High Performance Liquid Chromatogra

High Performance Liquid Chromatography (HPLC) Analysis.
The HPLC analysis (Hitachi L-6200 intelligent pump equipped with a
photodiode array detector Hitachi L-7455; Hitachi, Tokyo, Japan) used
a Mightysil RP-18 column (250  4.6 mm, 5 μm) (Kanto Chemical Co.,
Tokyo, Japan). The HPLC assay for the quantitative determination of
ursolic acid and oleanolic acid inMEOA, EEOA andWEOA was carried
out as described by Chen et al. (20). Elution was performed at room
temperature and utilized acetonitrile as solvent A and 1.25% H3PO4 in
water as solvent B. The mobile phase, consisting of solvent A and B in the
proportions 86:14 v/v, was used for elution. The flow rate was 0.5mL/min.
The sample and the standards were injected at a volume of 20 μL each.
Ursolic acid and oleanolic acid were identified by comparison of their
retention time (tR) values and UV-visible spectra with those of known
standards and were quantified by peak areas from the chromatograms.
Cell Culture. RAW 264.7 cell line (BCRC 60001) was obtained from
the Bioresource Collection and Research Center (BCRC, Food Industry
Research and Development Institute, Hsinchu, Taiwan). Cells were
cultured in DMEM with 10% FBS, 2 mM L-glutamine and 100 U/mL
penicillin-streptomycin. The cells were cultured at 37
C in a humidified
5% CO2 incubator.
Cell Viability Assay. AnMTT assay was performed according to the
method of Mosmann (21). RAW 264.7 cells were plated into 96-well
microtiter plates at a density of 1  104 cells/well. After 24 h, the culture
medium was replaced with 200 μL serial dilutions of extracts or its active
compounds followed by a 24 h incubation. The final concentration of
solventwas less than 0.1%in the cell culturemedium.Culturemediumwas
removed and replaced by 90 μL of fresh culture medium. Then, 10 μL of
sterile filteredMTTsolution (5mg/mL) in phosphate buffered saline (PBS,
pH=7.4) was added to eachwell, reaching a final concentration of 0.5 mg
ofMTT/mL. After 5 h, the unreacted dye was removed, and the insoluble
formazan crystals were dissolved in 200 μL/well of DMSO and measured
by a FLUOstar galaxy spectrophotometer(BMGLabtechnologies,Offenburg,
Germany) at 570 nm. The relative cell viability (presented as a
percent) relative to control wells containing cell culture medium without
samples was calculated using A570nm(sample)/A570nm(control)  100.
Measurement of Nitric Oxide/Nitrite. Nitrite levels in the cultured
media, which reflect NOS activity, were determined by Griess reaction.
The cells were incubated with either the extracts or its active compounds in
the presence or absence of LPS (1 μg/mL) for 24 h. Briefly, cells were
dispensed into 96-well plates and 100 μL of each supernatant was mixed
with the same volume of Griess reagent (1% sulfanilamide, 0.1%
naphthylethylenediamine dihydrochloride and 5% phosphoric acid) and
incubated at room temperature for 10 min. Sodium nitrite was used to
generate a standard curve (22), and the concentration of nitrite was
measured by optical density reading at 550 nm.
Measurement of Prostaglandin E2 (PGE2). Cells were incubated
with EEOA in the presence or absence of LPS (1 μg/mL) for 24 h. PGE2
level was determined using the prostaglandin E2 express EIA kit (Cayman
Chemical Company, Ann Arbor, MI). The concentration of PGE2 was
2152 J. Agric. Food Chem., Vol. 58, No. 4, 2010 Hsu et al.
photometrically determined using a microplate reader (Awareness Technology,
Palm City, FL) at 405 nm.
Determination of Intracellular Reactive Oxygen Species (ROS)
Production. The intracellular ROS production was measured using the
oxidant-sensitive fluorescent probe, DCFH-DA. DCFH converted from
DCFH-DA by deacetylase within the cells is oxidized by a variety of
intracellular ROS to DCF, a highly fluorescent compound. The cells were
incubated with EEOAin the presence or absence of LPS (1 μg/mL) for 4 h.
The cells were harvested by trypsin-EDTA solution (0.05% trypsin and
0.02%EDTA in PBS) and washed twice with PBS. The cells were stained
with 20 μMof DCFH-DA for 15 min at room temperature and subjected
to determination of intracellular ROS production using a FACScan flow
cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA).
Approximately 1  104 counts were made for each sample. The ROS
production (expressed as a percent) was calculated by CELL Quest
software.
Western Blot Analysis. The cells were incubated with EEOA and
ursolic acid in the presence or absence of LPS (1 μg/mL) for 12 h. After
stimulation, cells were collected and lysed in ice-cold lysis buffer [20 mM
Tris-HCl (pH 7.4), 2 mM EDTA, 500 μM sodium orthovanadate, 1%
Triton X-100, 0.1% SDS, 10 mM NaF, 10 μg/mL leupeptin and 1 mM
PMSF]. The protein concentration of the cell lysate was estimated by the
Bio-Rad DC protein assay (Bio-Rad Laboratories, Hercules, CA) using
bovine serum albumin as the standard. Total proteins (50-60 μg) were
separated by sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
(SDS-PAGE) using a 12% polyacrylamide gel and transferred to a
PVDF membrane. The membrane was blocked with 5% skim milk in
PBST (0.05% v/v Tween-20 in PBS, pH 7.2) for 1 h. Membranes were
incubated with primary antibody (1:5000) at 4
C overnight and then with
secondary antibody (1:5000) for 1 h.Membranes were washed three times
in PBST for 10 min each. The signal was detected using the Amersham
ECL system (Amersham-Pharmacia Biotech, Arlington Heights, IL).
Relative protein expression was quantified by densitometry using the
LabWorks 4.5 software and calculated relative to the β-actin reference
band.
RNAExtraction and Real-Time RT-PCR. Real-timeRT-PCRwas
performed to determine the level of RAW 264.7 macrophage gene
expression. Total RNA from RAW 264.7 cells was isolated using the
TRIzol RNA isolation kit (Life Technologies, Rockville, MD) following
the manufacturer’s protocol. cDNA was synthesized from total RNA
(200 ng) by reverse transcription PCRusing a high-capacity cDNAreverse
transcription kit (Applied Biosystems, Foster City, CA) according to
the manufacturer’s protocol. The following primer pairs were used:
iNOS (Accession No. NM010927), 50-TCCTACACCACACCAAAC-
30 (forward) and 50-CTCCAATCTCTGCCTATCC-30 (reverse); COX-
2 (Accession No. NM011198), 50-CCTCTGCGATGCTCTTCC-30
(forward) and 50-TCACACTTATACTGGTCAAATCC-30 (reverse);
GAPDH (Accession No. NM008084), 50-TCAACGGCACAGTCAAGG-
30 (forward) and 50-ACTCCACGACATACTCAGC-30
(reverse). Relative real-time RT-PCR for detection of gene expression
levels was carried out using anABI 7300 real-time PCR system (Applied
Biosystems, Foster City, CA). The reaction mixture (total volume
25 μL) contained 1 power SYBR green PCR master mix, 300 nM
forward primer, 300 nMreverse primer, cDNAand DEPC-H2O, as well
as, commercial reagents (Applied Biosystems, Foster City, CA). The
thermal profile was established according to the manufacturer’s protocol.
Briefly, this profile was 95
C for 10 min for enzyme activation,
followed by denaturing at 95
C for 15 s, and annealing and elongation
at 60
C for 1 min, for a total of 40 cycles. Relative levels of gene
expression were quantified using the ΔΔCt method which results in a
ratio of target gene expression to equally expressed housekeeping genes.
Statistical Analysis. Each experiment was performed in triplicate.
The results are expressed as mean ( standard deviation (SD). Statistical
analysis was performed using SAS software. Analysis of variance was
performed using ANOVA procedures. Significant differences (p

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การวิเคราะห์สภาพคล่อง Chromatography (HPLC) ประสิทธิภาพสูงวิเคราะห์ HPLC (ฮิตาชิ L-6200 ปั๊มอัจฉริยะที่เพียบพร้อมไปด้วยการจับเรย์ photodiode ฮิตาชิ L-7455 ใช้ฮิตาชิ โตเกียว ญี่ปุ่น)คอลัมน์ Mightysil RP-18 (250 4.6 มม. 5 μm) (คันเคมี จำกัดโตเกียว ญี่ปุ่น) วิเคราะห์ HPLC สำหรับกำหนดการเชิงปริมาณทำ ursolic กรดและ oleanolic กรด inMEOA, EEOA andWEOAออกตามที่อธิบายไว้โดย Chen et al. (20) Elution ทำห้องอุณหภูมิและการใช้งาน acetonitrile เป็นตัวทำละลาย A และ 1.25% H3PO4 ในน้ำบีเป็นตัวทำละลาย เฟสเคลื่อนที่ ประกอบด้วยตัวทำละลาย A และ B ในการสัดส่วน 86:14 v/v ใช้สำหรับ elution 0.5 mL/min อัตราการไหลได้ตัวอย่างและมาตรฐานได้ฉีดในปริมาณของ 20 μLระบุ Ursolic กรดและกรด oleanolic โดยเปรียบเทียบของพวกเขาค่ารักษาเวลา (tR) และ UV เห็นแรมสเป็คตรากับรู้จักมาตรฐาน และถูก quantified โดยพื้นที่สูงสุดจาก chromatogramsการเพาะเลี้ยงเซลล์ RAW 264.7 เซลล์บรรทัด (BCRC 60001) ได้รับจากคอลเลกชัน Bioresource และศูนย์วิจัย (BCRC อุตสาหกรรมอาหารสถาบันวิจัยและพัฒนา ซิงจู้ ไต้หวัน) เซลล์ได้อ่างใน DMEM 10% FBS, 2 มม. L glutamine และ 100 U/mLยาเพนนิซิลลิน-streptomycin เซลล์มีอ่างที่ 37 C ในตัว humidified5% CO2 incubatorเซลล์นี้วิเคราะห์ AnMTT วิเคราะห์ได้ดำเนินการตามวิธีการ Mosmann (21) เซลล์ RAW 264.7 ถูกชุบเป็น 96-ดีmicrotiter แผ่นที่ความหนาแน่นของเซลล์ดี 1 104 หลังจาก 24 ชม วัฒนธรรมกลางถูกแทนที่ ด้วย 200 μL dilutions ประจำบางส่วนหรือการใช้งานสารประกอบตามบ่ม 24 ชม ความเข้มข้นสุดท้ายของsolventwas น้อยกว่า 0.1%in culturemedium เซลล์ Culturemediumwasเอาออก และแทนที่ ด้วย μL 90 ของสื่อวัฒนธรรมสด แล้ว μL 10 ของfilteredMTTsolution กระบอก (5mg/mL) ในน้ำเกลือฟอสเฟต buffered (PBSpH = 7.4) ถูกเพิ่มเข้าไป eachwell เข้าถึงสมาธิขั้นสุดท้ายของ 0.5 มิลลิกรัมofMTT/mL หลังจาก 5 h ย้อม unreacted ถูกลบออก และไม่ละลายformazan ผลึกละลายใน μL 200 ดีของ DMSO และวัดโดย FLUOstar กาแล็กซี่เครื่องทดสอบกรดด่าง (BMGLabtechnologies, Offenburgประเทศเยอรมนี) ที่ 570 nm ชีวิตเซลล์แบบสัมพัทธ์ (นำเสนอเป็นการญาติร้อยละ) การควบคุมบ่อสื่อวัฒนธรรมเซลล์มีไม่มีตัวอย่างที่คำนวณโดยใช้ A570nm(sample)/A570nm(control) 100วัดไนตริกออกไซด์/ไนไตรต์ ไนไตรต์ระดับที่อ่างสื่อ ซึ่งสะท้อนถึงกิจกรรมชุดหมายเลข ถูกกำหนด โดยปฏิกิริยา Griessเซลล์ถูก incubated กับสารสกัดหรือสารใช้งานอยู่สถานะการขาดงานของ LPS (1 μg/mL) ใน 24 h. สั้น ๆ เซลล์ได้คำดี 96 แผ่นและ 100 μL ของ supernatant ละถูกผสมมีไดรฟ์ข้อมูลเดียวกันของรีเอเจนต์ Griess (1% ซัลฟานิลาไมด์ 0.1%naphthylethylenediamine dihydrochloride และ 5% กรดฟอสฟอริก) และincubated ที่อุณหภูมิห้อง 10 นาทีโซเดียมไนไตรต์ที่ใช้สำหรับสร้างเส้นโค้งมาตรฐาน (22), และมีความเข้มข้นของไนไตรต์วัด โดยความหนาแน่นออปติคอลอ่านที่ 550 nmวัด Prostaglandin E2 (PGE2) เซลล์ถูก incubatedมี EEOA ในสถานะการขาดงานของ LPS (1 μg/mL) ใน 24 h. PGE2กำหนดระดับการใช้ prostaglandin E2 ด่วน EIA ชุด (เคย์สารเคมีบริษัท Ann Arbor, MI) มีความเข้มข้นของ PGE22152 J. Agric. อาหาร Chem., 58 ปี หมายเลข 4, 2010 ซู et alphotometrically กำหนดใช้อ่าน microplate (ความรู้เทคโนโลยีปาล์มซิตี้ FL) ที่ 405 nmกำหนดพันธุ์ Intracellular ปฏิกิริยาออกซิเจน (ROS)การผลิต การผลิต ROS intracellular ถูกวัดโดยใช้การอนุมูลอิสระสำคัญโพรบเรืองแสง DCFH-DA. แปลงจาก DCFHDCFH-ดา โดย deacetylase ภายในเซลล์ถูกออกซิไดซ์ โดยหลากหลายROS intracellular เพื่อ DCF สารประกอบเรืองแสงสูง เซลล์ได้incubated กับ EEOAin หรือ LPS (1 μg/mL) สำหรับ 4 hเซลล์เก็บเกี่ยวจากโซลูชัน EDTA ทริปซิน (ทริปซิน 0.05% และ0.02%EDTA ใน PBS) และล้าง ด้วย PBS ครั้ง เซลล์มีสีมี μMof 20 DCFH-ดาใน 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องและเมื่อต้องการกำหนดการผลิต ROS intracellular ใช้กระแส FACScancytometer (ระบบ Immunocytometry สัน Becton, San Jose, CA)จำนวนประมาณ 1 104 มีไว้สำหรับแต่ละตัวอย่าง การ ROSคำนวณ โดยหาเซลล์ผลิต (แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์)ซอฟต์แวร์การวิเคราะห์คืนในตาตะวันตก เซลล์มี incubated กับ EEOA และกรด ursolic ในสถานะการขาดงานของ LPS (1 μg/mL) ใน h. 12 หลังกระตุ้น เซลล์ถูกรวบรวม และ lysed ในบัฟเฟอร์ lysis ฉ่ำ [20 มม.ตรี-HCl (pH 7.4), 2 mM EDTA โซเดียม 500 μM orthovanadate, 1%ไตรตั้น X 100, 0.1% SDS, NaF 10 มม. 10 leupeptin μg/mL และ 1 มม.PMSF] ความเข้มข้นของโปรตีนของเซลล์ lysate ถูกประเมินโดยการโดยใช้ DC ราษฎร์ไบโอโปรตีนวิเคราะห์ (ห้องปฏิบัติการชีวภาพ Rad เฮอร์คิวลิส แคลิฟอร์เนีย)วัว serum albumin เป็นมาตรฐาน โปรตีนรวม (50-60 μg) ได้โดยโซเดียม dodecyl ซัลเฟต polyacrylamide เจ electrophoresis(หน้า SDS) ใช้เจ polyacrylamide 12% และโอนย้ายไปเมมเบรน PVDF ด้วย เมมเบรนที่ถูกบล็อก ด้วย 5% skim นมในPBST (0.05% v/v Tween-20 ใน PBS, pH 7.2) สำหรับ 1 h. มีเยื่อหุ้มincubated กับแอนติบอดีหลัก (1:5000) ที่ 4 C ค้างคืน แล้วด้วยรองแอนติบอดี (1:5000) สำหรับ 1 h.Membranes ถูกล้าง 3 ครั้งใน PBST สำหรับ 10 นาที สัญญาณตรวจพบโดยใช้การ Amershamระบบ ECL (Amersham Pharmacia ไบโอเทค อาร์ลิงตันไฮทส์ IL)โปรตีนญาตินิพจน์ถูก quantified โดย densitometryซอฟต์แวร์ LabWorks 4.5 และคำนวณสัมพันธ์กับการอ้างอิงของβ-แอกตินวงดนตรีRNAExtraction และ RT-PCR แบบเรียลไทม์ จริง-timeRT-PCRwasดำเนินการเพื่อกำหนดระดับของยีน macrophage RAW 264.7นิพจน์ อาร์เอ็นเอรวมจาก RAW 264.7 เซลล์ถูกแยกต่างหากโดยใช้การอาร์เอ็นเอ TRIzol แยกชุด (เทคโนโลยีชีวิต ร็อควิลล์ MD) ต่อไปนี้โพรโทคอลของผู้ผลิต มีสังเคราะห์ cDNA จากอาร์เอ็นเอทั้งหมด(200 ng) โดยย้อนหลัง transcription PCRusing cDNAreverse กำลังการผลิตสูงชุด transcription (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ตามโพรโทคอลของผู้ผลิต ใช้รองพื้นคู่ต่อไปนี้:iNOS (หมายเลขทะเบียน NM010927), 50-TCCTACACCACACCAAAC -30 (ข้างหน้า) และ 50-CTCCAATCTCTGCCTATCC-30 (ย้อนกลับ), ค็อกซ์-2 (หมายเลขทะเบียน NM011198), 50-CCTCTGCGATGCTCTTCC-30(ข้างหน้า) และ 50-TCACACTTATACTGGTCAAATCC-30 (ย้อนกลับ),GAPDH (เลขทะเบียน NM008084), 50-TCAACGGCACAGTCAAGG -30 (ข้างหน้า) และ 50-ACTCCACGACATACTCAGC-30(ย้อนหลัง) สัมพันธ์แบบเรียลไทม์ RT-PCR ตรวจยีนระดับที่ดำเนินการโดยใช้ anABI 7300 แบบ real-time PCR ระบบ (ประยุกต์Biosystems ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ส่วนผสมของปฏิกิริยา (ปริมาตรรวม25 μL) อยู่ 1 พลังงานสีเขียว SYBR PCR หลักผสม 300 nMส่งสีรองพื้น การ 300 รองพื้น nMreverse, cDNAand DEPC-H2O เช่นเป็น reagents พาณิชย์ (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ที่ค่าความร้อนก่อตั้งขึ้นตามโปรโตคอลของผู้ผลิตสั้น ๆ ประวัตินี้มี 95 C 10 นาทีสำหรับการเรียกใช้เอนไซม์ตาม denaturing ที่ 95 C 15 s การอบเหนียว และ elongationที่ 60 C ใน 1 นาที สำหรับจำนวนรอบ 40 ระดับสัมพัทธ์ของยีนนิพจน์ถูก quantified โดยใช้วิธี ΔΔCt ซึ่งผลการอัตราส่วนของยีนเป้าหมายให้เท่า ๆ กันทำความสะอาดแสดงยีนการวิเคราะห์ทางสถิติ แต่ละการทดลองที่ดำเนินการใน triplicateผลลัพธ์จะแสดงเป็นหมายถึง (ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD) การ ทางสถิติวิเคราะห์ที่ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SAS มีการวิเคราะห์ผลต่างของดำเนินการโดยใช้กระบวนการวิเคราะห์ความแปรปรวน ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (p < 0.05)ระหว่างวิธีที่กำหนด โดยการทดสอบช่วงหลายของดันแคน

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ที่มีประสิทธิภาพสูงโครมาโตเหลว (HPLC) การวิเคราะห์.
วิเคราะห์ HPLC (ฮิตาชิ L-6200 ปั๊มอัจฉริยะพร้อมกับ
อาเรย์โฟโตไดโอดเครื่องตรวจจับฮิตาชิ L-7455; ฮิตาชิกรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ที่ใช้
? Mightysil RP-18 คอลัมน์ (250 4.6 มม 5 ไมครอน) (คันโต Chemical Co. ,
กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) ทดสอบ HPLC สำหรับหาปริมาณของ
กรด ursolic และ inMEOA กรด oleanolic, EEOA andWEOA ได้ดำเนินการ
ออกเป็นอธิบายโดยเฉินและอัล (20) elution เป็นที่ห้อง
อุณหภูมิและนำมาใช้เป็นตัวทำละลาย acetonitrile H3PO4 และ 1.25% ใน
น้ำเป็นตัวทำละลายบีเฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยตัวทำละลาย A และ B ใน
สัดส่วน 86:14 v / V ที่ใช้สำหรับการชะ อัตราการไหลเป็น 0.5mL / นาที.
ตัวอย่างและมาตรฐานที่ได้รับการฉีดปริมาณ 20 ไมโครลิตรแต่ละ.
ursolic กรดและกรด oleanolic ถูกระบุโดยเปรียบเทียบของ
เวลาการเก็บรักษา (TR) ค่านิยมและสเปกตรัมรังสียูวีที่มองเห็นกับผู้ที่รู้จักกัน
มาตรฐานและได้รับการวัดโดยพื้นที่สูงสุดจาก chromatograms.
การเพาะเลี้ยงเซลล์ RAW 264.7 เซลล์ (BCRC 60001) ที่ได้รับจาก
การเก็บ Bioresource และศูนย์วิจัย (BCRC, อุตสาหกรรมอาหาร
สถาบันวิจัยและพัฒนา, ซินจู, ไต้หวัน) เป็นเซลล์
เพาะเลี้ยงใน DMEM 10% FBS 2 มิลลิ L-glutamine และ 100 U / มิลลิลิตร
penicillin-streptomycin เซลล์เพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสในความชื้น
5% บ่มเพาะ CO2.
เซลล์มีชีวิต Assay ทดสอบ AnMTT ได้ดำเนินการตาม
วิธีการของ Mosmann (21) RAW 264.7 เซลล์ถูกชุบลงใน 96 หลุม
แผ่นไมโครที่ความหนาแน่น 1? 104 เซลล์ / ดี หลังจาก 24 ชั่วโมง, วัฒนธรรม
กลางถูกแทนที่ด้วยเจือจางอนุกรม 200 ไมโครลิตรของสารสกัดหรือการใช้งานของ
สารตามด้วยการบ่ม 24 ชั่วโมง ความเข้มข้นสุดท้ายของ
solventwas น้อยกว่า 0.1% ในเซลล์ culturemedium.Culturemediumwas
เอาออกไปและแทนที่ด้วย 90 ไมโครลิตรของกลางวัฒนธรรมสด จากนั้น 10 ไมโครลิตรของ
filteredMTTsolution หมัน (5mg / มิลลิลิตร) ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ (พีบีเอส
พีเอช = 7.4) ถูกบันทึกอยู่ใน eachwell ถึงความเข้มข้นสุดท้ายของ 0.5 มก
ofMTT / มิลลิลิตร หลังจาก 5 ชั่วโมงย้อม unreacted ถูกลบออกและไม่ละลาย
ผลึก formazan ถูกกลืนหายไปใน 200 ไมโครลิตร / ดี DMSO และวัด
โดยกาแล็คซี่ FLUOstar spectrophotometer (BMGLabtechnologies, Offenburg,
เยอรมนี) ที่ 570 นาโนเมตร มีชีวิตเซลล์ญาติ (แสดงเป็น
เปอร์เซ็นต์) เมื่อเทียบกับการควบคุมหลุมขนาดกลางที่มีการเพาะเลี้ยงเซลล์โดยไม่ต้อง
ตัวอย่างที่คำนวณโดยใช้ A570nm (ตัวอย่าง) / A570nm (ควบคุม) 100.
วัดไนตริกออกไซด์ / ไนไตรท์ ระดับไนไตรท์ในการเพาะเลี้ยง
สื่อซึ่งสะท้อนให้เห็นถึงกิจกรรม NOS, ได้รับการพิจารณาจากปฏิกิริยา Griess.
เซลล์ถูกบ่มด้วยสารสกัดหรือสารที่ใช้งานใน
การมีหรือไม่มี LPS (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง สั้น ๆ , เซลล์ถูก
จ่ายเข้าไปในแผ่น 96 หลุมและ 100 ไมโครลิตรของสารละลายแต่ละผสม
ที่มีปริมาณเดียวกันของสาร Griess (Sulfanilamide 1%, 0.1%
dihydrochloride naphthylethylenediamine และ 5% กรดฟอสฟ) และ
บ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาที โซเดียมไนไตรท์ถูกใช้ในการ
สร้างกราฟมาตรฐาน (22) และความเข้มข้นของไนไตรท์ได้รับการ
วัดจากการอ่านความหนาแน่นของแสงที่ 550 นาโนเมตร.
วัด Prostaglandin E2 (PGE2) เซลล์ที่ถูกบ่ม
กับ EEOA ในการมีหรือไม่มี LPS (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง PGE2
ระดับถูกกำหนดโดยใช้ prostaglandin E2 ด่วนชุดประเมินผลกระทบสิ่งแวดล้อม (เคย์แมน
เคมิคอล, Ann Arbor, MI) ความเข้มข้นของ PGE2 เป็น
2,152 เจ Agric อาหาร Chem. ฉบับ 58, ฉบับที่ 4, 2010 ฮ et al.
photometrically การพิจารณาโดยใช้ผู้อ่าน microplate (เทคโนโลยีการรับรู้,
Palm City, FL) ที่ 405 นาโนเมตร.
กําหนดภายในเซลล์ออกซิเจน (ROS)
การผลิต การผลิต ROS ภายในเซลล์ได้รับการวัดโดยใช้
หัววัดเรืองแสงอนุมูลอิสระที่สำคัญ DCFH-DA DCFH ดัดแปลงมาจาก
DCFH-DA โดย deacetylase ภายในเซลล์จะถูกออกซิไดซ์ด้วยความหลากหลายของ
เซลล์ ROS จะ DCF, สารเรืองแสงสูง เซลล์ถูก
บ่มกับ EEOAin มีหรือไม่มี LPS (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) 4 ชม.
เซลล์เก็บเกี่ยวโดยวิธี trypsin-EDTA (trypsin 0.05% และ
0.02% EDTA ในพีบีเอส) และล้างครั้งที่สองกับพีบีเอส เซลล์มีการย้อม
20 μMof DCFH-DA 15 นาทีที่อุณหภูมิห้องและอยู่ภายใต้
การกำหนดของการผลิต ROS ภายในเซลล์โดยใช้การไหล FACScan
cytometer (Becton Dickinson Immunocytometry Systems, San Jose, CA).
ประมาณ 1? 104 นับที่ถูกสร้างขึ้นสำหรับแต่ละตัวอย่าง ROS
ผลิต (แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์) ที่คำนวณได้จากเควส CELL
ซอฟแวร์.
ดวงตะวันวิเคราะห์ เซลล์ถูกบ่มกับ EEOA และ
กรด ursolic ในการมีหรือไม่มี LPS (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร) เป็นเวลา 12 ชั่วโมง หลังจาก
การกระตุ้นเซลล์ถูกเก็บรวบรวมและ lysed ในบัฟเฟอร์สลายเย็น [20 มิลลิ
Tris-HCl (pH 7.4) 2 มิลลิ EDTA, 500 ไมครอนโซเดียม orthovanadate, 1%
Triton X-100 0.1% SDS 10 มิลลิ NaF 10 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร leupeptin 1 มิลลิ
PMSF] ความเข้มข้นของโปรตีน lysate เซลล์ได้รับการประเมินโดย
การวิเคราะห์โปรตีนซี Bio-Rad (ห้องปฏิบัติการ Bio-Rad ดาว, CA) โดยใช้
ซีรั่มอัลบูมิวัวเป็นมาตรฐาน โปรตีนรวม (50-60 ไมโครกรัม) ถูก
คั่นด้วยโซเดียมข่าวคราวซัลเฟตโดเดซิลอะคริเลต
(SDS-PAGE) โดยใช้เจลอะคริเลต 12% และโอนไปยัง
เมมเบรน PVDF เมมเบรนถูกบล็อก 5% นมพร่องมันเนยใน
PBST (0.05% ปริมาตร / ปริมาตร Tween-20 ในพีบีเอสพีเอช 7.2) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง เยื่อถูก
บ่มกับแอนติบอดีหลัก (1: 5000) วันที่ 4 C ค้างคืนแล้วกับ
รองแอนติบอดี (1: 5000) เป็นเวลา 1 h.Membranes ถูกล้างสามครั้ง
ใน PBST เป็นเวลา 10 นาทีในแต่ละ สัญญาณที่ตรวจพบโดยใช้ Amersham
ระบบ ECL (Amersham-Pharmacia ไบโอเทค, อาร์ลิงตันไฮทส์).
การแสดงออกของโปรตีนญาติได้รับการวัดความหนาแน่นโดยใช้
LabWorks 4.5 ซอฟแวร์และการคำนวณเทียบกับการอ้างอิงβ-โปรตีน
วง.
RNAExtraction และ Real-Time RT -PCR Real-timeRT-PCRwas
ดำเนินการเพื่อกำหนดระดับของ RAW 264.7 macrophage ยีน
แสดงออก อาร์เอ็นเอทั้งหมดจาก RAW 264.7 เซลล์ที่แยกได้โดยใช้
ชุดแยก Trizol อาร์เอ็นเอ (ชีวิต Technologies, Rockville, MD) ต่อไปนี้
โปรโตคอลของผู้ผลิต ยีนสังเคราะห์จาก RNA ทั้งหมด
(200 นาโนกรัม) โดยถอดความกลับ PCRusing ความจุสูง cDNAreverse
ชุดถอดความ (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) ตาม
โปรโตคอลของผู้ผลิต คู่ไพรเมอร์ต่อไปนี้ถูกนำมาใช้:
iNOS (เลข NM010927) 50 TCCTACACCACACCAAAC-
30 (ข้างหน้า) และ 50-CTCCAATCTCTGCCTATCC-30 (ย้อนกลับ); COX-
2 (เลข NM011198) 50 CCTCTGCGATGCTCTTCC-30
(ข้างหน้า) และ 50-TCACACTTATACTGGTCAAATCC-30 (ย้อนกลับ);
GAPDH (เลข NM008084) 50 TCAACGGCACAGTCAAGG-
30 (ข้างหน้า) และ 50-ACTCCACGACATACTCAGC-30
(ย้อนกลับ) ญาติแบบ real-time RT-PCR ในการตรวจหาการแสดงออกของยีน
ในระดับที่ได้รับการดำเนินการโดยใช้ anABI 7300 เวลาจริงระบบ PCR (Applied
Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) ผสมปฏิกิริยา (ปริมาณรวม
25 ไมโครลิตร) ที่มี 1 พลังงาน SYBR ผสม PCR ต้นแบบสีเขียว 300 นาโนเมตร
ไพรเมอร์ไปข้างหน้า 300 nMreverse ไพรเมอร์, cDNAand DEPC-H2O รวมทั้ง
เป็นสารเคมีในเชิงพาณิชย์ (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย)
รายละเอียดการระบายความร้อนได้รับการจัดตั้งขึ้นตามโปรโตคอลของผู้ผลิต.
สั้น ๆ , รายละเอียดนี้คือ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีสำหรับการเปิดใช้เอนไซม์
ตามด้วย denaturing ที่ 95? C เป็นเวลา 15 วินาทีและการอบและการยืดตัว
ที่ 60 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีสำหรับ ทั้งหมด 40 รอบ ระดับความสัมพันธ์ของยีนที่
แสดงออกถูกวัดโดยใช้วิธีการΔΔCtซึ่งส่งผลให้
อัตราส่วนของการแสดงออกของยีนเป้าหมายที่จะแสดงความเท่าเทียมกันยีนดูแลทำความสะอาด.
การวิเคราะห์ทางสถิติ การทดลองแต่ละคนได้ดำเนินการในเพิ่มขึ้นสามเท่า.
ผลจะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย (ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน (SD). สถิติ
การวิเคราะห์ที่ได้ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์ SAS. การวิเคราะห์ความแปรปรวนได้รับการ
ดำเนินการโดยใช้วิธีการวิเคราะห์ความแปรปรวน. ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญ (p <0.05)
ระหว่างวิธีที่ถูกกำหนดโดย ดันแคนทดสอบช่วงหลาย

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วิธีโครมาโทกราฟีของเหลวสมรรถนะสูง ( HPLC ) การวิเคราะห์ .
การวิเคราะห์ HPLC ( Hitachi l-6200 ฉลาดปั๊มพร้อมกับ
โฟโตไดโอดเรย์เครื่อง Hitachi l-7455 ; Hitachi , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) ใช้
เป็น mightysil rp-18 คอลัมน์ ( 250  4.6 มม. , 5 μ M ) ( คันโตเคมี . ,
โตเกียว , ญี่ปุ่น ) วิเคราะห์ HPLC ในการวิเคราะห์ปริมาณกรดและกรด inmeoa
ursolic oleanolic หนาเตอะเลือก andweoa ได้ด
,ออกมาตามที่อธิบายไว้โดย Chen et al . ( 20 ) ได้มาแสดงอุณหภูมิห้อง
และใช้ไนเป็นตัวทำละลายและ 1.25% H3PO4 ใน
น้ำเป็นตัวทำละลาย B เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยตัวทำละลาย A และ B
สัดส่วน 86:14 v / V ใช้สำหรับใช้ . อัตราการไหลเท่ากับ 0.5ml / min
ตัวอย่างและมาตรฐานในการฉีดที่ปริมาณ 20 μ
L แต่ละกรดและกรด 2 ursolic oleanolic ระบุเวลาเปรียบเทียบความคงทนของพวกเขา
( TR ) และสเปกตรัมที่มองเห็นค่า UV ที่มีมาตรฐานที่รู้จัก
และ quantified โดยพื้นที่สูงสุดจากกลิ่น
เซลล์เพาะเลี้ยง ดิบ 264.7 เซลล์ไลน์ ( บาเซล 60001 ) ได้จาก
ชุดชีวภาพ และศูนย์วิจัย ( บาเซล , อุตสาหกรรม
อาหารวิจัยและพัฒนาสถาบัน , Hsinchu , ไต้หวัน )ในการเพาะเลี้ยงเซลล์ถูก
dmem 10% FBS Glutamine 2 มม. และ 100 U / ml
เพนนิซิลลินเหมือนเคย . เซลล์เพาะเลี้ยงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ใน
humidified
5% CO2 Incubator .
เซลล์แบคทีเรีย anmtt assay ได้ปฏิบัติตาม
วิธี mosmann ( 21 ) ดิบ 264.7 เซลล์มีการชุบลงในจานที่ 96 ดี
ไมโครความหนาแน่น 1  104 เซลล์ / ดี หลังจาก 24 ชั่วโมง , วัฒนธรรม
ขนาดกลางถูกแทนที่ด้วย 200 μ L อนุกรมเจือจางสารสกัดหรือสาร Active
ตามด้วยการบ่ม 24 H . ที่ความเข้มข้นสุดท้าย
ตัวทำละลายน้อยกว่า 0.1% ในเซลล์ culturemedium . culturemediumwas
ลบออกและแทนที่ด้วย 90 μลิตรอาหารเลี้ยงเชื้อสด แล้ว 10 μ l
filteredmttsolution เป็นหมัน ( 5 mg / ml ) ในฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ ( พีบีเอส
pH = 7.4 ) คือการเพิ่ม eachwell ,ถึงความเข้มข้นสุดท้าย 0.5 มก. / มล. หลังจาก ofmtt
5 H , ย้อมเข้าสู่ถูกเอาออก และผลึกที่ไม่ละลายน้ำ ละลายได้ในปฏิบัติการ
200 μ L / ดีของ DMSO และวัด
โดยเครื่อง Galaxy fluostar ( bmglabtechnologies Offenburg เยอรมนี , ,
) 570 นาโนเมตร ชีวิตเซลล์แบบสัมพัทธ์ ( แสดงเป็น
เปอร์เซ็นต์ ) เทียบกับการควบคุมที่มีการเพาะเลี้ยงเซลล์ปานกลางโดยไม่
เวลส์ตัวอย่างคำนวณได้โดยใช้ a570nm ( ตัวอย่าง ) / a570nm ( ควบคุม )  100
การวัดผลของไนตริกออกไซด์ / ไนไตรท์ . ระดับไนไตรท์ในสื่อเลี้ยง
ซึ่งสะท้อนให้เห็นถึงกิจกรรม NOS โดยพิจารณาจากปฏิกิริยา griess .
เซลล์ถูกบ่มด้วยสารสกัดหรือสารประกอบของการใช้งานใน
การแสดงตนหรือขาดของสเปรย์หล่อลื่น ( 1 μ g / ml เป็นเวลา 24 ชั่วโมงสั้น ๆ เซลล์มี
จ่ายเป็น 96 ดีจานและ 100 μ L แต่ละนำผสม
กับปริมาณเดียวกันของ griess Reagent ( 1% sulfanilamide 0.1 %
: naphthylethylenediamine 5% และกรดฟอสฟอริก )
) ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 10 นาทีใช้โซเดียมไนไตรท์

สร้างกราฟมาตรฐาน ( 22 ) และความเข้มข้น ไนไตรท์เป็นวัดความหนาแน่นของแสงในการอ่าน

550 นาโนเมตรการวัดของโปรสตาแกลนดิน ทู ( pge2 ) เซลล์ที่ถูกบ่ม
กับหนาเตอะเลือกในการแสดงตนหรือขาดจาระบี ( 1 μ g / ml เป็นเวลา 24 ชั่วโมง pge2
ระดับตั้งใจใช้พรอสตาแกลนดิน E2 ด่วน EIA Kit ( Cayman
เคมี บริษัท แอน อาร์เบอร์ มิ ) ความเข้มข้นของ pge2 คือ
2152 เจ. Agric . เคมีอาหาร , ปีที่ 58 ฉบับที่ 4 2553
Hsu et al .การพิจารณาพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่าน photometrically ความตระหนักเทคโนโลยี
Palm City , FL ) ที่ 405 nm .
หาเซลล์ของชนิดออกซิเจนปฏิกิริยา ( ROS )
ผลิต การผลิต ROS ภายในวัด โดยใช้สารเรืองแสง
ไวด้วย dcfh-da . dcfh แปลงจาก
dcfh-da โดยไม่แตกต่างกันภายในเซลล์เป็นออกซิไดซ์โดยความหลากหลายของชนิดการเติบโต
รอส ,สารประกอบที่มีการเรืองแสง เซลล์ที่ถูกบ่มด้วย
eeoain การแสดงตนหรือขาดของสเปรย์หล่อลื่น ( 1 μ g / ml ) 4 h .
เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยเอนไซม์ ( เอนไซม์สารละลาย EDTA 0.05% และ
0.02 % EDTA ใน PBS ) และล้างสองครั้งกับ PBS เซลล์ก็เปื้อน
20 μเข้า dcfh-da 15 นาทีที่อุณหภูมิห้อง และภายใต้การกำหนดผลตอบแทนของการผลิตเซลล์

ใช้ facscan ไหลใช้โมโน ( เบคตอนดิกคินสัน immunocytometry ระบบ , San Jose , CA ) .
ประมาณ 1  104 ครั้งถูกทำสำหรับแต่ละตัวอย่าง การรอส
การผลิต ( แสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ ) คำนวณได้โดยเซลล์ค้นหาซอฟต์แวร์
.
การวิเคราะห์ Western blot . เซลล์ที่ถูกบ่มกับหนาเตอะเลือกและ
ursolic กรดในการแสดงตนหรือขาดของสเปรย์หล่อลื่น ( 1 μ g / ml ) 12 ชั่วโมง หลังจาก
กระตุ้นเซลล์มีการรวบรวมและ lysed ในเย็นการสลายบัฟเฟอร์ [ 20 mm
โดย HCl ( pH 7.4 ) , 2 mM EDTA , 500 μ M โซเดียม orthovanadate 1 %
Triton X-100 , 0.1 % SDS , กลุ่ม 10 มม. 10 μ g / ml และ 1 mM PMSF ลูเพปติน ]

ระดับโปรตีนของเซลล์ lysate ประมาณโดย
ชีวภาพราด DC โปรตีน assay ( ไบโอ ราดห้องปฏิบัติการ , Hercules , CA ) โดยใช้
อัลบูมินเป็นมาตรฐานโปรตีนรวม ( μ 50-60 กรัม )
คั่นด้วยโซเดียมโดเดซิลซัลเฟต polyacrylamide gel electrophoresis ( SDS-PAGE ) การใช้เจลอะคริลาไมด์
12 % และโอนไปยัง
PVDF เมมเบรน เมมเบรนอุดตัน 5% หางนมผงใน
pbst ( 0.05 % v / v tween-20 ใน PBS , pH 7.2 ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมง บ่มด้วยเยื่อแผ่นแบบ
แอนติบอดีหลัก ( 1:5000 ) ที่ 4
C ค้างคืนแล้วกับ
ระดับแอนติบอดี ( 15 ) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงสามารถถูกล้างสามครั้ง
pbst สำหรับ 10 นาทีในแต่ละ สัญญาณที่ตรวจพบการใช้ชาม
ECL ระบบ ( ที่มุ่งมั่น ไบโอเทค , Arlington Heights , IL ) .
ญาติโปรตีนที่แสดงออก quantified โดย densitometry ใช้
labworks 4.5 ซอฟต์แวร์และคำนวณเทียบกับบีตา - วงดนตรีอ้างอิง
actin .
rnaextraction RT-PCR และเวลาจริง จริง timert pcrwas
ได้ทำการศึกษาระดับของวัตถุดิบ 264.7 แมโครเฟจยีน
การแสดงออก อาร์เอ็นเอรวมจากดิบ 264.7 เซลล์ได้ใช้
trizol RNA แยกชุด ( ชีวิตเทคโนโลยี ร็อควิลล์ , MD ) โปรโตคอลต่อไปนี้
ผู้ผลิตของ ยีนสังเคราะห์จาก
อาร์เอ็นเอทั้งหมด ( 200 กรัม ) โดยการถอดความย้อนกลับ pcrusing ความจุสูง cdnareverse
ถอดความ Kit ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้CA ) ตาม
โปรโตคอลของผู้ผลิต ต่อไปนี้ใช้ไพรเมอร์คู่ :
inos ( หนังสือไม่ nm010927 ) 50-tcctacaccacaccaaac -
30 ( ไปข้างหน้า ) และ 50-ctccaatctctgcctatcc-30 ( ย้อนกลับ ) ; Cox -
2 ( หนังสือไม่ nm011198 ) 50-cctctgcgatgctcttcc-30
( ไปข้างหน้า ) และ 50-tcacacttatactggtcaaatcc-30 ( ย้อนกลับ ) ;
gapdh ( หนังสือไม่ nm008084 50-tcaacggcacagtcaagg --
)30 ( ไปข้างหน้า ) และ 50-actccacgacatactcagc-30
( กลับ ) 4 . เวลาจริงการตรวจสอบการแสดงออกของยีนที่เกี่ยวข้องกับ
ระดับ โดยใช้ระบบเรียลไทม์พีซีอาร์ anabi 7300 ( ประยุกต์
Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ แคลิฟอร์เนีย ) ปฏิกิริยาผสม (
ปริมาณรวม 25 μ L ) ประกอบด้วย 1  พลังงานสีเขียว SYBR ดีเอ็นเอต้นแบบผสม 300 nm
ส่งต่อรองพื้น , 300 nmreverse ไพรเมอร์ cdnaand depc-h2o เช่นกัน
เป็นสารเคมีในเชิงพาณิชย์ ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย )
ประวัติความร้อนก่อตั้งขึ้นตามขั้นตอนของผู้ผลิต .
สั้นโปรไฟล์นี้ 95
C 10 นาทีเอนไซม์กระตุ้น
ตามี่ 95
C เป็นเวลา 15 วินาที และการอบและการยืดตัว
ที่ 60
C เป็นเวลา 1 นาที รวมเป็น 40 รอบ ระดับความสัมพันธ์ของยีน
การแสดงออกที่ถูกวัดโดยใช้วิธีΔΔ CT ซึ่งส่งผลต่อการแสดงออกของยีนเป้าหมาย

อย่างเท่าเทียมกันแสดงความยีน สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล แต่ละทดสอบทั้งสามใบ
ผลลัพธ์จะแสดงเป็นค่าเฉลี่ย ( ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ( SD ) การวิเคราะห์ทางสถิติ
ได้ดําเนินการโดยใช้ SAS ซอฟต์แวร์ การวิเคราะห์ความแปรปรวน
โดยใช้ขั้นตอนการวิเคราะห์ ความแปรปรวนทางเดียวความแตกต่างทางสถิติ ( P < 0.05 )
ระหว่างหมายถึงกำหนดโดยการทดสอบหลายช่วงดันแคน .