The labeling of nascent transcripts

The labeling of nascent transcripts with BrUTP was performed as described previously [54]. In brief, cells were lysed by addition of saponin (final concentration 0.25 mg/ml; S-4521; Sigma) in PB-BSA (physiological buffer: 100 mM potassium acetate, 30 mM KCl, 10 mM Na2HPO4, 1 mM MgCl2, 1 mM Na2ATP, 1 mM DTT, and 0.2 mM PMSF, pH 7.4 [34] supplemented with 100 mg/ml BSA and 10 U/ml human placental RNAse inhibitor) for 5 min, rinsed twice by PB-BSA, and preincubated in PB-BSA (5 min, 35 °C ). Transcription was initiated by adding a transcription mixture to give final concentrations of 100 μM of ATP, CTP, GTP, BrUTP, and 0.4 mM MgCl2 in PB-BSA and incubated for 10 min at 35 °C to allow incorporation. To stop the reaction cells were rinsed by ice-cold PB-BSA and immediately fixed in 4% PFA in PBS supplemented with 0.5% Triton X-100 for 15 min. BrRNA was immunolabeled using the mouse monoclonal anti-BrdU antibody. The samples were further processed for immunofluorescence as described above.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ติดฉลากใบแสดงผลก่อด้วย BrUTP ทำตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [54] สังเขป เซลล์ถูก lysed โดยเพิ่ม saponin (ความเข้มข้นสุดท้าย 0.25 mg/ml S-4521 ซิกมา) ใน PB-บีเอสเอ (บัฟเฟอร์สรีรวิทยา: 100 มม. acetate โพแทสเซียม 30 mM KCl, Na2HPO4, MgCl2, 1 มม. 10 มม. 1 mM Na2ATP, 1 mM DTT และ 0.2 mM PMSF, pH 7.4 [34] เสริมกับบีเอสเอ 100 mg/ml และ 10 U/ml มนุษย์รกลอก RNAse ผล) สำหรับ 5 นาที rinsed สอง โดยบีเอสเอ PB และ preincubated ใน PB-บีเอสเอ (5 นาที 35 ° C) Transcription เริ่มต้น โดยการเพิ่มส่วนผสมให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ μM 100 ของ ATP, CTP, GTP, BrUTP และ 0.4 mM MgCl2 PB-บีเอสเอใน transcription และ incubated สำหรับ 10 นาทีที่ 35 ° C ให้ประสาน หยุดปฏิกิริยาเซลล์ rinsed โดย PB ฉ่ำบีเอสเอ และแก้ไขทันทีใน 4% รับใน PBS เสริม ด้วย 0.5% 100 X ไตรตั้นสำหรับ 15 นาที BrRNA เป็น immunolabeled ใช้แอนติบอดีโมโนต่อต้าน-BrdU เมาส์ ตัวอย่างถูกเพิ่มเติมประมวลผลสำหรับ immunofluorescence ที่อธิบายข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การติดฉลากของยีนที่ตั้งไข่กับ BrUTP ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [54] ในช่วงสั้น ๆ เซลล์ถูก lysed โดยนอกเหนือจากซาโปนิน (ความเข้มข้นสุดท้าย 0.25 mg / ml; S-4521; ซิกม่า) ใน PB-BSA (บัฟเฟอร์สรีรวิทยา: 100 มิลลิ acetate โพแทสเซียม 30 มิลลิ KCl 10 มิลลิ Na2HPO4 1 มิลลิ MgCl2 1 มิลลิ Na2ATP 1 มิลลิ DTT และ 0.2 มิลลิ PMSF ค่า pH 7.4 [34] เสริมด้วย 100 mg / ml บีเอสเอและ 10 U / ml ยับยั้ง RNase รกมนุษย์) เป็นเวลา 5 นาทีล้างครั้งที่สองโดย PB-BSA และ preinc​​ubated ใน PB- บีเอสเอ (5 นาที, 35 ° C) ถอดความได้ริเริ่มขึ้นโดยการเพิ่มส่วนผสมถอดความที่จะให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 100 ไมครอนของเอทีพี CTP, ฉี่ BrUTP และ 0.4 มิลลิ MgCl2 ใน PB-BSA และบ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 35 องศาเซลเซียสเพื่อให้การรวมตัวกัน เพื่อหยุดปฏิกิริยาเซลล์ถูกล้างด้วยน้ำแข็งเย็น PB-BSA และคงได้ทันทีใน 4% PFA พีบีเอสในการเสริมด้วย 0.5% Triton X-100 สำหรับ 15 นาที BrRNA ถูก immunolabeled ใช้โมโนโคลนอลแอนติบอดีเมาส์ต่อต้าน BrdU กลุ่มตัวอย่างที่ได้รับการดำเนินการต่อไปสำหรับอิมมูโนที่อธิบายข้างต้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แสดงต้นฉบับด้วย brutp ตั้งไข่ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 54 ] ในช่วงสั้น ๆ เซลล์ก็ lysed โดยนอกเหนือจากซาโปนิน ( สุดท้ายความเข้มข้น 0.25 มิลลิกรัมต่อมิลลิลิตร ; s-4521 ; Sigma ) ใน pb-bsa ( ทางสรีรวิทยา : 100 มม. โพแทสเซียมอะซีเตทบัฟเฟอร์ , 30 mm . , 10 mm na2hpo4 1 มม. ชุด 1 มม. na2atp 1 มม. ส่วน PMSF และ 0.2 มม. pH 74 [ 34 ] เติม 100 mg / ml และขนาด 10 U / ml ซึ่งมนุษย์คนไทยเลส ) เป็นเวลา 5 นาที โดย pb-bsa ล้าง 2 ครั้ง และ preincubated ใน pb-bsa ( 5 นาที , 35 ° C ) ถอดความริเริ่มขึ้นโดยการเพิ่มส่วนผสมให้เข้มข้นตามสุดท้าย 100 μ M ATP CTP GTP , , , brutp และ 0.4 มม. ชุดใน pb-bsa บ่มเป็นเวลา 10 นาทีที่ 35 ° C เพื่อให้บริษัทหยุดเซลล์ปฏิกิริยาถูกล้างด้วยน้ำแข็ง pb-bsa เย็นทันทีและถาวรในพีเอฟเอ 4% ใน PBS เสริมด้วย 0.5% Triton X-100 เป็นเวลา 15 นาที brrna คือ immunolabeled โดยใช้เมาส์โมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อต้าน brdu . ตัวอย่างเพิ่มเติมประมวลผลสำหรับวิธีตามที่อธิบายไว้ข้างต้น