Preparation of RBC Membrane Suspens

Preparation of RBC Membrane Suspension for Electrophoretic Analysis
To assure the complete removal of leukocytes from the RBC aliquot (3 ml),
we performed a centrifugation on a density gradient (Histopaque 1.119; Sigma-
Aldrich, St Louis, MO, USA). After washing the isolated RBCs were exposed to
hypotonic lysis, according to Dodge et al. [8]. The obtained membrane suspensions
were washed with a Dodge buffer (phosphate buffer solution pH 8.0),
adding phenylmethylsulphonyl fluoride, a protease inhibitor (final concentration
0.1 mmol/l), in the first two washes. The protein concentration of RBC
membrane suspensions was determined by the Bradford method [9]. Briefly,
200 μl of Bradford reagent are added to 40 μl of RBC membrane suspension in
96 well plates, the plates are incubated for 5 min, and the absorbance was measured
at 595 nm. A standard curve was developed using different concentrations
of bovine serum albumin. The membrane suspensions were treated with an
equal volume of a solubilization buffer (0,125 mol/l Tris-HCl pH 6.8, 4% sodium
dodecyl sulphate (SDS), 20% glycerol, 10% 2-mercaptoethanol) and heat
denatured.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

การเตรียมการของ RBC เยื่อระงับสำหรับการวิ Electrophoreticเพื่อให้มั่นใจการกำจัดที่สมบูรณ์ของเม็ดเลือดขาวจากส่วนลงตัวของ RBC (3 ml),เราดำเนินการแบบหมุนเหวี่ยงในการไล่ระดับความหนาแน่น (หวัง 1.119 Histopaque ซิกมา-Aldrich เซนต์หลุยส์ MO สหรัฐอเมริกา) หลังจากล้างเม็ดแยกได้สัมผัสกับlysis ใส ตามหลบ et al. [8] ระบบกันสะเทือนได้รับเมมเบรนถูกล้าง ด้วยบัฟเฟอร์ดอดจ์ (ฟอสเฟตบัฟเฟอร์สารละลาย pH 8.0),เพิ่ม phenylmethylsulphonyl ฟลูออไรด์ การยับยั้งน้ำย่อย (ความเข้มข้นสุดท้าย0.1 โมล/ลิตร), ในล้างสองครั้งแรก โปรตีนความเข้มข้นของเม็ดเลือดแดงเมมเบรนฟโรดโดยวิธีแบรดฟอร์ด [9] สั้น ๆΜl 200 ของแบรดฟอร์ดน้ำยาลงใน μl 40 ของ RBC เยื่อระงับใน96 ดีแผ่น แผ่นจะได้รับการกก 5 นาที และค่าที่ถูกวัดที่ 595 nm เส้นโค้งมาตรฐานถูกพัฒนาโดยใช้ความเข้มข้นแตกต่างกันของวัวซีรั่ม บริการเมมเบรนได้รับการรักษาด้วยการเท่ากับปริมาตรของบัฟเฟอร์ solubilization (0,125 mol/l ทริสเรทติ้ง HCl pH 6.8, 4% โซเดียมdodecyl ซัลเฟต (SDS), กลีเซอรอล 20%, 10% 2-mercaptoethanol) และความร้อนเอทิลแอลกอฮอล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การเตรียมการของ RBC Suspension เมมเบรนสำหรับการวิเคราะห์ Electrophoretic
เพื่อให้มั่นใจว่าการกำจัดที่สมบูรณ์ของเม็ดเลือดขาวจาก RBC หาร (3 มล.)
เราดำเนินการหมุนเหวี่ยงบนลาดหนาแน่น (Histopaque 1.119; Sigma-
ดิช, St Louis, MO, USA) หลังจากล้างเม็ดเลือดแดงที่แยกได้สัมผัสกับ
การสลาย hypotonic ตามดอดจ์, et al [8] แขวนลอยเมมเบรนได้
ถูกล้างด้วยบัฟเฟอร์ดอดจ์ (ฟอสเฟตสารละลายบัฟเฟอร์ค่า pH 8.0)
การเพิ่มฟลูออไร phenylmethylsulphonyl เป็นน้ำย่อยยับยั้ง (ความเข้มข้นสุดท้าย
0.1 มิลลิโมล / ลิตร) ในสองครั้งแรกล้าง ความเข้มข้นของโปรตีนจาก RBC
แขวนลอยเยื่อถูกกำหนดโดยวิธีแบรดฟอ [9] สั้น ๆ ,
200 ไมโครลิตรของแบรดฟอสารมีการเพิ่มถึง 40 ไมโครลิตรจาก RBC เมมเบรนในการระงับ
96 แผ่นกันของแผ่นเปลือกโลกจะฟักเป็นเวลา 5 นาทีและการดูดกลืนแสงที่ถูกวัด
ที่ 595 นาโนเมตร เส้นโค้งมาตรฐานได้รับการพัฒนาโดยใช้ความเข้มข้นที่แตกต่างกัน
ของอัลบูมิวัวซีรั่ม แขวนลอยเมมเบรนได้รับการรักษาที่มี
ปริมาณที่เท่ากันของบัฟเฟอร์ละลาย (0125 mol / L Tris-HCl ค่า pH 6.8, 4% โซเดียม
โดเดซิลซัลเฟต (SDS), กลีเซอรีน 20%, 10% 2-mercaptoethanol) และความร้อน
เอทิลแอลกอฮอล์

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การเตรียมเมมเบรนสำหรับการวิเคราะห์รูปแบบของเม็ดเลือดแดง ระงับเพื่อให้สมบูรณ์กำจัดของเม็ดเลือดขาวจาก RBC ส่วนลงตัว ( 3 ml . )เราได้ทำการปั่นบนความหนาแน่นความลาดชัน ( histopaque 1.119 ; Sigma -อัลดริช , เซนต์ หลุยส์ โม สหรัฐอเมริกา ) หลังจากล้างแยก rbcs ถูกเปิดเผยไฮโพทอนิกเสื่อมตามหลบ et al . [ 8 ] นำเยื่อที่แขวนลอยถูกล้างด้วยหลบบัฟเฟอร์ ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์พีเอช 8.0 )เพิ่ม phenylmethylsulphonyl ฟลูออไรด์ , protease inhibitor ( ความเข้มข้นสุดท้าย0.1 มิลลิโมล / ลิตร ) , สองตัวแรก โปรตีนความเข้มข้นของเม็ดเลือดแดงเมมเบรนช่วงล่างถูกกำหนดจากแบรดฟอร์ด ) [ 9 ] สั้น ๆ200 ลิตรใช้μแบรดฟอร์ดจะเพิ่ม 40 μชั้นของเยื่อแขวนในเม็ดเลือดแดง96 ดีแผ่น แผ่นจะบ่มนาน 5 นาที และวัดค่าการดูดกลืนแสงที่ 595 นาโนเมตร เส้นโค้งมาตรฐานถูกพัฒนาโดยใช้ความเข้มข้นต่าง ๆของอัลบูมิน . เยื่อหุ้มเส้น ได้รับการรักษาด้วยปริมาณเท่ากันของการสกัดบัฟเฟอร์ ( 0125 mol / L โดยกรดไฮโดรคลอริก pH 6.8 , 4 % โซเดียมโดเดซิลซัลเฟต ( SDS ) 20 % กลีเซอรอล , 10% อย่างเดียว ) และความร้อนใช้ .