2. Materials and methods2.1. Plant

2. Materials and methods2.1. Plant materialsIn vitro cultured pear (Pyrus communis) plants infected withASGV, ACLSV and ASPV were used for the optimization of all RT-PCRassays.Plasmids containing cloned cDNAs of a 582 bp CP gene (Acces-sion no. AY728180) of an ACLSV isolate from peach, a 500 bpfragment covering 62.7% of the CP gene of a ASGV isolate from pear(Zheng et al., 2005), and a fragment of the CP gene of a ASPV iso-late from pear, respectively, were used as templates to optimizethe PCR conditions and evaluate its sensitivity for the detection ofthose three viruses.Samples of field-grown sandy pear (Pyrus pyrifolia cv. Cuiguanand Yuanhuang), of which the infections with ASGV, ACLSV andASPV were confirmed by uniplex RT-PCR (uRT-PCR), together within vitro cultured plants of P. communis, were used for the vali-dation of the efficiency and specificity of mRT-PCR. Some other pearand apple samples randomly collected from different fields wereincluded in the validation of the efficiency of optimized mRT-PCRapplied for the detection of the three viruses in field-grown plants.In vitro virus-free plants of Pyrus betulifolia were used as negativecontrols for all assays.2.2. Design of virus-specific primersOur previous studies indicated that ASGV-specific primer setASGV-U/ASGV-2 (James, 1999) could give reliable detections ofASGV in pear plants. Preliminary experiments performed in ourlaboratory revealed that ASPV isolates were highly variable andthere were problems with RT-PCR detection of some ASPV iso-lates by using primers reported previously (MacKenzie et al., 1997;Malinowski et al., 1998; Schwarz and Jelkmann, 1998; Komorowskaet al., 2010). Thereby, in this study, three primer pairs specificfor ACLSV and four primer pairs specific for ASPV (Table S1) weredesigned based on the sequences specific for each virus availablein GenBank and tested in our laboratory (unpublished), and thoseprimer sets were designed to have similar annealing temperatures(50–58◦C). The primer sets ACLSV-52/ACLSV-53 specific for ACLSV(German et al., 1990) and ASPV370-F/ASPV370-R specific for ASPVreported previously (Menzel et al., 2002) were also included in theassays. The specificity of each primer set was analyzed by compar-isons and Blastn search (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).Supplementary material related to this article can be found,in the online version, at http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.11.005.2.3

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2 วัสดุและ methods2.1 พืช materialsin หลอดทดลองเพาะเลี้ยงลูกแพร์ (Pyrus communis) พืชที่ติดเชื้อ withasgv aclsv และ aspv ถูกนำมาใช้สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของทุก RT-pcrassays.plasmids มี cDNAs โคลนของยีน cp 582 bp (Acces-ไซออนไม่มี. ay728180) ของ aclsv แยกจาก พีช 500 bpfragment ครอบคลุม 62.7% ของยีน cp ของ asgv แยกจากลูกแพร์ (เจิ้งเหอและคณะ. 2005)และส่วนของยีน cp ของ aspv iso ปลายจากลูกแพร์ตามลำดับถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบในการ optimizethe เงื่อนไข pcr และประเมินความไวของการตรวจหา ofthose viruses.samples สามของสนามปลูกลูกแพร์ทราย (cuiguanand Pyrus pyrifolia พันธุ์. yuanhuang) ที่ติดเชื้อด้วย asgv, aclsv andaspv ได้รับการยืนยันโดย uniplex RT-PCR (urt-PCR)ร่วมกันภายในหลอดทดลองพืชเพาะเลี้ยงของพี communis ถูกนำมาใช้สำหรับวาลิ-dation ของประสิทธิภาพและความจำเพาะของ MRT-PCR อื่น ๆ บางตัวอย่างแอปเปิ้ลที่เก็บรวบรวม pearand สุ่มจากเขตข้อมูลที่แตกต่างกันในการตรวจสอบ wereinc​​luded ของประสิทธิภาพของการเพิ่มประสิทธิภาพ MRT-pcrapplied การตรวจหาไวรัสที่สามในพืชเขตปลูกในหลอดทดลองพืชไวรัสฟรีของ betulifolia Pyrus ถูกนำมาใช้เป็น negativecontrols เพื่อ assays.2.2 ทั้งหมด การออกแบบของ primersour ศึกษาก่อนหน้านี้ไวรัสที่เฉพาะเจาะจงระบุว่า asgv เฉพาะไพรเมอร์ setasgv-u/asgv-2 (james, 1999) สามารถให้การตรวจจับที่เชื่อถือได้ในพืช ofasgv ลูกแพร์การทดลองเบื้องต้นดำเนินการใน ourlaboratory เปิดเผยว่าเ​​ชื้อ aspv มี andthere ตัวแปรสูงมีปัญหาเกี่ยวกับการตรวจสอบ RT-PCR บาง aspv iso ปลากะพงขาวโดยใช้ไพรเมอร์รายงานก่อนหน้านี้ (แม็คเคนซี่ et al, 1997;.. มาลีเนาสกี้และคณะ, 1998; Schwarz และ jelkmann, 1998;. komorowskaet อัล, 2010) ดังนั้นในการศึกษาครั้งนี้สามคู่ไพรเมอร์ specificfor aclsv และสี่คู่ไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ aspv (S1 ตาราง) weredesigned ตามลำดับที่เฉพาะเจาะจงสำหรับไวรัสแต่ละ genbank availablein และผ่านการทดสอบในห้องปฏิบัติการของเรา (ไม่ได้) และชุด thoseprimer ถูกออกแบบมาให้มีลักษณะคล้ายกันที่อุณหภูมิการหลอม (50-58 ◦ค) ชุดไพรเมอร์ที่เฉพาะเจาะจงสำหรับ aclsv-52/aclsv-53 aclsv (เย​​อรมัน, et al.1990) และเฉพาะเจาะจง aspv370-f/aspv370-r เพื่อ aspvreported ก่อนหน้านี้ (Menzel et al,., 2002) นอกจากนี้ยังรวมอยู่ใน theassays ความจำเพาะของไพรเมอร์แต่ละชุดได้รับการวิเคราะห์โดย isons compar และค้นหา blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi). วัสดุเสริมที่เกี่ยวข้องกับบทความนี้สามารถพบได้ในเวอร์ชั่นออนไลน์ ที่ http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.11.005.2.3

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2. วัสดุและ methods2.1 โรงงาน materialsIn หลอด cultured ลูกแพร์ (Pyrus communis) พืชที่ติดเชื้อ withASGV, ACLSV และ ASPV ใช้สำหรับการเพิ่มประสิทธิภาพของ RT-PCRassays.Plasmids ทั้งหมดที่ประกอบด้วย cDNAs โคลนของยีน bp CP 582 (sion เดินไม่ AY728180) ของ isolate มี ACLSV จากพีช 500 bpfragment ครอบคลุม 62.7% ของยีน CP ของ ASGV แยกจากลูกแพร์ (เจิ้ง et al., 2005), และชิ้นส่วนของยีน CP ของ ASPV ที่ iso สายจากลูกแพร์ ตามลำดับ ถูกใช้เป็นแม่แบบที่ optimizethe PCR เงื่อนไข และประเมินความสำคัญของไวรัสสาม ofthose ตรวจสอบตัวอย่างของฟิลด์โตทรายต้น (Pyrus pyrifolia พันธุ์ Cuiguanand Yuanhuang), ซึ่งติดเชื้อกับ ASGV, ACLSV andASPV ถูกยืนยัน โดย uniplex RT-PCR (uRT-PCR), กันภายในหลอด cultured พืชของ P. communis ใช้สำหรับ dation vali ประสิทธิภาพและ specificity mRT PCR ตัวอื่น ๆ pearand แอปเปิ้ลอย่างสุ่มเก็บจากต้น wereincluded ในการตรวจสอบประสิทธิภาพของเหมาะ PCRapplied mRT ตรวจไวรัสสามในเขตข้อมูลที่มีปลูกพืชการเพาะเลี้ยงไวรัสพืชของ Pyrus betulifolia ถูกใช้เป็น negativecontrols สำหรับ assays.2.2 ทั้งหมด ออกแบบเฉพาะไวรัส primersOur การศึกษาก่อนหน้านี้ระบุว่า ASGV เฉพาะพื้น setASGV-U/ASGV-2 (เจมส์ 1999) สามารถให้ detections เชื่อถือ ofASGV ในต้นพืช เบื้องต้นทดลองดำเนินการใน ourlaboratory เปิดเผยว่า ASPV isolates ถูกผันแปรสูง andthere มีปัญหาตรวจ iso ASPV บางปลากะพง RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์รายงานก่อนหน้านี้ (แมคและ al., 1997Malinowski et al., 1998 โรลด์และ Jelkmann, 1998 Komorowskaet al., 2010) ในการศึกษานี้ จึง รองพื้นคู่ specificfor ACLSV สาม และสี่พื้นคู่เฉพาะสำหรับ weredesigned ASPV (ตาราง S1) ตามลำดับที่เฉพาะเจาะจงสำหรับแต่ละไวรัส availablein GenBank และทดสอบในห้องปฏิบัติการของเรายกเลิกการ (ประกาศ), และชุด thoseprimer ถูกออกแบบให้มี temperatures(50–58◦C) คล้ายหลอม เฉพาะชุด ACLSV-52/ACLSV-53 รองพื้นสำหรับ ACLSV (เยอรมัน et al., ปี 1990) และ ASPV370-F/ASPV370-R เฉพาะสำหรับ ASPVreported ก่อนหน้านี้ (Menzel และ al., 2002) นอกจากนี้ยังรวมอยู่ใน theassays Specificity ของแต่ละชุดพื้นถูกวิเคราะห์ โดย compar isons และค้นหา Blastn (http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)วัสดุเสริมที่เกี่ยวข้องกับบทความนี้จะมา รุ่นออนไลน์ ที่ http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.11.005.2.3

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วัสดุและ methods2.1 . โรงงานผลิตสาลี่มีวัฒนธรรม Vitro materialsin (สาลี่ละหุ่ง)พันธุ์ไม้ต่างๆที่ติด withasgv aclsv aspv และได้ถูกนำมาใช้สำหรับการปรับแต่งของ Rt - pcrassays . plasmids ทั้งหมดที่ประกอบด้วย cdnas จำลองไว้ในจำนวน 582 BP CP ยีน(การเข้าถึง - ซียงไม่ได้ AY 728180 )ของ aclsv ที่แยกจากสีพีช 500 bpfragment ที่ครอบคลุม 62.7% ยีน CP ของ asgv ที่แยกจากลูกแพร์( Zheng et al . 2005 )และเกร็ดยีน CP ของ aspv ISO - ช่วงดึกที่จากลูกแพร์ตามลำดับได้ถูกนำมาใช้เป็นแม่แบบในการ optimizethe เงื่อนไข pcr และประเมินระดับความไวสำหรับการตรวจจับ ofthose สามไวรัส.ตัวอย่างของสาลี่หาดทรายฟิลด์โต(สาลี่ pyrifolia cv. cuiguanand yuanhuang )ซึ่งการติดเชื้อที่พร้อมด้วย asgv aclsv andaspv ได้รับการยืนยันโดย uniplex Rt - pcr ( URT - pcr )รวมกันอยู่ใน Vitro พันธุ์ไม้มีวัฒนธรรมของละหุ่ง p .ได้ถูกนำมาใช้สำหรับ Vali res - dation ของพวกเขาถกเถียงและ ประสิทธิภาพ ของสถานีรถไฟฟ้าใต้ดิน - pcr. ตัวอย่างแอปเปิล pearand อื่นๆบางอย่างแบบสุ่มเก็บรวบรวมจากข้อมูลในฟิลด์ต่างๆ wereincluded ในการตรวจสอบที่มี ประสิทธิภาพ มีที่สถานีรถไฟฟ้าใต้ดินของการปรับแต่ง - pcrapplied สำหรับการตรวจจับไวรัสที่สามในฟิลด์พันธุ์ไม้ขึ้นใน Vitro พันธุ์ไม้ไวรัส - แบบไม่เสียค่าบริการของ betulifolia สาลี่จะถูกใช้เป็น negativecontrols สำหรับทั้งหมด assays. 2.2 การออกแบบของการศึกษาไวรัส - เฉพาะ primersour ก่อนหน้าระบุว่า asgv - เฉพาะเชื้อปะทุ setasgv - U / asgv 2 ( James 1999 )ไม่สามารถทำให้ ofasgv เชื่อถือได้ตอบรับในโรงงานสาลี่เบื้องต้นการทดลองดำเนินการใน ourlaboratory เปิดเผยว่า aspv แยกเป็นอย่างมากได้ andthere เป็นปัญหาที่เกิดขึ้นกับ Rt - pcr การตรวจจับของบางอย่าง aspv มาตรฐาน ISO - lates โดยการใช้ primers รายงานก่อนหน้านี้(, Mackenzie Basin , et al ., 1997 ; malinowski et al ., 1998 ; schwarz และ jelkmann , 1998 ; komorowskaet AL , 2010 ) ซึ่งในการศึกษานี้สามหลักของคู่ specificfor aclsv และเชื้อปะทุ 4 คู่เฉพาะสำหรับ aspv (ตาราง S 1 ) weredesigned ตามลำดับที่ระบุสำหรับแต่ละไวรัส availablein เลี้ยงดูและผ่านการทดสอบในห้องทดลองของเรา(ราชกิจจานุเบกษาด้วย)และ thoseprimer ชุดได้รับการออกแบบมาให้มีความเหมือน annealing อุณหภูมิ ( 50 - 58 ◦c ) เชื้อปะทุที่ตั้งค่าเฉพาะ aclsv 52 / aclsv - 53 สำหรับ aclsv (เยอรมัน et al .1990 )และ aspv 370 - F / aspv 370 - R สำหรับ aspvreported ก่อนหน้านี้( menzel et al . 2002 )รวมอยู่ใน theassays ยัง Mainstream )เพียงเท่านั้นที่การตั้งค่าหลักของแต่ละครั้งก็วิเคราะห์โดย compar - isons และ blastn การค้นหา(วัสดุ http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/blast.cgi).supplementary ที่เกี่ยวข้องกับข้อนี้สามารถพบได้ในเวอร์ชั่นออนไลน์ที่ http://dx.doi.org/10.1016/j.jviromet.2013.11.005.2.3