Measurement of cellular ROS production
Cellular ROS production was measured using a DCFDA assay kit according to manufactory’s
protocol. DCFDA (2’,7’-dichlorofluorescein diacetate), a cell-permeable fluorogenic dye, is
deacetylated by cellular esterases to a non-fluorescent compound, and later oxidized by ROS
into highly fluorescent 2’,7’-dichlorofluorescein (DCF), which measures hydroxyl, peroxyl and
other ROS activity within the cell. HCECs were grown on 96-well plates or 8-chamber slides.
When reached confluence, the cells were washed twice with phosphate-buffered saline (PBS)
and then incubated with 25 μM DCFDA in essential medium with 10% FBS in 37°C incubator
for 45 min. After PBS washed twice, the cells were exposed to hyperosmotic media (350, 400 or
450 mOsM) by adding NaCl (19, 44 or 69 mM, respectively) for different time periods (30–180
min). Cells images were taken under fluorescent microscope. Cell fluorescence in 96-well plates
was measured at 488 nm excitation and 525 nm emission using Tecan Infinite M200 Multimode
Microplate Reader (Tecan US, Inc. Morrisville, NC) after adding NaCl for 15–120 mins.
Relative changes of DCF fluorescence were expressed as fold increase over untreated cells.
การวัดผลิต ROS โทรศัพท์มือถือโทรศัพท์มือถือผลิต ROS ถูกวัดโดยใช้ชุดทดสอบ DCFDA ตามของโรงงานโพรโทคอลการ DCFDA (2', 7' dichlorofluorescein diacetate), สี fluorogenic เซลล์ permeable เป็นdeacetylated โดย esterases โทรศัพท์มือถือกับสารประกอบไม่ใช่ฟลูออเรสเซนต์ และออกซิไดซ์ โดย ROS ในภายหลังเป็นเรืองแสงสูง 2', 7'-dichlorofluorescein (DCF), ซึ่งมาตรการไฮดรอกซิล peroxyl และกิจกรรม ROS อื่น ๆ ภายในเซลล์ HCECs ถูกปลูกบนแผ่น 96 ดีหรือภาพนิ่ง 8 หอเมื่อมาถึงบรรจบ เซลล์ถูกล้างสองครั้งกับ buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ (PBS)แล้ว incubated กับ μM 25 DCFDA ในกลางสำคัญ 10% FBS ใน incubator ที่ 37° Cสำหรับ 45 นาที หลังจาก PBS ล้างสอง เซลล์ได้สัมผัสกับสื่อ hyperosmotic (350, 400 หรือ450 mOsM) โดยเพิ่ม NaCl (19, 44 หรือ 69 มม. ตามลำดับ) สำหรับรอบระยะเวลาต่าง ๆ (30 – 180นาที) ภาพเซลล์ที่ถ่ายภายใต้กล้องจุลทรรศน์ฟลูออเรส เซลล์ fluorescence ในดี 96 แผ่นมีวัดที่ 488 nm ในการกระตุ้นและปล่อยก๊าซ 525 nm ใช้ Tecan อนันต์ M200 Multimodeอ่าน Microplate (สหรัฐอเมริกา inc. Tecan Morrisville, NC) หลังเพิ่ม NaCl สำหรับ 15 – 120 นาทีการเปลี่ยนแปลงสัมพัทธ์ของ DCF fluorescence ถูกแสดงเป็นพับเพิ่มผ่านเซลล์ที่ไม่ถูกรักษา
การแปล กรุณารอสักครู่..