Lactococcus lactis is a lactic acid

Lactococcus lactis is a lactic acid bacterium used in the dairy industry to produce lactic acid and to synthesize various minor fermentation compounds that contribute to flavor development. The species has already acquired the status of generally recognized as safe (GRAS), and when incorporated into food products, it is frequently exposed to different stress conditions, such as those induced by temperature, salt, acid, and oxidative species. Much effort has been made to overcome these stress problems in lactic acid bacteria, and this has involved the application of different strategies, such as the use of oxygen-impermeable containers, microencapsulation (15), addition of nutrients, use of stress-resistant strains (46), and preincubation under sublethal stress conditions (14, 15, 43). Molecular genetic and proteomic studies have indicated the involvement of some genes in the stress responses of lactic acid bacteria. These include the genes for the molecular chaperones GroESL and DnaK (18, 43, 54), methionine sulfoxide reductase (55), and F1Fo-ATPase (33), which are expressed in response to heat, oxygen, and acid stress, respectively.

Heat shock proteins (HSPs), which are also known as molecular chaperones, are induced when cells are exposed to environmental stresses (35, 40). These proteins are involved in the protection of other proteins from denaturation and the reactivation of denatured or aggregated proteins. DnaK, an HSP70 homolog in bacteria, is believed to serve as a “cellular thermometer” that transduces signals to other cellular factors in response to an increase in temperature (11). Although hsp70 genes are widely conserved in all kingdoms, with the exception of some archaea, extensive functional studies have been carried out mainly with Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli, and, more recently, Bacillus subtilis (25, 42, 45). Research on E. coli molecular chaperones has revealed that DnaK functions in cooperation with DnaJ and GrpE and that this complex plays a significant role in the refolding of thermally damaged proteins, besides its role in assisting in the folding of nascent protein chains under normal growth conditions (7-10, 20, 30, 47, 57). In vitro analysis revealed that DnaK requires ATP for its chaperone activity and that this activity is regulated by DnaJ and GrpE (34). In addition, this complex also participates in ATP-dependent proteolysis in the cell (37). It has also been reported that L. lactis, similar to other bacteria, exhibits a heat shock response in which molecular chaperones play central roles (2, 29, 56). Previously, GroESL-overproducing L. lactis was reported to show improved tolerance to stresses induced by heat (54°C for 30 min), salt (5 M NaCl for 1 h), and solvent (0.5% butanol) (16). Fiocco et al. (18) also reported improved adaptation to heat and cold and tolerance to solvent in Lactobacillus plantarum by overproduction of small HSPs. Sugimoto et al. (48) earlier reported that the aggregation of proteins induced by 5% (0.86 M) NaCl could be suppressed remarkably by the overproduction of Tetragenococcus halophilus DnaK in E. coli. However, they did not further their studies by using their transformants in fermentation setups. Tomas et al. (52) reported that the overexpression of groESL in Clostridium acetobutylicum resulted in 38% and 30% increases in acetone and butanol production, respectively, relative to that in the plasmid control strain during pH-controlled glucose fed-batch acetone-butanol fermentation. In comparison to the plasmid-controlled strain, the groESL-overexpressing strain also showed increased tolerance to butanol. However, the effects of DnaK overproduction on cell growth and fermentation in lactic acid bacteria are still unclear.

In this study, we constructed an E. coli dnaK (dnaKEco)-expressing L. lactis NZ9000 strain (NZ-EDnaK) that exhibited improved tolerance to stresses induced by salt (3% NaCl), acid (0.5% lactic acid), solvent (5% ethanol), and heat (40°C). Most importantly, we found that the lactic acid fermentation efficiency of NZ-EDnaK was greatly improved at high temperature (40°C). To the best of our knowledge, this is the first report that describes the multiple positive effects of heterologous DnaK production on stress tolerance and lactic acid fermentation in lactic acid bacteria.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

Lactococcus lactis เป็นแบคทีเรียกรดแลกติกที่ใช้ในอุตสาหกรรมนมใน การผลิตกรดแลคติ และสังเคราะห์สารหมักรองต่าง ๆ ที่เกี่ยวข้องกับการพัฒนารสชาติ พันธุ์ได้มาแล้วสถานะของโดยทั่วไปรู้จักเป็นเซฟ (ดิกราส์), และเมื่อรวมอยู่ในผลิตภัณฑ์อาหาร มันมักสัมผัสกับสภาพความเครียดแตกต่างกัน เช่นที่เกิดจากอุณหภูมิ เกลือ กรด และ oxidative พันธุ์ ได้ทำความพยายามมากเพื่อเอาชนะปัญหาความเครียดเหล่านี้ในแบคทีเรียกรดแลกติก และได้เกี่ยวข้องกับการประยุกต์ใช้กลยุทธ์ที่แตกต่างกัน เช่นการใช้ภาชนะบรรจุที่ผ่านของออกซิเจน microencapsulation (15) เพิ่มสารอาหาร สายพันธุ์ทนทานต่อความเครียด (46), และ preincubation ภายใต้เงื่อนไขความเครียด sublethal (14, 15, 43) โมเลกุลทางพันธุกรรมและ proteomic การศึกษาได้ระบุมีส่วนร่วมของยีนบางอย่างในการตอบสนองความเครียดของแบคทีเรียกรดแลกติก ซึ่งรวมถึงตัวยีนสำหรับ chaperones โมเลกุล GroESL และ DnaK (18, 43, 54), methionine sulfoxide reductase (55), และ F1Fo-ATPase (33), ซึ่งจะแสดงตอบสนองต่อความร้อน ออกซิเจน และความ เครียดกรด ตามลำดับความร้อนช็อกโปรตีน (HSPs), ซึ่งจะเรียกอีกอย่างว่า chaperones โมเลกุล จะเกิดเมื่อเซลล์กำลังเผชิญกับความเครียดด้านสิ่งแวดล้อม (35, 40) โปรตีนเหล่านี้มีส่วนร่วมในการคุ้มครองของโปรตีนอื่น ๆ จาก denaturation และเปิดใช้งานใหม่ของโปรตีน denatured หรือรวม DnaK เป็น homolog HSP70 ในแบคทีเรีย เชื่อกันว่าเป็น "เซลล์ปรอทวัดอุณหภูมิ" ที่ transduces สัญญาณกับปัจจัยอื่น ๆ โทรศัพท์มือถือในการตอบสนองการเพิ่มขึ้นของอุณหภูมิ (11) แม้ว่ายีน hsp70 มีแพร่หลายอยู่ในอาณาจักรทั้งหมด ยกเว้นอาร์เคียบาง ศึกษาการทำงานอย่างละเอียดมีการดำเนินการให้สำเร็จส่วนใหญ่กับ Saccharomyces cerevisiae, Escherichia coli และ เพิ่มเติมล่าสุด คัด subtilis (25, 42, 45) วิจัยใน E. coli โมเลกุล chaperones ได้เปิดเผยว่า DnaK ทำงานร่วมกับ DnaJ และ GrpE และที่ ซับซ้อนมีบทบาทสำคัญในการ refolding ของวิลเลียมแพเสียหาย นอกเหนือจากบทบาทของมันในการให้ความช่วยเหลือในการพับของโซ่โปรตีนก่อสภาวะเจริญเติบโตปกติ (7-10, 20, 30, 47, 57) เครื่องมือวิเคราะห์เปิดเผยว่า DnaK ต้องการ ATP สำหรับกิจกรรมของ chaperone และว่า กิจกรรมนี้จะถูกกำหนด โดย DnaJ และ GrpE (34) นอกจากนี้ คอมเพล็กซ์นี้ยังเข้าร่วมใน proteolysis ขึ้นอยู่กับ ATP ในเซลล์ (37) มันยังได้รายงานว่า L. lactis คล้ายกับแบคทีเรียอื่น ๆ การจัดแสดงการตอบสนองไล่ความร้อนที่โมเลกุล chaperones เล่นบทบาทศูนย์กลางที่ (2, 29, 56) ก่อนหน้านี้ GroESL overproducing L. lactis เป็นรายงานที่แสดงการปรับปรุงค่าเผื่อความเครียดที่เกิดจากความร้อน (54° C สำหรับ 30 นาที), เกลือ (5 M NaCl สำหรับ 1 h), และตัวทำละลาย (บิวทานอ 0.5%) (16) Fiocco et al. (18) ยังรายงานการปรับปรุงให้ร้อน และเย็นและยอมรับกับตัวทำละลายเป็นแลคโตบาซิลลัส plantarum โดย overproduction ของเล็ก HSPs. Sugimoto et al. (48) ก่อนหน้านี้รายงานว่า รวมของโปรตีนเกิดจาก 5% (0.86 M) สามารถระงับ NaCl อย่างยิ่ง โดย overproduction ของ halophilus Tetragenococcus DnaK ใน E. coli ได้ อย่างไรก็ตาม พวกเขาได้ไม่ต่อนักศึกษา โดยใช้ transformants ของพวกเขาในการตั้งค่าการหมัก โทมัส et al. (52) รายงานว่า overexpression ของ groESL ในเชื้อ Clostridium acetobutylicum ผล 38% และเพิ่มขึ้น 30% ในการผลิตอะซีโตนและบิวทานอ ตามลำดับ สัมพันธ์พันธุ์ควบคุม plasmid ในระหว่างการหมักอะซิโตนบิวทานอชุดเลี้ยงน้ำตาลในการควบคุมค่า pH ได้ โดย plasmid ควบคุมสายพันธุ์ พันธุ์ groESL overexpressing ยังพบค่าเผื่อเพิ่มบิวทานอ อย่างไรก็ตาม ลักษณะพิเศษของ DnaK overproduction เจริญเติบโตของเซลล์และหมักในแบคทีเรียกรดแลกติกจะยังคงชัดเจนในการศึกษานี้ เราสร้างการ dnaK E. coli (dnaKEco) -แสดง L. lactis NZ9000 ต้องใช้ (นิวซีแลนด์-EDnaK) ที่จัดแสดงการปรับปรุงค่าเผื่อความเครียดเกิดจากเกลือ (3% NaCl), กรด (กรด 0.5%), ตัวทำละลาย (เอทานอล 5%), และความร้อน (40° C) สำคัญที่สุด เราพบว่า ประสิทธิภาพการหมักกรดแลกติกของนิวซีแลนด์-EDnaK ถูกปรับปรุงอย่างมากที่อุณหภูมิสูง (40° C) กับความรู้ของเรา นี้เป็นรายงานแรกที่อธิบายผลบวกหลาย DnaK ผลิต heterologous ยอมรับความเครียดและการหมักกรดแลกติกในแบคทีเรียกรดแลกติก

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

แลคโตค คัส lactis เป็นกรดแลคติกแบคทีเรียที่ใช้ในอุตสาหกรรมนม เพื่อผลิตกรดแลคติกและสังเคราะห์สารประกอบต่าง ๆที่นำไปสู่การพัฒนารองหมักรส ชนิดที่มีที่ได้มาแล้วสถานะของการยอมรับโดยทั่วไปว่าปลอดภัย ( GRAS ) และเมื่อรวมอยู่ในผลิตภัณฑ์อาหาร คือมักสัมผัสกับสภาพความเครียดแตกต่างกันเช่น ผู้ที่ชักนำด้วยอุณหภูมิ , เกลือ , กรด และกรดชนิด ความพยายามมากได้รับการทำเพื่อเอาชนะปัญหาความเครียดเหล่านี้ในแบคทีเรียกรดแลคติก และนี้เกี่ยวข้องกับการใช้กลยุทธ์ที่แตกต่างกัน เช่น การใช้ออกซิเจนผ่านภาชนะไมโครเอนแคปซูเลชัน ( 15 ) 1 รัง ใช้สายพันธุ์ที่ทนความเครียด ( 46 )พบภายใต้สภาวะความเครียดและพิษ ( 14 , 15 , 43 ) และพันธุศาสตร์โมเลกุลโปรตีนมีการศึกษาพบความเกี่ยวพันของยีนบางตัวในความเครียด การตอบสนองของแบคทีเรียกรดแลคติก เหล่านี้รวมถึงยีนโมเลกุลและคนติดตาม groesl dnak ( 18 , 43 , 53 ) , เมทไธโอนีนซัลฟอกไซด์ รีดักเตส ( 55 ) และ f1fo ATPase ( 33 ) ซึ่งจะแสดงในการตอบสนองต่อความร้อน ออกซิเจนและกรดความเครียดตามลำดับ

ฮีตช็อกโปรตีน ( hsps ) ซึ่งเป็นที่รู้จักกันเป็นโมเลกุล คนติดตามจะเกิดเมื่อเซลล์จะสัมผัสกับความเครียดด้านสิ่งแวดล้อม ( 35 , 40 ) โปรตีนเหล่านี้จะเกี่ยวข้องกับการคุ้มครองของโปรตีนอื่น ๆจากการหยุดชั่วคราวและสถานะของโปรตีนเกิดการรวม . dnak , homolog ยีนในแบคทีเรียเชื่อกันว่าเป็น " เทอร์โมมิเตอร์ " มือถือที่ transduces สัญญาณโทรศัพท์มือถืออื่น ๆที่มีการเพิ่มอุณหภูมิ ( 11 ) ถึงแม้ว่ายีนยีนอย่างกว้างขวางป่าสงวนในทั้งสิ้น ยกเว้นบางอาร์เคียที่กว้างขวาง การทำงาน การศึกษาได้ดำเนินการส่วนใหญ่กับ Saccharomyces cerevisiae , Escherichia coli , และ , เมื่อเร็วๆนี้ , Bacillus subtilis ( 25 , 42 ,45 ) การวิจัยใน E . coli โมเลกุล คนติดตาม ได้เปิดเผยว่า dnak ฟังก์ชันและความร่วมมือกับ dnaj grpe และซับซ้อนนี้มีบทบาทสำคัญใน refolding ของโปรตีนที่ได้รับความเสียหาย นอกจากบทบาทในการช่วยในการพับของกลุ่มโปรตีนตั้งไข่ภายใต้เงื่อนไขปกติการเจริญเติบโต ( 7-10 , 20 , 30 , 47 , 57 )ในหลอดทดลอง พบว่า มีการวิเคราะห์ dnak เอทีพีพี่เลี้ยงของกิจกรรมและกิจกรรมนี้ถูกควบคุมโดย dnaj และ grpe ( 34 ) นอกจากนี้ ที่ซับซ้อนนี้ยังเข้าร่วมในเอทีพี ขึ้นอยู่กับโปรตีโ ลซิสในเซลล์ ( 37 ) มีรายงานว่า L . lactis คล้ายกับแบคทีเรียอื่น ๆ แสดงถึงการตอบสนองความร้อนช็อกซึ่งในโมเลกุล คนติดตามบทบาทกลาง ( 2 , 29 , 56 )ก่อนหน้านี้ groesl overproducing L . lactis รายงานแสดงการปรับปรุงความทนทานต่อความเครียดที่เกิดจากความร้อน ( 54 ° C เป็นเวลา 30 นาที ) , เกลือ ( 5 M NaCl 1 H ) และตัวทำละลาย ( 0.5% butanol ) ( 16 ) fiocco et al . ( 18 ) รายงานการปรับปรุงการปรับความร้อนและเย็นและทนทานต่อตัวทำละลายใน Lactobacillus plantarum โดย overproduction ของเล็ก hsps . ซึงิโมโตะ และคณะ( 48 ) การรายงานก่อนหน้านี้ว่า การรวมตัวของโปรตีนที่เกิดจาก 5% ( 0.86 m ) เกลืออาจจะปราบปรามอย่างน่าทึ่งโดย overproduction ของ dnak halophilus tetragenococcus ใน E . coli แต่ไม่ได้เรียนต่อ โดยใช้พลาสมิดของพวกเขาในการหมัก โทมัส et al .( 52 ) รายงานว่า overexpression ของ groesl ใน Clostridium acetobutylicum ส่งผลให้เกิด 38 % และ 30 % เพิ่มขึ้น ) และการผลิตบิวทานอล ตามลำดับ เทียบกับที่ในการควบคุมความเครียดในระหว่างควบคุมกลูโคสที่ได้รับพลาสมิดอชุดอะซิโตนพูดเรื่อยเปื่อย . ในการเปรียบเทียบเพื่อควบคุมสายพันธุ์สายพันธุ์การ groesl overexpressing สายพันธุ์ พบว่า เพิ่มความอดทนให้บิวทานอล . อย่างไรก็ตาม ผลของ dnak overproduction ในการเจริญเติบโตของเซลล์และการหมักด้วยแบคทีเรียกรดแล็กติกยังคงไม่ชัดเจน .

ในการศึกษานี้จึงได้สร้าง dnak E . coli ( dnakeco L . lactis สายพันธุ์ ) - แสดง nz9000 ( NZ ednak ) ซึ่งมีการปรับปรุงความทนทานต่อความเครียดที่เกิดจากเกลือ ( โซเดียมคลอไรด์ ) , กรด ( 0.5 เปอร์เซ็นต์ กรด ) ,ตัวทำละลาย ( เอทานอล 5% ) และความร้อน ( 40 ° C ) ที่สำคัญที่สุด เราพบว่า ประสิทธิภาพของกระบวนการหมักกรดแลคติกจาก NZ ednak ได้รับการปรับปรุงอย่างมากในอุณหภูมิสูง ( 40 ° C ) เพื่อที่ดีที่สุดของความรู้ของเรานี้เป็นรายงานแรกที่อธิบายถึงผลในเชิงบวกของการผลิต dnak หลายชนิดความทนทานต่อความเครียดและการหมักกรดแลคติกแบคทีเรียกรดแลคติก