- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
if bifidobacterial cells were still
if bifidobacterial cells were still present in the kefir at the end of
fermentation, ten colonies from each condition were randomly picked
in MRS broth and incubated overnight anaerobically at 37 °C. The
strain identity was assayed by PCR using strain-specific primers based
on the pil3 locus for PRL2010 strain (Table 2) (Turroni et al., 2013), as
well as using primers (Table 2) based on previously described sortasedependent
pilus-encoding loci (Foroni et al., 2011) for other microorganisms
used in this study. Similarly, growth of B. bifidum PRL2010 on
kefiran was assayed by cultivation PRL2010 cells previously washed
with PBS on a carbohydrate-freeMRSc containing 0.3% (wt/vol) kefiran
under anaerobic conditions at 37 °C. To monitor the growth performance
of PRL2010, bacterial counts were carried out by deep plating
in MRSc agar following incubation under anaerobic conditions for 8 h,
24 h, 48 h and 72 h at 37 °C. Strain identity was assayed by PCR as
described above. Furthermore, for each time point the pH value was
measured.
2.4. Purification and chemical analysis of kefiran
Three different batches of fermented milk kefir, made by the same
manufacturer, were purchased from the supermarket (stated carbohydrate,
protein, and fat contents were 4%, 3.8% and 4.5%, respectively).
These fermented milks were used to isolate the exopolysaccharide
(EPS) kefiran using a previously described procedure by Burns and coworkers
(Burns et al., 2011). Intensive dialysis was carried out against
ultra-pure water at 4 °C for three days with two changes of water per
day. Finally, the dialyzed samples were frozen at −80 °C and freezedried
in the Freezemobile 12L lyophilizer (VirTis, Thermo-Fisher Scientific,
Madrid, Spain) to obtain the lyophilized power. The protein content
of this powder, as determined by the BCA protein assay kit (Pierce, IL,
USA), was 22.4 ± 5.2%. The kefiran yield, as well as the distribution
of molecular weight and radius of gyration of the polymer, in the
lyophilized powder was determined by means of size exclusion
chromatography (SEC) as previously described (Salazar et al., 2009).
An HPLC system from Waters (Milford, MA, USA) was used, which
was composed of the Alliance 2690 module injector, the Photodiode
Array PDA966 detector, and the Refractive Index RI410 detector.
These detectors were serially coupled to the multiangle laser light
scattering (MALLS) detector Dawn Heleos II (Wyatt Europe GmbH,
Dembach, Germany). Data analysis was achieved by the Astra V
5.3.4.19 software (Wyatt Europe). Then, 10 mg lyophilized powder
was dissolved in 0.1 M NaNO3 and separated by chromatography
using TSK-Gel G3000 PWXL and TSK-Gel G5000 PWXL (Supelco-
Sigma) columns placed in series and protected with a TSK-guard
column. The same solution was used as the mobile phase and the separation
took place at 40 °C at 0.45 ml/min flow rate for up to 60 min.
The kefiran yield was calculated fromthe RI data using the corresponding
regression equations (R2 ≥ 0.9999) obtained from dextran standards
(Fluka-Sigma) of similar size (4.9 × 106 Da and 2.7 × 105 Da).
The PDA detector set at 280 nm was used to check the absence of
protein in the peaks corresponding to kefiran. The weight average
molar mass (Mw) and the radius of gyration (Rw) were directly
measuredwith theMALLS detector and used to calculate the coefficient
ν[ν =(logRw ∕ logMw)].
2.5. Kefir microbiota identification by 16S rRNA gene-amplification,
-sequencing and data analysis
DNA was extracted from kefir samples by acid guanidinium
thiocyanate–phenol–chloroform extraction (Boom et al., 1990; Chirgwin
et al., 1979; Chomczynski and Sacchi, 1987). Partial 16S rRNA gene
sequences were amplified from extracted DNA using primer pair
Probio_Uni and/Probio_Rev, which target the V3 region of the 16S rRNA
gene sequence (Milani et al., 2013a, 2013b). 16S rRNA gene amplification
and amplicon checks were carried out as previously described (Milani
et al., 2013a, 2013b). 16S rRNA gene sequencing was performed using a
fermentation, ten colonies from each condition were randomly picked
in MRS broth and incubated overnight anaerobically at 37 °C. The
strain identity was assayed by PCR using strain-specific primers based
on the pil3 locus for PRL2010 strain (Table 2) (Turroni et al., 2013), as
well as using primers (Table 2) based on previously described sortasedependent
pilus-encoding loci (Foroni et al., 2011) for other microorganisms
used in this study. Similarly, growth of B. bifidum PRL2010 on
kefiran was assayed by cultivation PRL2010 cells previously washed
with PBS on a carbohydrate-freeMRSc containing 0.3% (wt/vol) kefiran
under anaerobic conditions at 37 °C. To monitor the growth performance
of PRL2010, bacterial counts were carried out by deep plating
in MRSc agar following incubation under anaerobic conditions for 8 h,
24 h, 48 h and 72 h at 37 °C. Strain identity was assayed by PCR as
described above. Furthermore, for each time point the pH value was
measured.
2.4. Purification and chemical analysis of kefiran
Three different batches of fermented milk kefir, made by the same
manufacturer, were purchased from the supermarket (stated carbohydrate,
protein, and fat contents were 4%, 3.8% and 4.5%, respectively).
These fermented milks were used to isolate the exopolysaccharide
(EPS) kefiran using a previously described procedure by Burns and coworkers
(Burns et al., 2011). Intensive dialysis was carried out against
ultra-pure water at 4 °C for three days with two changes of water per
day. Finally, the dialyzed samples were frozen at −80 °C and freezedried
in the Freezemobile 12L lyophilizer (VirTis, Thermo-Fisher Scientific,
Madrid, Spain) to obtain the lyophilized power. The protein content
of this powder, as determined by the BCA protein assay kit (Pierce, IL,
USA), was 22.4 ± 5.2%. The kefiran yield, as well as the distribution
of molecular weight and radius of gyration of the polymer, in the
lyophilized powder was determined by means of size exclusion
chromatography (SEC) as previously described (Salazar et al., 2009).
An HPLC system from Waters (Milford, MA, USA) was used, which
was composed of the Alliance 2690 module injector, the Photodiode
Array PDA966 detector, and the Refractive Index RI410 detector.
These detectors were serially coupled to the multiangle laser light
scattering (MALLS) detector Dawn Heleos II (Wyatt Europe GmbH,
Dembach, Germany). Data analysis was achieved by the Astra V
5.3.4.19 software (Wyatt Europe). Then, 10 mg lyophilized powder
was dissolved in 0.1 M NaNO3 and separated by chromatography
using TSK-Gel G3000 PWXL and TSK-Gel G5000 PWXL (Supelco-
Sigma) columns placed in series and protected with a TSK-guard
column. The same solution was used as the mobile phase and the separation
took place at 40 °C at 0.45 ml/min flow rate for up to 60 min.
The kefiran yield was calculated fromthe RI data using the corresponding
regression equations (R2 ≥ 0.9999) obtained from dextran standards
(Fluka-Sigma) of similar size (4.9 × 106 Da and 2.7 × 105 Da).
The PDA detector set at 280 nm was used to check the absence of
protein in the peaks corresponding to kefiran. The weight average
molar mass (Mw) and the radius of gyration (Rw) were directly
measuredwith theMALLS detector and used to calculate the coefficient
ν[ν =(logRw ∕ logMw)].
2.5. Kefir microbiota identification by 16S rRNA gene-amplification,
-sequencing and data analysis
DNA was extracted from kefir samples by acid guanidinium
thiocyanate–phenol–chloroform extraction (Boom et al., 1990; Chirgwin
et al., 1979; Chomczynski and Sacchi, 1987). Partial 16S rRNA gene
sequences were amplified from extracted DNA using primer pair
Probio_Uni and/Probio_Rev, which target the V3 region of the 16S rRNA
gene sequence (Milani et al., 2013a, 2013b). 16S rRNA gene amplification
and amplicon checks were carried out as previously described (Milani
et al., 2013a, 2013b). 16S rRNA gene sequencing was performed using a
0/5000
ถ้าเซลล์ bifidobacterial ยังคงอยู่ใน kefir ที่สิ้นสุดหมัก สุ่มรับของอาณานิคมสิบจากเงื่อนไขแต่ละเงื่อนไขในซุป MRS และ incubated ค้างคืน anaerobically ที่ 37 องศาเซลเซียส ที่ต้องใช้ข้อมูลประจำตัวถูก assayed โดย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์ต้องใช้เฉพาะตามบนโลกัสโพล pil3 สำหรับ PRL2010 ต้องใช้ (ตารางที่ 2) (Turroni et al., 2013), เป็นรวมทั้งใช้ไพรเมอร์ (ตารางที่ 2) ตามเคยอธิบาย sortasedependentรหัส pilus loci (Foroni et al., 2011) สำหรับจุลินทรีย์อื่น ๆใช้ในการศึกษานี้ ในทำนองเดียวกัน การเติบโตของ bifidum เกิด PRL2010 บนkefiran ถูก assayed โดยปลูก PRL2010 เซลล์ก่อนหน้านี้ ล้างด้วย PBS ในการ freeMRSc คาร์โบไฮเดรตมี 0.3% (wt/vol) kefiranภายใต้เงื่อนไขที่ไม่ใช้ออกซิเจนที่ 37 องศาเซลเซียส การตรวจสอบประสิทธิภาพการเจริญเติบโตของ PRL2010 การตรวจนับแบคทีเรียถูกดำเนินการ โดยชุบลึกใน MRSc agar บ่มภายใต้เงื่อนไขไม่ใช้ 8 h ต่อ24 ชม 48 h และ h 72 ที่ 37 องศาเซลเซียส ต้องใช้ข้อมูลประจำตัวถูก assayed โดย PCR เป็นอธิบายไว้ข้างต้น นอกจากนี้ แต่ละจุดเวลา ค่า pH ได้วัด2.4 การฟอกและเคมีวิเคราะห์ kefiranชุดสามแตกต่างกันของร้านม kefir ด้วยเหมือนกันผู้ผลิต ซื้อจากซูเปอร์มาร์เก็ต (ระบุคาร์โบไฮเดรตโปรตีน และไขมันเนื้อหาได้ 4%, 3.8% และ 4.5% ตามลำดับ)Milks หมักเหล่านี้ใช้ในการแยก exopolysaccharideKefiran (EPS) ที่ใช้กระบวนงานอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยการเผาไหม้และผู้ร่วมงาน(ไหม้ et al., 2011) เร่งรัดหน่วยได้ดำเนินการต่อน้ำบริสุทธิ์พิเศษที่ 4 ° C 3 วันมีการเปลี่ยนแปลงสองน้ำวันที่ สุดท้าย มีการแช่แข็งตัวอย่าง dialyzed −80 ° C และ freezedriedใน Freezemobile 12L lyophilizer (VirTis วิทยาศาสตร์เทอร์โม Fisherมาดริด สเปน) อำนาจ lyophilized โปรตีนผงนี้ ตามที่พิจารณา โดยชุดทดสอบโปรตีน BCA (เพียร์ซ ILสหรัฐอเมริกา), เป็น 22.4 ± 5.2% ผลผลิต kefiran ตลอดจนการกระจายน้ำหนักโมเลกุลและรัศมีของ gyration ของพอลิเมอร์ ในการผง lyophilized กำหนด โดยแยกขนาดchromatography (วินาที) ที่เคยอธิบายไว้ (Salazar et al., 2009)ใช้เป็นระบบ HPLC จากน้ำ (ลฟอร์ด MA, USA) ซึ่งถูกอัดพันธมิตร 2690 โม Photodiode ประกอบด้วยเรย์ PDA966 เครื่องตรวจจับ และจับดรรชนี RI410ตรวจจับเหล่านี้ถูกควบคู่กับแสงเลเซอร์ multiangle seriallyจับ scattering (ห้าง) รุ่งอรุณ Heleos II (Wyatt ยุโรป GmbHDembach เยอรมนี) วิเคราะห์ข้อมูลสำเร็จ โดย Astra V5.3.4.19 ซอฟต์แวร์ (Wyatt ยุโรป) แล้ว 10 มก. lyophilized ผงละลายใน 0.1 M NaNO3 และคั่น ด้วย chromatographyใช้ PWXL G3000 เจทีเอสเคทีเอสเคเจ G5000 PWXL (Supelco-คอลัมน์ซิก) อยู่ในชุด และป้องกัน ด้วยการรักษาทีเอสเคคอลัมน์ โซลูชั่นเดียวที่ใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่และแยกเอาสถานที่ 40 ° C ที่อัตราไหล 0.45 มล/นาทีถึง 60 นาทีคำนวณจากผลตอบแทน kefiran ข้อมูล RI ที่ใช้ให้สอดคล้องกับสมการถดถอย (R2 ≥ 0.9999) ได้รับจากมาตรฐานเดกซ์แทรน(Fluka-ซิก) ขนาดใกล้เคียงกัน (4.9 × 106 2.7 × 105 และดาต้า)จับ PDA ที่ 280 nm ใช้ในการตรวจสอบของโปรตีนในแห่งที่สอดคล้องกับ kefiran ค่าเฉลี่ยน้ำหนักสบมวล (Mw) และรัศมีของ gyration (Rw) ได้โดยตรงmeasuredwith theMALLS เครื่องตรวจจับ และใช้ในการคำนวณค่าสัมประสิทธิ์Ν [ν = (logRw ∕ logMw)]2.5 รหัส microbiota kefir โดยยีน 16S rRNA-ขยาย-วิเคราะห์ข้อมูลและจัดลำดับดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่าง kefir โดยกรด guanidiniumสกัด thiocyanate – วาง – คลอโรฟอร์ม (บูมและ al., 1990 Chirgwinร้อยเอ็ด al., 1979 Chomczynski และ Sacchi, 1987) ยีนบางส่วน 16S rRNAลำดับถูกขยายจากดีเอ็นเอที่แยกโดยใช้รองพื้นคู่Probio_Uni และ / Probio_Rev ซึ่งเป้าหมายภาค V3 ของ 16S rRNAลำดับยีน (al. et มิลานิ 2013a, 2013b) 16S rRNA ยีนขยายและเช็ค amplicon ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (มิลานิal. ร้อยเอ็ด 2013a, 2013b) 16S rRNA ยีนลำดับถูกดำเนินการโดยใช้การ
การแปล กรุณารอสักครู่..
ถ้าเซลล์ bifidobacterial ก็ยังคงอยู่ใน kefir ในตอนท้ายของ
การหมักสิบอาณานิคมจากสภาพแต่ละถูกหยิบสุ่ม
ในอาหาร MRS broth และบ่มค้างคืนแบบไม่ใช้อากาศที่อุณหภูมิ 37 ° C
ตัวตนของสายพันธุ์ที่ได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์สายพันธุ์เฉพาะที่ใช้
ในสถานที pil3 สำหรับความเครียด PRL2010 (ตารางที่ 2) (Turroni et al., 2013) เช่น
เดียวกับการใช้ไพรเมอร์ (ตารางที่ 2) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ sortasedependent
Pilus เข้ารหัส loci (Foroni et al., 2011) สำหรับจุลินทรีย์อื่น ๆ
ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ในทำนองเดียวกันการเจริญเติบโตของ B. bifidum PRL2010 ใน
คีเฟอรันได้รับการวิเคราะห์โดยการเพาะปลูกเซลล์ PRL2010 ล้างก่อนหน้านี้
กับพีบีเอสเมื่อวันที่คาร์โบไฮเดรต freeMRSc ที่มี 0.3% (น้ำหนัก / ปริมาตร) คีเฟอรัน
ภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจนที่อุณหภูมิ 37 ° C ในการตรวจสอบการเจริญเติบโต
ของ PRL2010, แบคทีเรียได้ดำเนินการโดยการชุบลึก
ในอาหารเลี้ยงเชื้อ MRSc ต่อไปบ่มภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจนเป็นเวลา 8 ชั่วโมง,
24 ชั่วโมง, 48 ชั่วโมงและ 72 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ตัวตนของสายพันธุ์ที่ได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี PCR เป็น
อธิบายไว้ข้างต้น นอกจากนี้สำหรับแต่ละครั้งชี้ค่าพีเอชได้รับการ
วัด.
2.4 บริสุทธิ์และการวิเคราะห์ทางเคมีของคีเฟอรัน
สามสำหรับกระบวนการที่แตกต่างกันของ kefir นมหมักทำโดยเดียวกัน
ผู้ผลิตที่ซื้อมาจากซูเปอร์มาร์เก็ต (คาร์โบไฮเดรตกล่าว
โปรตีนและไขมันเป็น 4%, 3.8% และ 4.5% ตามลำดับ).
นมหมักเหล่านี้ ถูกนำมาใช้เพื่อแยกสร้าง Exopolysaccharide
(EPS) คีเฟอรันโดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายก่อนหน้านี้โดยเบิร์นส์และเพื่อนร่วมงาน
(เบิร์นส์ et al., 2011) เร่งรัดการฟอกไตได้รับการดำเนินการกับ
น้ำบริสุทธิ์ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลาสามวันสองการเปลี่ยนแปลงของน้ำต่อ
วัน ในที่สุดตัวอย่าง dialyzed ถูกแช่แข็งที่ -80 องศาเซลเซียสและ freezedried
ใน Freezemobile 12L lyophilizer (VirTis, เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์,
มาดริด, สเปน) ที่จะได้รับอำนาจแห้ง ปริมาณโปรตีน
ของผงนี้ตามที่กำหนดโดยชุดทดสอบโปรตีน BCA (เพียร์ซ, อิลลินอยส์,
สหรัฐอเมริกา) เป็น 22.4 ± 5.2% ผลผลิตคีเฟอรันเช่นเดียวกับการกระจาย
น้ำหนักโมเลกุลและรัศมีของการหมุนของพอลิเมอใน
ผงแห้งถูกกำหนดโดยวิธีการของการยกเว้นขนาด
โค (ก.ล.ต. ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (ซัลลาซาร์ et al., 2009).
ระบบ HPLC จากน้ำ (ฟอร์ด, MA, USA) ที่ใช้ซึ่ง
ประกอบด้วยพันธมิตรหัวฉีดโมดูล 2690, ไดโอด
อาร์เรย์ PDA966 ตรวจจับและตรวจจับดัชนีหักเห RI410.
ตรวจจับเหล่านี้ถูกคู่ขนานกับเลเซอร์แสง multiangle
กระเจิง (MALLS) เครื่องตรวจจับ รุ่งอรุณ Heleos II (ไวแอตต์ Europe GmbH,
Dembach, เยอรมนี) การวิเคราะห์ข้อมูลได้สำเร็จโดย Astra V
5.3.4.19 ซอฟแวร์ (ไวแอตต์ยุโรป) จากนั้น 10 มิลลิกรัมผงแห้ง
ก็เลือนหายไปใน 0.1 M NaNO3 และแยกจากกันโดยโค
TSK ใช้เจล G3000 PWXL และ TSK เจล G5000 PWXL (Supelco-
Sigma) คอลัมน์วางในซีรีส์และการป้องกันด้วย TSK ยาม
คอลัมน์ วิธีการแก้ปัญหาเดียวกันถูกใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่และการแยก
เอาสถานที่ 40 ° C ที่ 0.45 มล. / นาทีอัตราการไหลได้ถึง 60 นาที.
ผลผลิตคีเฟอรันที่คำนวณ fromthe ข้อมูล RI ใช้ที่สอดคล้อง
สมการถดถอย (R2 ≥ 0.9999) ที่ได้รับ จากมาตรฐาน dextran
(Fluka-Sigma) ขนาดใกล้เคียงกัน (4.9 × 106 ดาและ 2.7 × 105 ดา).
ตรวจจับ PDA ตั้งไว้ที่ 280 นาโนเมตรถูกใช้ในการตรวจสอบตัวตนของ
โปรตีนในยอดเขาที่สอดคล้องกับคีเฟอรัน น้ำหนักเฉลี่ย
มวลโมเลกุล (MW) และรัศมีของการหมุน (RW) ได้โดยตรง
measuredwith theMALLS ตรวจจับและใช้ในการคำนวณค่าสัมประสิทธิ์
ν [ν = (logRw / logMw)].
2.5 บัตรประจำตัว Kefir microbiota โดย 16S rRNA ยีนขยาย
-sequencing และการวิเคราะห์ข้อมูล
ดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่าง kefir โดย Guanidinium กรด
สกัด thiocyanate-ฟีนอลคลอโรฟอร์ม (Boom, et al, 1990;. Chirgwin
et al, 1979;. Chomczynski และ Sacchi 1987 ) บางส่วน 16S rRNA ยีน
ลำดับถูกขยายจาก DNA ที่สกัดโดยใช้คู่ไพร
Probio_Uni และ / Probio_Rev ซึ่งกำหนดเป้าหมายภูมิภาค V3 ของ 16S rRNA
ยีน (มิลานิ et al., 2013a, 2013b) 16S rRNA ขยายยีน
และการตรวจสอบ amplicon ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (มิลานิ
et al., 2013a, 2013b) ลำดับของยีน 16S rRNA ได้รับการดำเนินการโดยใช้
การหมักสิบอาณานิคมจากสภาพแต่ละถูกหยิบสุ่ม
ในอาหาร MRS broth และบ่มค้างคืนแบบไม่ใช้อากาศที่อุณหภูมิ 37 ° C
ตัวตนของสายพันธุ์ที่ได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์สายพันธุ์เฉพาะที่ใช้
ในสถานที pil3 สำหรับความเครียด PRL2010 (ตารางที่ 2) (Turroni et al., 2013) เช่น
เดียวกับการใช้ไพรเมอร์ (ตารางที่ 2) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ sortasedependent
Pilus เข้ารหัส loci (Foroni et al., 2011) สำหรับจุลินทรีย์อื่น ๆ
ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ในทำนองเดียวกันการเจริญเติบโตของ B. bifidum PRL2010 ใน
คีเฟอรันได้รับการวิเคราะห์โดยการเพาะปลูกเซลล์ PRL2010 ล้างก่อนหน้านี้
กับพีบีเอสเมื่อวันที่คาร์โบไฮเดรต freeMRSc ที่มี 0.3% (น้ำหนัก / ปริมาตร) คีเฟอรัน
ภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจนที่อุณหภูมิ 37 ° C ในการตรวจสอบการเจริญเติบโต
ของ PRL2010, แบคทีเรียได้ดำเนินการโดยการชุบลึก
ในอาหารเลี้ยงเชื้อ MRSc ต่อไปบ่มภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจนเป็นเวลา 8 ชั่วโมง,
24 ชั่วโมง, 48 ชั่วโมงและ 72 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ตัวตนของสายพันธุ์ที่ได้รับการวิเคราะห์โดยวิธี PCR เป็น
อธิบายไว้ข้างต้น นอกจากนี้สำหรับแต่ละครั้งชี้ค่าพีเอชได้รับการ
วัด.
2.4 บริสุทธิ์และการวิเคราะห์ทางเคมีของคีเฟอรัน
สามสำหรับกระบวนการที่แตกต่างกันของ kefir นมหมักทำโดยเดียวกัน
ผู้ผลิตที่ซื้อมาจากซูเปอร์มาร์เก็ต (คาร์โบไฮเดรตกล่าว
โปรตีนและไขมันเป็น 4%, 3.8% และ 4.5% ตามลำดับ).
นมหมักเหล่านี้ ถูกนำมาใช้เพื่อแยกสร้าง Exopolysaccharide
(EPS) คีเฟอรันโดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายก่อนหน้านี้โดยเบิร์นส์และเพื่อนร่วมงาน
(เบิร์นส์ et al., 2011) เร่งรัดการฟอกไตได้รับการดำเนินการกับ
น้ำบริสุทธิ์ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลาสามวันสองการเปลี่ยนแปลงของน้ำต่อ
วัน ในที่สุดตัวอย่าง dialyzed ถูกแช่แข็งที่ -80 องศาเซลเซียสและ freezedried
ใน Freezemobile 12L lyophilizer (VirTis, เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์,
มาดริด, สเปน) ที่จะได้รับอำนาจแห้ง ปริมาณโปรตีน
ของผงนี้ตามที่กำหนดโดยชุดทดสอบโปรตีน BCA (เพียร์ซ, อิลลินอยส์,
สหรัฐอเมริกา) เป็น 22.4 ± 5.2% ผลผลิตคีเฟอรันเช่นเดียวกับการกระจาย
น้ำหนักโมเลกุลและรัศมีของการหมุนของพอลิเมอใน
ผงแห้งถูกกำหนดโดยวิธีการของการยกเว้นขนาด
โค (ก.ล.ต. ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (ซัลลาซาร์ et al., 2009).
ระบบ HPLC จากน้ำ (ฟอร์ด, MA, USA) ที่ใช้ซึ่ง
ประกอบด้วยพันธมิตรหัวฉีดโมดูล 2690, ไดโอด
อาร์เรย์ PDA966 ตรวจจับและตรวจจับดัชนีหักเห RI410.
ตรวจจับเหล่านี้ถูกคู่ขนานกับเลเซอร์แสง multiangle
กระเจิง (MALLS) เครื่องตรวจจับ รุ่งอรุณ Heleos II (ไวแอตต์ Europe GmbH,
Dembach, เยอรมนี) การวิเคราะห์ข้อมูลได้สำเร็จโดย Astra V
5.3.4.19 ซอฟแวร์ (ไวแอตต์ยุโรป) จากนั้น 10 มิลลิกรัมผงแห้ง
ก็เลือนหายไปใน 0.1 M NaNO3 และแยกจากกันโดยโค
TSK ใช้เจล G3000 PWXL และ TSK เจล G5000 PWXL (Supelco-
Sigma) คอลัมน์วางในซีรีส์และการป้องกันด้วย TSK ยาม
คอลัมน์ วิธีการแก้ปัญหาเดียวกันถูกใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่และการแยก
เอาสถานที่ 40 ° C ที่ 0.45 มล. / นาทีอัตราการไหลได้ถึง 60 นาที.
ผลผลิตคีเฟอรันที่คำนวณ fromthe ข้อมูล RI ใช้ที่สอดคล้อง
สมการถดถอย (R2 ≥ 0.9999) ที่ได้รับ จากมาตรฐาน dextran
(Fluka-Sigma) ขนาดใกล้เคียงกัน (4.9 × 106 ดาและ 2.7 × 105 ดา).
ตรวจจับ PDA ตั้งไว้ที่ 280 นาโนเมตรถูกใช้ในการตรวจสอบตัวตนของ
โปรตีนในยอดเขาที่สอดคล้องกับคีเฟอรัน น้ำหนักเฉลี่ย
มวลโมเลกุล (MW) และรัศมีของการหมุน (RW) ได้โดยตรง
measuredwith theMALLS ตรวจจับและใช้ในการคำนวณค่าสัมประสิทธิ์
ν [ν = (logRw / logMw)].
2.5 บัตรประจำตัว Kefir microbiota โดย 16S rRNA ยีนขยาย
-sequencing และการวิเคราะห์ข้อมูล
ดีเอ็นเอที่สกัดจากตัวอย่าง kefir โดย Guanidinium กรด
สกัด thiocyanate-ฟีนอลคลอโรฟอร์ม (Boom, et al, 1990;. Chirgwin
et al, 1979;. Chomczynski และ Sacchi 1987 ) บางส่วน 16S rRNA ยีน
ลำดับถูกขยายจาก DNA ที่สกัดโดยใช้คู่ไพร
Probio_Uni และ / Probio_Rev ซึ่งกำหนดเป้าหมายภูมิภาค V3 ของ 16S rRNA
ยีน (มิลานิ et al., 2013a, 2013b) 16S rRNA ขยายยีน
และการตรวจสอบ amplicon ได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (มิลานิ
et al., 2013a, 2013b) ลำดับของยีน 16S rRNA ได้รับการดำเนินการโดยใช้
การแปล กรุณารอสักครู่..
ถ้า bifidobacterial เซลล์ยังปัจจุบันในคีเฟอร์ที่ส่วนท้ายของ
หมักสิบอาณานิคมจากแต่ละภาพถูกเลือกแบบสุ่ม
ใน MRS broth บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศา คืนพ
เมื่อยตัวด้วยวิธี PCR โดยใช้ไพร์เมอร์จำเพาะซีรั่มสายพันธุ์ตาม
บน pil3 ความเชื่อสำหรับ prl2010 สายพันธุ์ ( ตารางที่ 2 ) ( turroni และ al . , 2013 ) ,
รวมทั้งการใช้ไพรเมอร์ ( ตารางที่ 2 ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ sortasedependent
ขนการเข้ารหัสโลไซ ( foroni et al . , 2011 )
จุลินทรีย์อื่น ๆที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ในทำนองเดียวกัน การเติบโตของ พ. bifidum prl2010 บน
คีเฟอแรนซีรั่มโดยการปลูก prl2010 เซลล์ก่อนหน้านี้ซัก
กับ PBS ในคาร์โบไฮเดรต freemrsc ที่มี 0.3% ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) คีเฟอแรน
ภายใต้เงื่อนไข anaerobic ที่ 37 องศาเพื่อตรวจสอบการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ prl2010
, ดําเนินการโดยลึกชุบ
ใน mrsc วุ้นตามระยะเวลาภายใต้เงื่อนไข anaerobic 8 H ,
24 ชั่วโมง , 48 ชั่วโมงและ 72 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศา เมื่อยตัวซีรั่มโดยวิธี PCR เป็น
ที่อธิบายข้างต้น นอกจากนี้ สำหรับแต่ละจุดเวลา ค่า pH ที่วัดได้
.
2.4 . การวิเคราะห์ทางเคมีของคีเฟอแรน
และบำบัดน้ำเสียสามชุดที่แตกต่างกันของหมักคีเฟอร์นม ที่ทำโดยผู้ผลิตเดียวกัน
, ซื้อจากซุปเปอร์มาร์เก็ต ( ระบุคาร์โบไฮเดรต โปรตีนและไขมันเนื้อหา
, 4 % , 3.8% และ 4.5% ตามลำดับ )
เหล่านี้ยังถูกใช้เพื่อแยกหมักใช้
( EPS ) โดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยคีเฟอแรนเผาไหม้และเพื่อนร่วมงาน
( เบิร์น et al . , 2011 )ฟอกเลือดเข้มข้นดำเนินการกับ
อัลตร้าน้ำบริสุทธิ์ที่ 4 ° C เป็นเวลาสามวันกับสองการเปลี่ยนแปลงของน้ำต่อวัน
. ในที่สุดก็ผ่านจำนวนแช่แข็งที่อุณหภูมิ 80 องศา C และ บริษัท เวสเทิร์น ฟรีซดราย
ในไลโอฟิไลเซอร์ 12L freezemobile ( เวอร์ติส , เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์
มาดริด , สเปน ) เพื่อให้ได้โปรตีน พลังงาน ปริมาณโปรตีน
ผงนี้ ตามที่กำหนดโดย BCA โปรตีนต่อชุด ( เพียร์ซ , IL ,
สหรัฐอเมริกา ) เท่ากับ 22.4 ± 5.2% ส่วนคีเฟอแรน ให้ผลเช่นเดียวกับการกระจาย
ของโมเลกุล และหมุนเป็นวงกลมรัศมีของพอลิเมอร์ใน
แห้งผงถูกกำหนดโดยวิธีโครมาโตกราฟีขนาดยกเว้น
( วินาที ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ซาลา et al . , 2009 ) .
ระบบ HPLC จากน้ำ ( Milford , MA , USA ) ใช้ ซึ่งประกอบด้วยพันธมิตร
0
ชุดหัวฉีด , โฟโตไดเรย์ตรวจจับ pda966 และดรรชนีหักเห ri410 เครื่องตรวจจับ เครื่องตรวจจับเหล่านี้เป็นคู่
ไป multiangle เลเซอร์แสงกระเจิง ( ห้างสรรพสินค้า ) เครื่องตรวจจับรุ่งอรุณ heleos II ( Wyatt ยุโรป GmbH ,
dembach , เยอรมัน ) การวิเคราะห์ข้อมูลโดย Astra V
5.3.4.19 ซอฟต์แวร์ ( Wyatt ยุโรป ) จากนั้น 10 มก. โปรตีนผง
ละลายใน 0.1 M NaNO3 และแยกโดยโครมาโตกราฟี
ใช้เจล g3000 pwxl จุ๊จุ๊และเจล g5000 pwxl ( supelco -
Sigma ) คอลัมน์อยู่ในชุดและการป้องกันด้วยจุ๊องครักษ์
คอลัมน์ โซลูชั่นเดียวกันถูกใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่และแยก
เอาสถานที่ที่ 40 ° C ที่ 0.45 มิลลิลิตร / นาทีอัตราการไหลได้ถึง 60 นาที คำนวณจากผลผลิต
คีเฟอแรน ริข้อมูล โดยใช้สมการที่ ( R2
≥ทำการ ) ที่ได้จากมาตรฐานเดกซ์แตรน( fluka Sigma ) ขนาดใกล้เคียง ( 4.9 × 106 ดาและ 2.7 × 105 ดา ) .
PDA เครื่องตรวจจับไว้ที่ 280 nm ถูกใช้เพื่อตรวจสอบการขาดงานของ
โปรตีนในหุบที่สอดคล้องกับคีเฟอแรน . น้ำหนักเฉลี่ย
มวลโมเลกุล ( MW ) และรัศมีไจเรชัน ( RW ) โดยตรง
measuredwith themalls ตรวจจับและใช้เพื่อคำนวณค่า
ν [ ν = ( logrw The C button of the calculator logmw ) ] .
2.5คีเฟอร์ไมโครไบโ ้าตัว โดยเบส 16S rRNA ยีนขยาย
-
และลำดับข้อมูลการวิเคราะห์ดีเอ็นเอ สกัดจากบัวหิมะ จำนวนกรดไทโอไซยาเนต ( ฟีนอลและ guanidinium
คลอโรฟอร์มสกัด ( บูม et al . , 1990 ; chirgwin
et al . , 1979 ; chomczynski และ sacchi , 1987 ) ลำดับเบส 16S rRNA ยีนบางส่วนถูกสกัดดีเอ็นเอจากการเพิ่ม
probio_uni โดยใช้ไพรเมอร์คู่และ probio_rev / ,ซึ่งเป้าหมายเขตของ 16S rRNA V3
ยีน ลำดับ ( milani et al . , ที่มีมากกว่า 2013b , ) เบส 16S rRNA ยีน (
และการตรวจสอบและได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( milani
et al . , ที่มีมากกว่า 2013b , ) ลำดับเบส 16S rRNA ยีนมีการใช้
หมักสิบอาณานิคมจากแต่ละภาพถูกเลือกแบบสุ่ม
ใน MRS broth บ่มที่อุณหภูมิ 37 องศา คืนพ
เมื่อยตัวด้วยวิธี PCR โดยใช้ไพร์เมอร์จำเพาะซีรั่มสายพันธุ์ตาม
บน pil3 ความเชื่อสำหรับ prl2010 สายพันธุ์ ( ตารางที่ 2 ) ( turroni และ al . , 2013 ) ,
รวมทั้งการใช้ไพรเมอร์ ( ตารางที่ 2 ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ sortasedependent
ขนการเข้ารหัสโลไซ ( foroni et al . , 2011 )
จุลินทรีย์อื่น ๆที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้ ในทำนองเดียวกัน การเติบโตของ พ. bifidum prl2010 บน
คีเฟอแรนซีรั่มโดยการปลูก prl2010 เซลล์ก่อนหน้านี้ซัก
กับ PBS ในคาร์โบไฮเดรต freemrsc ที่มี 0.3% ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) คีเฟอแรน
ภายใต้เงื่อนไข anaerobic ที่ 37 องศาเพื่อตรวจสอบการเจริญเติบโตของจุลินทรีย์ prl2010
, ดําเนินการโดยลึกชุบ
ใน mrsc วุ้นตามระยะเวลาภายใต้เงื่อนไข anaerobic 8 H ,
24 ชั่วโมง , 48 ชั่วโมงและ 72 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศา เมื่อยตัวซีรั่มโดยวิธี PCR เป็น
ที่อธิบายข้างต้น นอกจากนี้ สำหรับแต่ละจุดเวลา ค่า pH ที่วัดได้
.
2.4 . การวิเคราะห์ทางเคมีของคีเฟอแรน
และบำบัดน้ำเสียสามชุดที่แตกต่างกันของหมักคีเฟอร์นม ที่ทำโดยผู้ผลิตเดียวกัน
, ซื้อจากซุปเปอร์มาร์เก็ต ( ระบุคาร์โบไฮเดรต โปรตีนและไขมันเนื้อหา
, 4 % , 3.8% และ 4.5% ตามลำดับ )
เหล่านี้ยังถูกใช้เพื่อแยกหมักใช้
( EPS ) โดยใช้ขั้นตอนที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ โดยคีเฟอแรนเผาไหม้และเพื่อนร่วมงาน
( เบิร์น et al . , 2011 )ฟอกเลือดเข้มข้นดำเนินการกับ
อัลตร้าน้ำบริสุทธิ์ที่ 4 ° C เป็นเวลาสามวันกับสองการเปลี่ยนแปลงของน้ำต่อวัน
. ในที่สุดก็ผ่านจำนวนแช่แข็งที่อุณหภูมิ 80 องศา C และ บริษัท เวสเทิร์น ฟรีซดราย
ในไลโอฟิไลเซอร์ 12L freezemobile ( เวอร์ติส , เทอร์โมฟิชเชอร์ทางวิทยาศาสตร์
มาดริด , สเปน ) เพื่อให้ได้โปรตีน พลังงาน ปริมาณโปรตีน
ผงนี้ ตามที่กำหนดโดย BCA โปรตีนต่อชุด ( เพียร์ซ , IL ,
สหรัฐอเมริกา ) เท่ากับ 22.4 ± 5.2% ส่วนคีเฟอแรน ให้ผลเช่นเดียวกับการกระจาย
ของโมเลกุล และหมุนเป็นวงกลมรัศมีของพอลิเมอร์ใน
แห้งผงถูกกำหนดโดยวิธีโครมาโตกราฟีขนาดยกเว้น
( วินาที ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ซาลา et al . , 2009 ) .
ระบบ HPLC จากน้ำ ( Milford , MA , USA ) ใช้ ซึ่งประกอบด้วยพันธมิตร
0
ชุดหัวฉีด , โฟโตไดเรย์ตรวจจับ pda966 และดรรชนีหักเห ri410 เครื่องตรวจจับ เครื่องตรวจจับเหล่านี้เป็นคู่
ไป multiangle เลเซอร์แสงกระเจิง ( ห้างสรรพสินค้า ) เครื่องตรวจจับรุ่งอรุณ heleos II ( Wyatt ยุโรป GmbH ,
dembach , เยอรมัน ) การวิเคราะห์ข้อมูลโดย Astra V
5.3.4.19 ซอฟต์แวร์ ( Wyatt ยุโรป ) จากนั้น 10 มก. โปรตีนผง
ละลายใน 0.1 M NaNO3 และแยกโดยโครมาโตกราฟี
ใช้เจล g3000 pwxl จุ๊จุ๊และเจล g5000 pwxl ( supelco -
Sigma ) คอลัมน์อยู่ในชุดและการป้องกันด้วยจุ๊องครักษ์
คอลัมน์ โซลูชั่นเดียวกันถูกใช้เป็นเฟสเคลื่อนที่และแยก
เอาสถานที่ที่ 40 ° C ที่ 0.45 มิลลิลิตร / นาทีอัตราการไหลได้ถึง 60 นาที คำนวณจากผลผลิต
คีเฟอแรน ริข้อมูล โดยใช้สมการที่ ( R2
≥ทำการ ) ที่ได้จากมาตรฐานเดกซ์แตรน( fluka Sigma ) ขนาดใกล้เคียง ( 4.9 × 106 ดาและ 2.7 × 105 ดา ) .
PDA เครื่องตรวจจับไว้ที่ 280 nm ถูกใช้เพื่อตรวจสอบการขาดงานของ
โปรตีนในหุบที่สอดคล้องกับคีเฟอแรน . น้ำหนักเฉลี่ย
มวลโมเลกุล ( MW ) และรัศมีไจเรชัน ( RW ) โดยตรง
measuredwith themalls ตรวจจับและใช้เพื่อคำนวณค่า
ν [ ν = ( logrw The C button of the calculator logmw ) ] .
2.5คีเฟอร์ไมโครไบโ ้าตัว โดยเบส 16S rRNA ยีนขยาย
-
และลำดับข้อมูลการวิเคราะห์ดีเอ็นเอ สกัดจากบัวหิมะ จำนวนกรดไทโอไซยาเนต ( ฟีนอลและ guanidinium
คลอโรฟอร์มสกัด ( บูม et al . , 1990 ; chirgwin
et al . , 1979 ; chomczynski และ sacchi , 1987 ) ลำดับเบส 16S rRNA ยีนบางส่วนถูกสกัดดีเอ็นเอจากการเพิ่ม
probio_uni โดยใช้ไพรเมอร์คู่และ probio_rev / ,ซึ่งเป้าหมายเขตของ 16S rRNA V3
ยีน ลำดับ ( milani et al . , ที่มีมากกว่า 2013b , ) เบส 16S rRNA ยีน (
และการตรวจสอบและได้ดำเนินการตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( milani
et al . , ที่มีมากกว่า 2013b , ) ลำดับเบส 16S rRNA ยีนมีการใช้
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- พ่อของฉันเป็นคนเดินสายไฟภายในบ้านนี้เอง
- What type of phone is that
- โทรศัพท์เครื่องเดิม
- เพื่อให้การทำงานเป็นไปอย่างต่อเนื่อง
- กุญแจวางอยู่ใตีกล่องสีน้ำเงิน
- Remaining 3 days, Do you will come to Th
- The ATM accidentally gave you too much
- เริ่มงาน
- . Be sure to touch the previously inocul
- ขี่ม้าริมชายหาด
- Hi my honey how are you sorry I just got
- เจ้าหน้าที่ประสานงาน
- schön, dass Du mich von Flughafen abhole
- You must bring a glass tube join to a tu
- Normally, I would always pay on time. bu
- ด้านซ้าย
- มีศิลปะที่น่าชม
- 79″ ULTRA Touch whiteboard can be placed
- Warum war dunkel
- ข้อมูลด้านล่างคือสิ่งที่ฉันค้นพบ
- stormtorrential rainshowerflooddrizzle
- จึงทำให้ฉันจิตนาการได้หลายแบบ
- spoons
- ฉันแอบชอบเพื่อนคนหนึ่ง
