n vitro comet assay with HepG2 cell

n vitro comet assay with HepG2 cell line
Modified version of the alkaline protocol described by Uhl et al.13 was performed with drinking water samples. Human hepatoma cell line (HepG2 cells) was obtained from prof. dr. Knasmueller, Institute of Cancer Research of The Univeristy of Vienna. Cells were grown in multilayer culture at 37 °C in humified atmosphere of 5% CO2 in Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) supplemented with 10% foetal calf serum (FCS) and antibiotic (0.1% gentamycin) in well plates for 7 days (cell density: 106–108 cells/mL). Medium was changed every 2 days. Seven days old cells were exposed to water samples, negative and positive controls (500 μM hydrogen peroxide) for 20 min and afterwards cell suspensions were prepared with 0.25% trypsin-EDTA solution, passed through injection needle for several times to achieve single cell suspension and finally resuspended in DMEM medium, supplemented with 10% FCS medium. The dye-exclusion test with Trypan blue was used to examine the viability of cells before the comet assay was performed.27
Rough microscope slides were used for the comet assay, they were first coated with up to 400 µL of 1% normal melting point agarose (NMP) the day before the test and left to air dry overnight. The supportive (second) agarose layer (0.6% NMP agarose) was solidified on ice and the collected HepG2 cells were immobilized in the third layer. Approximately 2×104 cells were mixed with 0.7% low melting point agarose (LMP) and spread over the slides as the third layer. After removing the cover glasses, the slides were covered with 500 µL of 0.5% LMP agarose (the fourth layer) to prevent nuclear DNA escaping during cell lysis and electrophoresis. One-hour incubation in alkaline lysis buffer followed. The slides were submerged in electrophoretic buffer (pH >13) to unwind the nuclear DNA for 1hr and then subjected to electrophoresis in the same buffer. The electrophoresis was carried out at 2V/cm and 300 mA; for 30 min. Following electrophoresis the gels were neutralized in 400 mM Tris-HCl pH 7.5 for 15 min. The damaged DNA traveled toward the anode during electrophoresis and formed an image of a “comet” tail. After staining the slides with ethidium bromide (20 µg/mL) the comets were detected and quantified as described below.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิเคราะห์ดาวหางเครื่อง n บรรทัดเซลล์ HepG2แก้ไขเวอร์ชันของโพรโทคอด่างโดย Uhl et al.13 ทำกับตัวอย่างน้ำดื่ม บรรทัด hepatoma มนุษย์เซลล์ (เซลล์ HepG2) ได้รับจากรศ.ดร. Knasmueller สถาบันมะเร็งวิจัย Univeristy เวียนนา เซลล์ที่โตในวัฒนธรรมหลายชั้นที่ 37 ° C ในบรรยากาศ humified 5% CO2 ใน Eagle ของดุลเบกโก Modified กลาง (DMEM) เสริม ด้วยเซรั่ม foetal ลูก 10% (FCS) และยาปฏิชีวนะ (0.1% gentamycin) ในแผ่นทั้ง 7 วัน (ความหนาแน่นของเซลล์: 106 – 108 เซลล์/มล.) สื่อมีการเปลี่ยนแปลงทุก 2 วัน อายุ 7 วันเซลล์ที่สัมผัสกับน้ำตัวอย่าง ลบ และบวกมีเตรียมการควบคุม (500 μM ไฮโดรเจนเพอร์ออกไซด์) 20 นาที และหลังจากนั้นเซลล์บริการกับทริปซิน 0.25%-EDTA โซลูชัน ผ่านเข็มฉีดยาหลายครั้งเพื่อให้ระงับเซลล์เดี่ยวและ finally resuspended ใน DMEM เสริม ด้วย 10% ปานกลาง FCS ทดสอบการแยกสี Trypan blue ถูกใช้เพื่อตรวจสอบศักยภาพของเซลล์ก่อนวิเคราะห์ดาวหางถูก performed.27ภาพนิ่งกล้องจุลทรรศน์หยาบใช้สำหรับวิเคราะห์ดาวหาง พวกเขาถูกเคลือบ ด้วย µL ถึง 400 ของจุดหลอมเหลวปกติ 1% agarose (NMP) วันก่อนการทดสอบ และจากอากาศแห้งข้ามคืน สนับสนุน (ชั้นที่สอง) agarose (agarose NMP 0.6%) ถูกหล่อน้ำแข็งและ HepG2 รวบรวมเซลล์ที่ถูกตรึงในชั้นที่สาม ประมาณ 2 × 104 เซลล์ถูกผสมกับ 0.7% agarose จุดหลอมเหลว (LMP) ต่ำ และนิ่งแผ่เป็นชั้นสาม หลังจากเอาแก้วครอบ ภาพนิ่งถูกปกคลุม ด้วย µL 500 ของ 0.5% LMP agarose (ชั้นสี่) เพื่อป้องกันนิวเคลียร์ดีเอ็นเอหลบหนีระหว่างเซลล์ lysis electrophoresis คณะทันตแพทยศาสตร์ 1 ชั่วโมงในบัฟเฟอร์ lysis ด่างตาม ภาพนิ่งที่มีน้ำท่วมในบัฟเฟอร์ด้วย (pH > 13) เหนื่อย DNA นิวเคลียร์ 1 ชั่วโมง และอยู่ภายใต้การ electrophoresis ในบัฟเฟอร์เดียวกัน การ electrophoresis ทำออกที่ 2V/ซม. และ 300 mA สำหรับ 30 นาที ต่อ electrophoresis เจถูก neutralized 400 มม.ทริสเรทติ้ง HCl pH 7.5 สำหรับ 15 นาที ดีเอ็นเอที่เสียหายได้เดินทางไปยังขั้วบวกระหว่าง electrophoresis และรูปภาพของหาง "ดาวหาง" หลังจากการย้อมสีภาพนิ่งกับโบรไมด์ ethidium (20 ไมโครกรัมเป็นเครื่อง/มล) ดาวหางถูกตรวจพบ และ quantified ตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

n ภายนอกร่างกายดาวหางทดสอบกับเซลล์ HepG2
รุ่นดัดแปลงโปรโตคอลด่างอธิบายโดย Uhl et al.13 ได้ดำเนินการกับตัวอย่างน้ำดื่ม มนุษย์สายพันธุ์ของเซลล์ตับ (เซลล์ HepG2) ที่ได้รับจากศ ดร Knasmueller สถาบันการวิจัยโรคมะเร็งของมหาวิทยาลัยเวียนนา เซลล์ที่ถูกปลูกในวัฒนธรรมหลายที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในบรรยากาศเอ็ดสาย Humi 5% CO2 ใน Dulbecco ของ Modi สายเอ็ดกลางของนกอินทรี (DMEM) เสริมด้วย 10% ซีรั่มน่องทารกในครรภ์ (FCS) และยาปฏิชีวนะ (0.1% Gentamycin) ในแผ่นเดียวเป็นเวลา 7 วัน (มือถือ ความหนาแน่น: 106-108 เซลล์ / มิลลิลิตร) ก็เปลี่ยนขนาดกลางทุก 2 วัน เจ็ดวันเซลล์เก่าได้สัมผัสกับตัวอย่างน้ำควบคุมเชิงลบและบวก (500 ไมครอนไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์) เป็นเวลา 20 นาทีและหลังจากนั้นเซลล์แขวนลอยได้จัดทำกับการแก้ปัญหา trypsin-EDTA 0.25% ผ่านเข็มฉีดยาสำหรับหลาย ๆ ครั้งเพื่อให้บรรลุการระงับเซลล์เดียวและ สาย Nally resuspended ในสื่อ DMEM เสริมด้วย 10% FCS กลาง การทดสอบสียกเว้นสีฟ้ากับ Trypan ถูกใช้ในการตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์ก่อนที่จะทดสอบดาวหางเป็น performed.27
สไลด์กล้องจุลทรรศน์หยาบที่ใช้ในการทดสอบดาวหางพวกเขาถูกเคลือบแรกที่มีถึง 400 ไมโครลิตร 1% จุดหลอมเหลวปกติ agarose (NMP) วันก่อนการทดสอบและจากซ้ายไปค้างคืนอากาศแห้ง สนับสนุน (ที่สอง) ชั้น agarose (0.6% agarose NMP) ได้รับการเสริมความมั่นคงบนน้ำแข็งและเก็บรวบรวมเซลล์ HepG2 ถูกตรึงอยู่ในชั้นที่สาม ประมาณ 2 × 104 เซลล์ได้รับการผสมกับ 0.7% จุดหลอมเหลวต่ำ agarose (LMP) และแผ่กระจายไปทั่วภาพนิ่งเป็นชั้นที่สาม หลังจากถอดแว่นตาปกภาพนิ่งถูกปกคลุมไปด้วย 500 ไมโครลิตร 0.5% agarose LMP (ชั้นที่สี่) เพื่อป้องกันนิวเคลียร์ดีเอ็นเอหลบหนีในระหว่างการสลายของเซลล์และอิเล็ก การบ่มหนึ่งชั่วโมงในบัฟเฟอร์สลายตามอัลคาไลน์ สไลด์จมอยู่ใต้น้ำในบัฟเฟอร์อิเลค (pH> 13) ที่จะผ่อนคลายดีเอ็นเอนิวเคลียร์ 1 ชั่วโมงและจากนั้นภายใต้อิเล็กในบัฟเฟอร์เดียวกัน ข่าวคราวที่ได้รับการดำเนินการที่ 2V / ซม. และ 300 มิลลิแอมป์; เป็นเวลา 30 นาที ต่อไปนี้ electrophoresis เจลถูกเป็นกลางใน 400 มิลลิ Tris-HCl pH 7.5 สำหรับ 15 นาที ดีเอ็นเอเสียหายเดินทางไปยังขั้วบวกระหว่างอิเล็กและเกิดภาพของ "ดาวหาง" หาง หลังจากการย้อมสีสไลด์ด้วย ethidium bromide (20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) ดาวหางที่ถูกตรวจพบและปริมาณตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

n การดาวหางวิเคราะห์กับเซลล์มะเร็งตับ
แก้ไขรุ่นของโพรโทคอลที่อธิบายโดยอัล et al.13 ด่างได้ด้วยการดื่มน้ำ . เซลล์ตับมนุษย์เซลล์มะเร็งตับ ) ได้จาก ศ. ดร. knasmueller , สถาบันการวิจัยโรคมะเร็งของมหาวิทยาลัยเวียนนาเซลล์เติบโตในวัฒนธรรมที่ 37 ° C ในฮิวมี่หลายชั้นจึงเอ็ดบรรยากาศคาร์บอนไดออกไซด์ 5% ในดัลเบโค่ของโมไดจึงเอ็ดนกอินทรีขนาดกลาง ( dmem ) เสริมด้วย 10% เซรั่ม foetal น่อง ( FCS ) และสารปฏิชีวนะ ( 0.1% Gentamycin ) ในแผ่นสำหรับ 7 วัน ( ความหนาแน่นเซลล์ : 106 - 108 เซลล์ / มิลลิลิตร ) ขนาดเปลี่ยนทุก 2 วัน เซลล์เก่าเจ็ดวันเปิดรับตัวอย่างน้ำควบคุมบวกและลบ ( 500 μ M ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ ) นาน 20 นาที และหลังจากนั้นเซลล์แขวนลอยถูกเตรียม 0.25% ตามลำดับเอนไซม์โซลูชั่นผ่านเข็มฉีดหลายๆ ครั้ง เพื่อให้ช่วงล่างเซลล์เดียวและจึงแนลลี่ resuspended ใน dmem medium เสริมด้วย 10% FCS )ย้อมไปทดสอบกับไตรแพนสีฟ้าถูกใช้เพื่อตรวจสอบความมีชีวิตของเซลล์ก่อนดาวหางวิเคราะห์ประเมินผล 27
หยาบกล้องจุลทรรศน์ภาพนิ่งที่ใช้เป็นดาวหางโดยพวกเขาครั้งแรกที่เคลือบได้ถึง 400 µลิตร 1 % ปกติจุดหลอมเหลว ( ( nmp ) ก่อนวันทดสอบและปล่อยให้อากาศแห้ง เพียงชั่วข้ามคืน สนับสนุน ( 2 ) ชั้น 36 ( 06 % nmp ( ) คือก้อนน้ำแข็งและเก็บเซลล์มะเร็งตับถูกตรึงในชั้นสาม ประมาณ 2 × 104 เซลล์ผสม 0.7% จุดหลอมเหลวต่ําเดี่ยว ( lmp ) และการแพร่กระจายมากกว่าภาพนิ่งเป็นชั้นที่สาม หลังจากถอดฝาแก้ว , ภาพนิ่งที่ถูกปกคลุมด้วย 500 µ l 05% lmp โรส ( ชั้น 4 ) เพื่อป้องกันการหลบหนีในระหว่างการสลายนิวเคลียสของเซลล์และเรส การบ่มหนึ่งชั่วโมงในการสลายบัฟเฟอร์ด่างคือ ภาพนิ่งถูกแช่ในการตรวจวัดบัฟเฟอร์ pH > 13 ) ผ่อนคลายดีเอ็นเอนิวเคลียร์ 1hr แล้วภายใต้ electrophoresis ในบัฟเฟอร์เดียวกัน ส่วนวิธีดำเนินการ ที่ 80 / ซม. มา 300 ; เป็นเวลา 30 นาทีต่อไปนี้วิธีเจลอยู่เป็นกลางในบริษัท 400 มม. กรดไฮโดรคลอริก pH 7.5 และ 15 นาทีเดินทางไปยังแอโนดดีเอ็นเอที่เสียหายในวิธีขึ้นรูปของ " ดาวหาง " หาง หลังจากการย้อมสไลด์กับทิเดียมโบรไมด์ ( 20 µ g / ml ) ดาวหางถูกตรวจพบและปริมาณตามที่อธิบายไว้ด้านล่าง