ResultsA tandem FYVE construct reco

Results
A tandem FYVE construct recognizes plant
endosomes
In both yeast and mammals, the phosphoinositide
PI(3)P accumulates preferentially in endosomal membranes (Gillooly et al., 2000), and binding of FYVEdomain proteins to PI(3)P is sufficient to target
endosomal proteins to these subcellular compartments.
ForA. thalianait is known that the classical FYVE
domain binds specifically to PI(3)P in vitro (Jensen et
al., 2001). Therefore, we were interested to know if the
tandem FYVE domain would be sufficient for targeting
to endocytic compartments in plants. To this end, the
FYVE domain from the mouse Hrs protein was
tandemly fused (Gillooly et al., 2000) to the C-terminus
of GFP or DsRedT4, respectively. Particle bombardment was employed to transiently express the fusion
proteins (GFP-FYVE; DsRed-FYVE) in onion epidermal bulb scale cells. Confocal imaging revealed fluorescently labeled motile organelles, which were positive also
for the endosome-specific plant Rab GTPases Ara6 and
RabF2a, when pDsRed-FYVE and Ara6-GFP or YFPRabF2a were transiently coexpressed. In the case of
Ara6 and FYVE, the merged images showed a colocalization between the two fusion proteins in small
and punctate, motile organelles (Fig. 1, yellow arrowheads in c), but not in larger static organelles, which
were binding the GFP-FYVE reporter exclusively
(Fig. 1c, red arrowheads). Coexpression of pDsRedFYVE and pYFP-RabF2a also showed complete colocalization within small motile organelles (Fig. 1d–f;
see also Movie 1; all 24 movies are part of the
supplementary material).
Previously, Ara6-labeled compartments have been
shown to accumulate newly endocytosed FM4-64 (Ueda
et al., 2001). To determine, whether FYVE-labeled
compartments have endosomal identity, we performed
double labeling by treating the stably transformed
M. truncatulaexpressing GFP-FYVE with the red fluorescent styryl dye FM4-64. This endocytic tracer binds
to the plasma membrane and becomes rapidly incorporated into the cell through bulk-flow endocytosis (Ueda
et al., 2001). Upon the exposure of root hairs to FM4-64
for 5 min, a fluorescent signal was observed on all
FYVE-labeled endosomes (Fig. 1g–i; Movie 2). The
GFP-FYVE-labeled endosomes were located in the

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลลัพธ์เที่ยว FYVE สร้างรู้จักพืชendosomesในยีสต์และเลี้ยงลูกด้วยนม phosphoinositidePI (3) P สะสมโน้ตเข้า endosomal (Gillooly และ al., 2000), และผูกของวิลเลียม FYVEdomain PI (3) P เพียงพอที่จะกำหนดเป้าหมายวิลเลียม endosomal ช่องเหล่านี้ subcellularForA thalianait เป็นที่รู้จักกันที่ FYVE คลาสสิกโดเมน binds กับ PI (3) P การเพาะเลี้ยงโดยเฉพาะ (เจนร้อยเอ็ดal., 2001) ดังนั้น เราก็สนใจที่จะทราบว่าการโด FYVE ตัวตามกันไปจะเพียงพอสำหรับการกำหนดเป้าหมายช่อง endocytic ไปในพืช เพื่อการนี้ การมีโดเมน FYVE จากเมาส์โปรตีนน.fused (Gillooly et al., 2000) กับ C-นัส tandemlyGFP หรือ DsRedT4 ตามลำดับ การระดมยิงอนุภาคถูกจ้าง transiently แสดงการฟิวชั่นโปรตีน (GFP-FYVE DsRed-FYVE) ในเซลล์ขนาดหลอด epidermal หอม Organelles motile ซึ่งได้บวกยังติดป้ายภาพ confocal เปิดเผย fluorescentlyสำหรับเอนโดโซมพืช Rab GTPases Ara6 และRabF2a เมื่อ pDsRed FYVE และ Ara6 GFP หรือ YFPRabF2a ได้ transiently coexpressed ในกรณีของAra6 และ FYVE, colocalization ระหว่างโปรตีนสองฟิวชั่นในขนาดเล็กแสดงให้เห็นภาพรวมและ punctate, motile organelles (Fig. 1 หัวลูกศรสีเหลืองใน c), แต่ organelles ใหญ่คงไม่ได้อยู่ใน ที่ถูกผูกโปรแกรมรายงาน GFP FYVE โดยเฉพาะ(Fig. 1c แดงหัวลูกศร) Coexpression pDsRedFYVE และ pYFP-RabF2a ยังพบ colocalization เสร็จสมบูรณ์ภายในเล็ก organelles motile (Fig. 1d-fดูภาพยนตร์ 1 ภาพยนตร์ทั้งหมด 24 เป็นส่วนหนึ่งของการเสริมวัสดุ)ก่อนหน้านี้ Ara6 ชื่อช่องได้แสดงการสะสมใหม่ endocytosed FM4-64 (ดะและ al., 2001) การตรวจสอบ ว่าชื่อ FYVEช่องที่มีรหัสประจำตัว endosomal เราทำติดฉลากคู่ โดยรักษาแปร stablyม. truncatulaexpressing GFP FYVE กับย้อมฟลูออเรส styryl แดง FM4 64 ติดตามนี้ endocytic bindsการพลาสมาเมมเบรน และจะรวมอยู่ในเซลล์ผ่านขั้นตอนจำนวนมาก endocytosis (ดะอย่างรวดเร็วและ al., 2001) เมื่อความเสี่ยงของเส้นขนราก FM4 64สำหรับ 5 นาที สัญญาณฟลูออเรสถูกสังเกตในทั้งหมดชื่อ FYVE endosomes (Fig. 1g-i ภาพยนตร์ 2) ที่GFP FYVE มีป้ายชื่อว่า endosomes มีอยู่ในตัว

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผลการ fyve สร้างรู้จักพืชควบคู่ทั้งใน endosomes

ยีสต์และสัตว์เลี้ยงลูกด้วยนม , phosphoinositide
pi ( 3 ) P ที่สะสมใน endosomal preferentially เมมเบรน ( gillooly et al . , 2000 ) และการจับของโปรตีน fyvedomain กับพาย ( 3 ) P เป็นเพียงพอที่จะให้ช่อง endosomal ตําแหน่งภายในเซลล์โปรตีนเป้าหมาย

ไทยเหล่านี้ . thalianait เป็นที่รู้จักกันว่า
fyve คลาสสิกโดเมนก็เฉพาะเพื่อพาย ( 3 ) P ในหลอดทดลอง ( เจนเซ่น et
al . , 2001 ) ดังนั้นเราจึงมีความสนใจที่จะทราบว่าถ้า
ควบคู่ fyve โดเมนจะเพียงพอสำหรับเป้าหมาย
เพื่อ endocytic ช่องในพืช จุดนี้
fyve โดเมนจากชั่วโมงเมาส์โปรตีน
tandemly ผสม ( gillooly et al . , 2000 ) เพื่อ c-terminus
ของ GFP หรือ dsredt4 ตามลำดับเครื่องยิงโดยบุคคลหรือสิ่งที่อยู่ชั่วคราวด่วนฟิวชั่น
โปรตีน ( gfp-fyve ; dsred fyve ) ต้นหอม epidermal หลอดไฟขนาดเซลล์ การถ่ายภาพด้วย fluorescently ป้ายเคลื่อนที่พบออร์แกเนลล์ซึ่งเป็นบวกยัง
สำหรับโครโมโซมเฉพาะโรงงานรับ gtpases ara6 และ
rabf2a เมื่อ pdsred fyve ara6 GFP และหรือ yfprabf2a เป็นบุคคลหรือสิ่งที่อยู่ชั่วคราว coexpressed . ในกรณีของ
ara6 fyve และ ,รวมภาพแสดง colocalization ระหว่างสองผสมโปรตีนในเล็ก ๆและอวัยวะ punctate
, มือถือ ( รูปที่ 1 , หัวลูกศรสีเหลืองใน C ) , แต่ไม่ใช่ในแบบของขนาดใหญ่ที่ถูกผูก gfp-fyve นักข่าวโดยเฉพาะ

( ภาพที่ 1c หัวลูกศร , สีแดง ) coexpression ของ pdsredfyve pyfp-rabf2a และยังพบ colocalization เสร็จภายในอวัยวะเคลื่อนที่ขนาดเล็ก ( ภาพ 1D - F ;
ดูหนัง 1 ; ทั้งหมด 24 ภาพยนตร์เป็นส่วนหนึ่งของวัสดุเสริม )
.
ก่อนหน้านี้ ara6 ติดป้ายช่องได้รับ
แสดงสะสมใหม่ endocytosed fm4-64 ( อุเอดะ
et al . , 2001 ) เพื่อตรวจสอบว่า fyve ป้าย
ช่องมีตัวตน endosomal เราปฏิบัติ
คู่ฉลากโดยการเปลี่ยน
เสถียรม.truncatulaexpressing gfp-fyve กับสีแดงเรืองแสง styryl ย้อม fm4-64 . ติดตาม endocytic นี้ผูก
กับเยื่อหุ้มเซลล์ และกลายเป็นที่จัดตั้งขึ้นอย่างรวดเร็วในเซลล์ผ่านการไหลของกลุ่มเอนโดไซโทซิส ( อุเอดะ
et al . , 2001 ) เมื่อแสงของรากขน เพื่อ fm4-64
5 นาที สัญญาณฟลูออเรสเซนต์ พบทั้งหมด
fyve ป้าย endosomes ( รูปที่ 1 ) I ; ภาพยนตร์ 2 )
fyve GFP ที่มีข้อความอยู่ใน endosomes