่สอดคล้องกับกลูตาเมตและมาตรฐานภายในตามลำดับการใช้วิธีการแก้ปัญหาLC ซอฟแวร์ เส้นโค้งการถดถอยเชิงเส้น (y = ขวาน + ข) ได้ดำเนินการที่จะได้รับค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์และสมการของเส้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สารเคมี
HPLC เกรดเมทานอล , โพรพานอล , โซเดียมอะซิเตท , boric acid
สังกะสีคลอไรด์ ( zncl2 ) o-phtaldehyde ( OPA ) และกรดอะมิโนมาตรฐาน
ได้จาก Sigma –ดิช ( St . Louis , MO , USA ) สารเคมีอื่น ๆทั้งหมด
ของความบริสุทธิ์ของน้ำสูงสุดและ milli-q คล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ
.
2.2 . อุปกรณ์และเงื่อนไข
โครมาโทกราฟีพบระบบที่ใช้ในงานปัจจุบันเป็น Shimadzu
แบบ ( lc-10 ลงประกาศ , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) กับ 20  ผมฉีดวงและ
เครื่องตรวจจับเรืองแสง ( rf-10axl ) คู่กับ lc-20at ปั๊ม
ระบบติดตั้งกับ Shimadzu c18 วิเคราะห์คอลัมน์
( ชิม แพ็ค vp-ods 4.6 * 250lc ภายในเส้นผ่าศูนย์กลาง 4.6 มม. ) และ
ก่อนบรรจุใส่คอลัมน์ คอลัมน์ให้ความร้อนถึง 29 ◦ C กับ
ระบบเทอร์โมสตัท ( cto-20a )การ ) ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์
ข้อมูลทางโครมาโทกราฟี เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย
โซเดียมอะซีเตท 50 มม. ส่วน 5% และโพรพานอล ( pH 5.67 )
เฟสและเมทานอล 70 % เป็นระยะระยะ พ. เหล่านี้คือตัวอย่าง
ในความดันต่ำ ไล่ระดับ ดังนี้ เริ่มต้น 100% ระยะหลังจากที่
20 นาที 50 % และกลับถึง 100% ที่ 25 นาที ( เวลา ระยะเคลื่อนที่
ถูกกรองด้วยมิลลิ 022 ตัวกรองเมมเบรน  M durapore
ก่อนใช้ เครื่องตรวจจับเรืองแสงไว้ที่ 340 nm ( i
ความยาวคลื่น ) และ 460 nm ( ปล่อยความยาวคลื่น ) .
2.3 ขั้นตอน และผงชูรสปริมาณซัลซัล
กระบวนการทำโดยผสม 60  l
ตัวอย่างหรือสารละลายมาตรฐานผงชูรส , 10  ล. เตรียม
สด opa ( 13 มก. ) , เมทานอลและฉัน 40  บอเรตบัฟเฟอร์ pH 9.5 ) สุดท้ายนี้
สารละลายที่ vortexed และวิเคราะห์หลังจาก 5 นาที
2.4 . เส้นโค้งเชิงวิเคราะห์ และวิธีการตรวจสอบหุ้นและโซลูชั่นของผงชูรส

มาตรฐานภายใน ( โฮโมเซอรีน ) ละลายใน อัลตร้า น้ำบริสุทธิ์ที่ 100  กรัม / มล.
โซลูชั่นการทำงานสำหรับกลูตาเมต ( 0.1 , 0.5 , 1.0 , 2.5 , 5.0 และ 10.0 20.0
 กรัม / มิลลิลิตร ) และโฮโมเซอรีน ( 6  กรัม / มิลลิลิตร ) สถิติที่ใช้ การเก็บรักษา
เวลาเป็นเส้นตรง , สอบเทียบ , โอกาสในการเลือก