RESULTSPurification ofRV 3' (+)-SL

RESULTS
Purification ofRV 3' (+)-SL RNA Binding Protein. The RV 3'
(+)-SL RNA binding protein was fractionated from Vero 76
cells as described above. After fractionation of the binding
activity by rHPLC and SDS/PAGE, a major protein species of
=60 kDa was observed upon silver staining (Fig. 2A, lane 1).
Protein from the active rHPLC fraction (=100 ng) was incubated
with radiolabeled 3' (+)-SL RNA and UV irradiated to
induce covalent crosslinking. The radiolabeled RNA was associated
only with the 60-kDa protein, indicating it was the RNA
binding protein of interest (Fig. 2A, lane 2). To test the specificity
of the 60-kDa protein for the 3' (+)-SL RNA, we performed
an RNA gel retardation assay. The protein (=100 ng)
formed a specific complex with the 32P-labeled 3' (+)-SL RNA
(Fig. 2B, lane 1). A 25- to 75-fold molar excess of unlabeled 3'
(+)-SL RNA was sufficient to completely block the binding
activity (Fig. 2B, lanes 2 and 3, respectively). Similar concentrations
ofunrelated RNAs [globin and poly (I)-poly (C)] did not
affect the binding activity (data not shown). However, a large

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลการฟอก ofrv
3 '() sl RNA โปรตีน RV 3 '
() sl RNA โปรตีนเป็นส่วนที่เหลือจาก vero 76
เซลล์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น หลังจากแยกของกิจกรรมที่มีผลผูกพัน
โดย rhplc และ sds / หน้าโปรตีนชนิดที่สำคัญของ
= 60 kda พบกับการย้อมสีเงิน (รูปที่ 2a เลน 1).
โปรตีนจากเศษ rhplc ที่ใช้งาน (= 100 ng) ถูก บ่ม
ด้วยรังสี RNA 3 '() sl และยูวีฉายรังสีที่จะก่อให้เกิดการเชื่อมขวาง
โควาเลนต์ RNA รังสีมีความสัมพันธ์
เท่านั้นที่มีโปรตีน 60 kda แสดงให้เห็นว่ามันเป็นอาร์เอ็นเอโปรตีน
ผูกพันที่น่าสนใจ (รูปที่ 2a เลน 2) เพื่อทดสอบความจำเพาะ
ของโปรตีน 60 kda สำหรับ RNA 3 '() sl เราดำเนิน
อาร์เอ็นเอเจลชะลอการวิเคราะห์ โปรตีน (= 100 ng)
ที่เกิดขึ้นมีความซับซ้อนที่เฉพาะเจาะจงกับ 32P ป้​​าย 3 '() sl RNA
(รูปที่ 2b เลน 1) 25 - ส่วนเกินกรามถึง 75 เท่าของที่ไม่มีป้ายกำกับ RNA 3 '
() sl ก็เพียงพอที่จะป้องกันอย่างสมบูรณ์ผูกพัน
กิจกรรม (รูปที่ 2b เลนที่ 2 และ 3 ตามลำดับ) ความเข้มข้นที่คล้ายกัน
ofunrelated RNAs [globin และโพลี (i) โพลี (c)] ไม่ได้ส่งผลกระทบต่อ
กิจกรรมที่มีผลผูกพัน (ไม่ได้แสดงข้อมูล) แต่มีขนาดใหญ่

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผล
ofRV (3)ฟอก-โปรตีนการผูกอาร์เอ็นเอ SL RV 3
()-SL อาร์เอ็นเอโปรตีนรวมที่แบ่งจาก Vero 76
เซลล์ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น หลังจากการแยกส่วนของการรวม
กิจกรรม โดย rHPLC และ SDS/หน้า ชนิดของโปรตีนที่สำคัญ
= 60 kDa ที่สังเกตเมื่อย้อมสีเงิน (Fig. 2A, 1 เลน) .
โปรตีนจากเศษส่วน rHPLC ใช้งานอยู่ (= 100 ng) ถูก incubated
ด้วย radiolabeled 3' ()-อาร์เอ็นเอ SL และ UV irradiated การ
covalent crosslinking ก่อให้เกิดการ อาร์เอ็นเอ radiolabeled เชื่อมโยง
ด้วยโปรตีน 60 kDa บ่งชี้ว่า มีอาร์เอ็นเอ
ผูกโปรตีนน่าสนใจ (Fig. 2A, 2 เลน) เพื่อทดสอบการ specificity
โปรตีน 60 kDa ในแบบ(3)-อาร์เอ็นเอ SL เราทำ
เป็นอาร์เอ็นเอเจลชะลอการวิเคราะห์ โปรตีน (= 100 ng)
เกิดขึ้นเฉพาะที่ซับซ้อน ด้วย(ที่ป้าย 32P 3')-อาร์เอ็นเอ SL
(Fig. 2B เลน 1) 25 - การ 75 - fold สบเกินของเพียง 3'
()-อาร์เอ็นเอ SL ก็เพียงพอเพื่อบล็อคการรวมอย่างสมบูรณ์
กิจกรรม (Fig. 2B ถนนหนทางที่ 2 และ 3 ตามลำดับ) ความเข้มข้นคล้าย
ofunrelated RNAs [globin และโพลี (I) -โพลี (C)] ไม่
ผลรวมกิจกรรม (ข้อมูลไม่แสดง) อย่างไรก็ตาม ขนาดใหญ่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผล ofrv
ทำน้ำบริสุทธิ์ 3 '() - C rna โปรตีนมีผลผูกพัน RV 3 '
() - C rna โปรตีนมีผลผูกพันเป็น fractionated จาก Vero Beach - Oceanside 76
เซลล์เช่นที่อธิบายไว้ข้างต้น. หลังจากโครงการขยายกำลังของกิจกรรมที่มีผลผูกพันทาง
ซึ่งจะช่วยโดยหน้าเซิร์ฟเวอร์ SDS / rhplc สายพันธุ์และโปรตีนสำคัญของ kda
= 60 พบว่าเมื่อสีเงินเกิดรอยเปื้อนควร(รูปที่ 2 ซอย 1 )..
โปรตีนจากเศษ rhplc ใช้งานอยู่(ไนจีเรีย= 100 )เป็น incubated
พร้อมด้วย crosslinking covalent radiolabeled 3 '() - C rna และ UV irradiated เพื่อ
ซึ่งจะช่วยจูงใจให้. rna radiolabeled
ซึ่งจะช่วยให้มีความเกี่ยวข้องเท่านั้นพร้อมด้วย 60 - โปรตีน kda ที่แสดงถึงมันเป็น rna
โปรตีนมีผลผูกพันของดอกเบี้ย(รูปที่ 2 ซอย 2 ) การทดสอบลักษณะเฉพาะเจาะจง
ของ 60 - โปรตีน kda สำหรับ 3 '() - C rna ที่เราดำเนินการสอบถ่วงเจล
ซึ่งจะช่วยให้ rna โปรตีนที่(= 100 NG )
รูปคอมเพล็กซ์เฉพาะที่พร้อมด้วย 32 P - มีข้อความ 3 '() - C rna
(รูปที่ ช่องทางเดินรถ 2 B 1 ) 25 - ที่มากเกินไปกรามที่ใช้เคี้ยว 75 เท่าของไม่ 3 '
() - C rna ก็เพียงพอที่จะบล็อกมีผลผูกพัน
กิจกรรม(รูปที่อย่างสมบรูณ์แบบ 2 b ช่อง 2 และ 3 ตามลำดับ) ความเข้มข้นความเหมือน
ofunrelated rnas [ globin และ Poly ( i ) - Poly ( C )]ไม่
ซึ่งจะช่วยส่งผลต่อการทำงานของปุ่มลัด(ข้อมูลไม่ได้แสดงไว้) แต่ถึงอย่างไรก็ตามขนาดใหญ่