Materials and methodsPlant and fung

Materials and methods
Plant and fungal material
Plants of Hordeum vulgare L. cv. Arma, a powdery mildew highly sensitive cultivar, were
grown in pots in a growth chamber at 23 ± 18C, 75% r.h. and 190 lE m
2
s

1
, with a 14 h
photoperiod. Weekly, Blumeria graminis f.sp. hordei was inoculated and maintained on
young barley plants.
Treatments and fungal inoculation
Chitosan (Sigma, USA, deacetylation degree: *85%), was purified according to Benhamou
and The´riault (1992). The obtained polymer showed a MW of about 119 kD, as
assessed by intrinsic viscosity determination (Brugnerotto et al. 2001), and was dissolved
in 0.3% acetic acid under continuous stirring; then the pH was adjusted to 5.6 using 0.1 M
NaOH. The stock solution (10 mg/ml) was kept at
208C and diluted, before use, to the
final concentration of 2 mg/ml with 0.01% (v/v) Tween 20 in distilled water. The same
Tween-20 solution as above, at pH 5.6, was sprayed on control plants. 0.3 m M BTH
[benzo-(1,2,3)-thiadiazole-7-carbothioic acid S-methyl ester] was dissolved in distilled
water from a wettable formulation containing 50% (w/w) active ingredient (a.i.). Control
plants were sprayed with a wettable powder solution without a.i.
Chemicals were applied as a single treatment, by spraying on the primary leaf of 7 days
old plants, or as a double treatment on 5 and 7 days old plants. After a few minutes, when
leaves were dried, plants were transferred to a different growing chamber to avoid aerial
dispersal of chemicals. Plants with a secondary leaf already developing were eliminated to
be sure that secondary leaves of all plants remained untreated. The pathogen was inoculated
by spraying the leaves with a water suspension of 0.5 · 106 freshly formed conidia
per ml (Lumbroso et al. 1982). Following a single treatment, inoculation was carried out
after: i) 1–2 h that is to say at 0 IP (Induction Phase, time elapsed between treatment with
BTH or CHT and pathogen inoculation); ii) 3 days IP; iii) 5 days IP; iv) 10 days IP. When a
double treatment was performed, inoculation was carried out at 6 days IP on the primary
leaf and at 10 days IP on the secondary one. In all cases, symptoms analysis was performed
8 days after inoculation. To avoid spore inhibition, conidia suspension was prepared
immediately before use and spraying carried out within 5 min. In these operating conditions
inoculum concentration could be easily calibrated with no difference in the efficiency
of infection in comparison with the dusting technique.
The effects of chitosan and benzothiadiazole 389
123
Determination of infected leaf area and fungal development stages
Leaf infected areas were estimated, in all treatments, 8 days after fungal inoculation (dpi)
on digitalised image analysed by GLOBAL LAB1 Image (DATA TRANSLATION1,
USA).
To estimate conidia germination, 24 or 48 h after inoculation (1, 2 dpi), leaf portions
were excised and cleared by capillarity in Petri dishes containing filter paper imbued with
100% ethanol, and then analysed by light microscopy. A total of 100 conidia for each leaf
was recorded and considered germinated when an appressorial germ tube was present.
Pathogen penetration, callose papilla apposition and haustorium formation were observed
on leaf segments excised 3–8 days after inoculation. Leaf fragments were cleared with 70%
ethanol and stained with resorcinol blue for callose (Eschrich and Curier 1964). Papilla
formation was analysed on 100 attempted penetration sites for each leaf and classified into
2 classes: 1 = effective papilla not penetrated by the fungus; 2 = penetrated papilla with
recognizable haustorium. Haustorium developmental stages were determined according to
Koga et al. (1990), but limiting the classes to 3, as follows: 1 = initial stage without
digitations; 2 = digitation length up to the size of haustorial body diameter; 3 = digitation
length greater then haustorial body diameter.
Tissue processing for light microscopy
Leaf fragments were clarified in 95% boiling ethanol and stained with: a) toluidine blue to
detect lignin deposition and to stain fungal structures (O’Brain et al. 1964); b) coomassie
brillant blue (Bio-Rad, USA) to stain conidia and mycelia (Bradford 1976); c) aniline blue
and resorcinol blue for callose (Eschrich and Currier 1964); d) nitroso reaction for phenolic
compounds (Reeve 1959). Detection of H2O2 was performed by an endogenous peroxidase-dependent
in situ histochemical staining procedure using DAB, as described by
Thordal-Christensen et al. (1997). Polymerisation of DAB occurs in presence of H2O2 and
appears as a brown precipitate in leaf tissues.
To investigate cell death, trypan blue staining was carried out by boiling leaf tissues for
1 min in a mixture of phenol, lactic acid, glycerol and distilled water containing 1 mg/ml
trypan blue (1:1:1:1), prepared immediately before use. Tissue were then clarified overnight
in a solution of 2.5 mg/ml chlo

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการอาคารและวัสดุเชื้อราพืชของ Hordeum vulgare L. พันธุ์ Arma โรคราแป้งมีความไวสูงพันธุ์ มีปลูกในกระถางในห้องเจริญเติบโตที่ 23 ± C 18, 75% r.h. และ 190 lE ม. 2s1กับ h 14ช่วงแสง รายสัปดาห์ Blumeria graminis f.sp hordei inoculated และรักษาไว้บนหนุ่มข้าวบาร์เลย์พืชทรีทเมนท์และกักบริเวณเชื้อราไคโตซาน (ซิกม่า สหรัฐอเมริกา ปริญญา deacetylation: * 85%), บริสุทธิ์ตาม Benhamouและ The´riault (1992) พอลิเมอร์ได้รับพบว่า MW ประมาณ 119 kD เป็นประเมิน โดยการวัดค่าความหนืดที่แท้จริง (Brugnerotto et al. 2001), และละลายใน 0.3% กรดอะซิติกภายใต้กวนต่อเนื่อง แล้ว ถูกปรับ pH เป็น 5.6 ใช้ 0.1 MNaOH การแก้ไขปัญหาสต็อก (10 mg/ml) เก็บไว้ที่ 208C และ เจือจาง ก่อนการใช้ การให้ความเข้มข้นสุดท้ายของ 2 mg/ml มี 0.01% (v/v) แต่ 20 ในน้ำกลั่น เหมือนเดิมโซลูชั่นโลก-20 ข้างต้น ที่ pH 5.6 ถูกฉีดพ่นบนพืชควบคุม 0.3 m M บาท[เบนโซเอ- (1,2,3) - thiadiazole - 7-carbothioic กรด S-เมทิลเอสเทอร์] ละลายในกลั่นน้ำจากกำหนด wettable ที่ประกอบด้วย 50% (w/w) สารออกฤทธิ์ (จักร) ควบคุมพืชที่ถูกพ่น ด้วยโซลูชัน wettable ผงโดยจักรใช้สารเคมีเป็นการรักษาเดี่ยว โดยการฉีดพ่นบนใบหลัก 7 วันโรงงานเก่า หรือการรักษาคู่บนพืชอายุวันที่ 5 และ 7 หลังจากไม่กี่นาที เมื่อใบที่แห้ง พืชถ่ายโอนห้องเติบโตแตกต่างกันเพื่อหลีกเลี่ยงทางอากาศเพื่อการแพร่กระจายของสารเคมี พืชที่ มีใบรองที่พัฒนาแล้วถูกตัดไปตรวจสอบให้แน่ใจว่า รองใบของพืชทั้งหมดยังคงได้รับการรักษา เชื้อโรคคือ inoculatedโดยฉีดพ่นใบด้วยน้ำระงับการ 0.5 · 106 รูปสด conidiaต่อมิลลิลิตร (Lumbroso et al. 1982) ต่อไปนี้การรักษาเดี่ยว กักบริเวณได้ดำเนินการหลังจากที่: ฉัน) h 1 – 2 ที่จะพูดที่ 0 IP (ระยะเหนี่ยวนำ เวลาผ่านไประหว่างการรักษาด้วยบาท หรือภาษาจีนดั้งเดิม และเชื้อโรคกักบริเวณ); ii) IP 3 วัน iii) IP 5 วัน iv) IP 10 วัน เมื่อเป็นทำทรีทเมนท์ กักบริเวณดำเนินการที่ IP 6 วันบนหลักใบ 10 วัน IP ที่รอง ดำเนินการในทุกกรณี วิเคราะห์อาการ8 วันหลังจากกักบริเวณ เตรียมระงับ conidia เพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งสปอร์ทันทีก่อนใช้และฉีดพ่นดำเนินการภายใน 5 นาที ในสภาพการทำงานเหล่านี้ความเข้มข้นของ inoculum สามารถปรับตั้งได้ง่าย ๆ ไม่มีความแตกต่างในประสิทธิภาพการติดเชื้อเมื่อเปรียบเทียบกับเทคนิคการปัดฝุ่นผลของไคโตซานและ benzothiadiazole 389123กำหนดพื้นที่ใบที่ติดเชื้อและขั้นตอนการพัฒนาเชื้อราพื้นที่ใบการติดเชื้อได้ประมาณ ในการรักษาทั้งหมด 8 วันหลังจากกักบริเวณเชื้อรา (dpi)digitalised ภาพโดยภาพ LAB1 ทั่วโลก (ข้อมูล TRANSLATION1สหรัฐอเมริกา)ประเมิน conidia การงอก 24 หรือ 48 ชั่วโมงหลังจากกักบริเวณ (1, 2 dpi), ส่วนใบสรรพสามิต และล้าง โดย capillarity ในจานเพาะที่ประกอบด้วยกระดาษกรองที่เต็มไปด้วยเอทานอล 100% แล้ว วิเคราะห์ ด้วยกล้องจุลทรรศน์แสง รวม 100 conidia สำหรับแต่ละใบบันทึกไว้ และถือว่างอกเมื่อมี appressorial จมูกหลอดปัจจุบันเชื้อโรคเจาะ callose โรงแสง apposition และก่อตัว haustorium ถูกตั้งข้อสังเกตบนใบไม้ ส่วนสรรพสามิต 3-8 วันหลังจากกักบริเวณ เศษใบไม้ถูกล้างไป ด้วย 70%เอทานอล และย้อม ด้วยนจากสีน้ำเงินสำหรับ callose (Eschrich และ Curier 1964) โรงแสงก่อตัววิเคราะห์ 100 พยายามเจาะไซต์สำหรับแต่ละใบ และแบ่งออกเป็นชั้น 2:1 =ประสิทธิภาพโรงแสงไม่ทะลุเชื้อ 2 =โรงแสงทะลุด้วยhaustorium เป็นที่รู้จัก ดำเนินการตามขั้นตอนพัฒนาการ haustoriumโคกะ et al. (1990), แต่จำกัดชั้น 3 เป็นดังนี้: 1 =ระยะแรกโดยdigitations 2 = digitation ความยาวจนถึงขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางร่างกาย haustorial 3 = digitationความยาวมากขึ้น แล้ว haustorial ร่างกายเส้นผ่าศูนย์กลางการประมวลผลสำหรับแสงกล้องจุลทรรศน์เนื้อเยื่อชี้แจงใน 95% เอทานอลการต้ม และย้อมด้วยเศษใบไม้: การ) toluidine สีฟ้าตรวจพบลิกนิสะสม และคราบเชื้อราโครงสร้าง (O'Brain et al. 1964); ข) coomassiebrillant สีน้ำเงิน (Bio-ล้อ สหรัฐอเมริกา) กับสีย้อม conidia และ mycelia (แบรดฟอร์ด 1976); ค) นที่สีน้ำเงินและสีน้ำเงินสำหรับ callose (Eschrich และรับส่งพัสดุ 1964); นจาก d) ปฏิกิริยา nitroso ฟีนอลสารประกอบ (1959 รีฟ) ทำการตรวจสอบของ H2O2 โดยภายนอกฮอสขึ้นอยู่กับในแหล่งกำเนิด histochemical ผมตอนใช้ DAB ตามที่อธิบายไว้โดยคริส Thordal et al. (1997) เกิด polymerisation ของ DAB ใน H2O2 และปรากฏเป็นมีตะกอนสีน้ำตาลในเนื้อเยื่อใบการตรวจสอบการตายของเซลล์ ย้อมสี trypan blue ดำเนินการ ด้วยการต้มเนื้อเยื่อใบสำหรับ1 นาทีในส่วนผสมของฟีนอล กรดแลคติก กลีเซอรอล และน้ำกลั่นที่ประกอบด้วย 1 mg/mltrypan blue (1:1:1:1), เตรียมทันทีก่อนใช้ เนื้อเยื่อได้ชี้แจงแล้วค้างคืนในการแก้ไขปัญหาของ chlo 2.5 mg/ml

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ
ก่อสร้างวัสดุเชื้อรา
พืช Hordeum vulgare L. พันธุ์ Arma เป็นโรคราแป้งพันธุ์มีความไวสูงได้รับการ
ปลูกในกระถางในห้องการเจริญเติบโตที่ 23 ± 18C, RH 75% และ 190 Le M? 2
s
? 1
กับ 14 ชั่วโมง
ต่อช่วงแสง สัปดาห์ Blumeria graminis f.sp. hordei ได้รับเชื้อและการบำรุงรักษาใน
พืชข้าวบาร์เลย์หนุ่ม.
การรักษาและการฉีดวัคซีนเชื้อรา
ไคโตซาน (Sigma, USA ปริญญาสิก: * 85%) บริสุทธิ์ตามเบน
และ The'riault (1992) พอลิเมอได้แสดงให้เห็นว่าเมกะวัตต์ประมาณ 119 kD เช่น
การประเมินโดยการกำหนดค่าความหนืดที่แท้จริงและถูกกลืนหายไป (Brugnerotto et al, 2001.)
ในกรดอะซิติก 0.3% ภายใต้กวนอย่างต่อเนื่อง; แล้วค่า pH ที่ถูกปรับให้ใช้ 5.6 0.1 M
NaOH วิธีการแก้ปัญหาหุ้น (10 mg / ml) ถูกเก็บไว้ที่? 208C และเจือจางก่อนการใช้งานเพื่อ
ความเข้มข้นสุดท้าย 2 mg / ml กับ 0.01% (v / v) Tween 20 ในน้ำกลั่น เช่นเดียวกับ
Tween-20 การแก้ปัญหาข้างต้นที่ pH 5.6 ได้รับการฉีดพ่นพืชควบคุม 0.3 เมตร M BTH
[benzo- (1,2,3) -thiadiazole-7-carbothioic กรด S-methyl เอสเตอร์] ถูกละลายในน้ำกลั่น
น้ำจากสูตรเปียกที่มี 50% (w / w) สารออกฤทธิ์ (AI) ควบคุม
พืชฉีดพ่นด้วยสารละลายผงเปียกโดยไม่ต้อง AI
สารเคมีถูกนำไปใช้ในการรักษาเพียงครั้งเดียวโดยการฉีดพ่นบนใบหลักของ 7 วัน
พืชเก่าหรือเป็นคู่การรักษาในวันที่ 5 และ 7 วันพืชเก่า หลังจากนั้นไม่กี่นาทีเมื่อ
ใบแห้งพืชถูกย้ายไปยังห้องการเจริญเติบโตที่แตกต่างกันเพื่อหลีกเลี่ยงอากาศ
กระจายของสารเคมี พืชที่มีใบรองแล้วพัฒนาถูกตัดออกเพื่อ
ให้แน่ใจว่าใบรองของพืชทั้งหมดยังคงได้รับการรักษา เชื้อโรคได้รับเชื้อ
โดยการฉีดพ่นใบด้วยการระงับน้ำ 0.5 · 106 สปอร์รูปแบบที่สดใหม่
ต่อมิลลิลิตร (Lumbroso et al. 1982) ต่อไปนี้การรักษาเพียงครั้งเดียว, การฉีดวัคซีนได้ดำเนินการ
หลังจาก i) 1-2 H กล่าวคือที่ 0 IP (เหนี่ยวนำเฟสเวลาผ่านไประหว่างการรักษาด้วย
BTH หรือ CHT และเชื้อโรคฉีดวัคซีน); ii) 3 วัน IP; iii) 5 วัน IP; IV) 10 วัน IP เมื่อ
การรักษาคู่ได้ดำเนินการฉีดวัคซีนได้ดำเนินการที่ 6 วันที่ IP บนหลัก
ใบและใน 10 วัน IP บนหนึ่งรอง ในทุกกรณีการวิเคราะห์อาการได้ดำเนินการ
8 วันหลังจากการฉีดวัคซีน เพื่อหลีกเลี่ยงการยับยั้งการสร้างสปอร์ระงับ conidia ถูกจัดทำขึ้น
ทันทีก่อนการใช้งานและการฉีดพ่นดำเนินการภายใน 5 นาที ในสภาพการใช้งานเหล่านี้
ความเข้มข้นของเชื้ออาจจะปรับได้อย่างง่ายดายด้วยความแตกต่างในประสิทธิภาพไม่มี
การติดเชื้อในการเปรียบเทียบกับเทคนิคการปัดฝุ่นได้.
ผลกระทบของไคโตซานและ benzothiadiazole 389
123
การกำหนดพื้นที่ใบที่ติดเชื้อและการพัฒนาเชื้อราขั้นตอนการ
Leaf พื้นที่ติดเชื้อได้ประมาณในทุก การรักษา, 8 วันหลังจากการฉีดวัคซีนเชื้อรา (dpi)
บนภาพ digitalised วิเคราะห์โดย GLOBAL LAB1 ภาพ (DATA TRANSLATION1,
USA).
การประเมินการงอกของสปอร์, 24 หรือ 48 ชั่วโมงหลังจากการฉีดวัคซีน (1, 2 dpi) ส่วนใบ
ที่ถูกตัดทิ้งและล้างโดย ฝอยในจานเลี้ยงเชื้อที่มีกระดาษกรองตื้นตันใจกับ
100% เอทานอลและจากนั้นวิเคราะห์โดยใช้กล้องจุลทรรศน์แสง รวม 100 สปอร์สำหรับแต่ละใบ
ถูกบันทึกไว้และคิดว่าเมื่องอกหลอดจมูก appressorial เป็นปัจจุบัน.
เจาะเชื้อโรคท้าย callose ตุ่มและการก่อ haustorium ถูกตั้งข้อสังเกต
ในส่วนใบตัด 3-8 วันหลังจากการฉีดวัคซีน เศษใบไม้เคลียร์กับ 70%
เอทานอลและย้อมด้วยสีฟ้าสำหรับ resorcinol callose (Eschrich และ Curier 1964) ตุ่ม
ก่อวิเคราะห์ 100 เว็บไซต์พยายามเจาะสำหรับแต่ละใบและแบ่งออกเป็น
2 ชั้นเรียน: 1 = สิวที่มีประสิทธิภาพไม่ทะลุผ่านเชื้อรา; 2 = เจาะตุ่มกับ
haustorium ที่รู้จัก Haustorium ระยะการพัฒนาได้รับการพิจารณาตาม
Koga, et al (1990) แต่ จำกัด การเรียน 3 ดังต่อไปนี้: 1 = ระยะแรกโดยไม่ต้อง
digitations; ความยาว 2 = digitation ขึ้นอยู่กับขนาดของเส้นผ่าศูนย์กลางร่างกาย haustorial นั้น 3 = digitation
. ความยาวมากขึ้นแล้วร่างกาย haustorial เส้นผ่าศูนย์กลาง
ประมวลผลเนื้อเยื่อสำหรับกล้องจุลทรรศน์
เศษใบชี้แจงในเอทานอล 95% เดือดและย้อมด้วยสีก) สีฟ้า toluidine เพื่อ
ตรวจสอบการสะสมลิกนินและโครงสร้างเปื้อนเชื้อรา (O'Brain et al, 1964). ; ข) Coomassie
สดใสสีฟ้า (Bio-Rad, USA) เพื่อเปื้อนสปอร์และเส้นใย (แบรด 1976); c) สวรรค์สีฟ้า
และสีฟ้าสำหรับ resorcinol callose (Eschrich และคิวเรีย 1964); D) ปฏิกิริยาไนโตรโซฟีนอลสำหรับ
สารประกอบ (รีฟ 1959) การตรวจสอบของ H2O2 ถูกดำเนินการโดย peroxidase ขึ้นอยู่กับภายนอก
ในแหล่งกำเนิดขั้นตอนการย้อมสีฮีสโตเคมีโดยใช้ป้ายตามที่อธิบาย
Thordal-คริส, et al (1997) โพลิเมอร์ของป้ายที่เกิดขึ้นในการปรากฏตัวของ H2O2 และ
ปรากฏเป็นตะกอนสีน้ำตาลในเนื้อเยื่อใบ.
ในการตรวจสอบการตายของเซลล์ย้อมสีฟ้า Trypan ได้ดำเนินการโดยการต้มเนื้อเยื่อใบสำหรับ
1 นาทีในส่วนผสมของฟีนอลกรดแลคติก, กลีเซอรีนและน้ำกลั่นที่มี 1 mg / ml
Trypan สีฟ้า (1: 1: 1: 1) จัดทำทันทีก่อนการใช้งาน เนื้อเยื่อชี้แจงแล้วในชั่วข้ามคืน
ในการแก้ปัญหา 2.5 mg / Chlo มล

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการวัสดุพืชและเชื้อราพืช hordeum vulgare L . cv . อาวุธ , powdery mildew ความไวสูง พันธุ์คือปลูกในกระถางในการเจริญเติบโตไม่มี ที่ 23 ±จ R.H . 75% และ 190 เลอตารางเมตรs1กับ 14 ชม.ไม่ . รายสัปดาห์ blumeria graminis เหมาะ hordei เป็นเชื้อและการรักษาพืชข้าวบาร์เลย์อ่อนการรักษาเชื้อราและเชื้อไคโตซาน ( Sigma อเมริกาเตรียมปริญญา : * 85% ) บริสุทธิ์ตาม benhamouและใหม่ riault ( 1992 ) นำพอลิเมอร์มี MW ของเกี่ยวกับ 119 ชนิด เช่นประเมินโดยการวัดความหนืดที่แท้จริง ( brugnerotto et al . 2544 ) และละลายกรดใน 0.3% ภายใต้อย่างต่อเนื่องกวน แล้วปรับ pH 5.6 ใช้ 0.1 โมลาร์NaOH หุ้นโซลูชั่น ( 10 mg / ml ) ถูกเก็บไว้ที่ 208c และเจือจางก่อนใช้ เพื่อความเข้มข้นสุดท้าย 2 mg / ml กับ 0.01 % ( v / v ) Tween 20 ในน้ำกลั่น เหมือนกันtween-20 แก้ปัญหาข้างต้นที่ pH 5.6 ถูกพ่นบนพืชควบคุม 0.3 M ส.ต.[ เบนโซ - ( 1 , 2 , 3 ) - thiadiazole-7-carbothioic s-methyl เอสเทอร์ของกรดละลายในน้ำกลั่น ]น้ำจาก wettable ตำรับที่ประกอบด้วย 50 % ( w / w ) ออกฤทธิ์ ( AI ) การควบคุมพืชที่ถูกพ่นด้วย wettable ผงโซลูชั่นไม่มี เอไอสารเคมีที่ใช้เป็นยาเดี่ยว โดยการฉีดพ่นบนใบหลักของ 7 วันพืชเก่า หรือเป็นคู่ในการรักษาพืชอายุ 5 และ 7 วัน หลังจากไม่กี่นาที , เมื่อใบแห้ง , พืชที่ถูกย้ายไปขึ้นห้องเพื่อหลีกเลี่ยงอากาศแตกต่างกันการแพร่กระจายของสารเคมี พืชที่มีใบแล้วถูกตัดออกเพื่อการพัฒนามัธยมศึกษาให้แน่ใจว่า รองใบพืชทั้งหมดยังคงดิบ เชื้อนี้เป็นเชื้อโดยการฉีดพ่นใบด้วยน้ำ 0.5 ด้วยช่วงล่าง 106 รูปแบบนี้สดต่อมิลลิลิตร ( lumbroso et al . 1982 ) ต่อไปนี้การรักษาเพียงครั้งเดียวการกระทำหลังจากที่ฉัน ) 1 – 2 H ว่า 0 IP ( เหนี่ยวนำเฟส เวลาที่ผ่านไประหว่างการรักษาด้วยบาทและได้รับเชื้อโรคหรือ CHT ) ; 2 ) 3 วัน 5 วัน IP IP ; 3 ) 4 ) 10 วัน IP เมื่อคู่การปฏิบัติการกระทำที่ IP 6 วันในปฐมภูมิใบและที่ IP 10 วันในระดับหนึ่ง ในทุกกรณี วิเคราะห์อาการได้8 วันหลังจากปลูกเชื้อ เพื่อหลีกเลี่ยงการสร้างสปอร์แขวนลอย , เตรียมทันทีก่อนที่จะใช้และฉีดออกไปภายใน 5 นาที ในเงื่อนไขเหล่านี้ความเข้มข้นของเชื้อได้ง่ายเทียบกับความแตกต่างในประสิทธิภาพของการติดเชื้อในการเปรียบเทียบกับการปัดฝุ่นเทคนิคผลของไคโตซานและ benzothiadiazole 389123การกำหนดพื้นที่ใบที่ติดเชื้อและระยะพัฒนาการของเชื้อราใบพื้นที่ที่ติดเชื้อได้ประมาณในการรักษาทั้งหมด 8 วัน หลังจากการฉีดวัคซีน ( dpi )ในรูป digitalised วิเคราะห์โดย lab1 ทั่วโลก ( ข้อมูล translation1 ภาพ ,สหรัฐอเมริกา )เพื่อประเมินการงอก conidia 24 หรือ 48 ชั่วโมงหลังจากการฉีดวัคซีน ( 1 , 2 จุดต่อนิ้ว ) ส่วนใบถูกตัดและล้างโดยแคพิลลารีในจานเลี้ยงเชื้อที่มีตัวกรองกระดาษเต็มไปด้วยเอทานอล 100 % แล้ววิเคราะห์ด้วยกล้องจุลทรรศน์แสง ทั้งหมด 100 ชนิดของแต่ละใบจะถูกพิจารณาโดย germ tube เมื่อ appressorial คือปัจจุบันการเจาะเชื้อโรคนี้เหมาะ haustorium แคลโลและการตรวจสอบในส่วนของใบตัด 3 – 8 วันหลังจากปลูกเชื้อ เศษใบล้างกับ 70 เปอร์เซ็นต์เอทานอล และย้อมด้วยสีน้ำเงิน ( eschrich แคลโลรี และ curier 1964 ) ตุ่มการสร้างจำนวน 100 พยายามเจาะเว็บไซต์สำหรับแต่ละใบแบ่งออกเป็น2 ชั้น 1 = ประสิทธิภาพตุ่มไม่ penetrated โดยเชื้อรา ; 2 = เจาะหัวนมด้วยรู้จัก haustorium . haustorium พัฒนาการขั้นกำหนดตามโคกะ et al . ( 1990 ) แต่จำกัดชั้น 3 , 1 = เริ่มแรกโดยไม่digitations 2 = ความยาว digitation ขึ้นกับขนาดของขนาดร่างกาย haustorial 3 = digitationความยาวมากขึ้นแล้ว haustorial ร่างกายเส้นผ่าศูนย์กลางการแปรรูปเยื่อสำหรับกล้องจุลทรรศน์แสงเศษใบพยนต์ 95% เอทานอล และต้มย้อมด้วย : ) โทลูอิดีนสีฟ้าตรวจสอบโครงสร้างและลิกนินสะสมคราบเชื้อรา ( o"brain et al . 1964 ) ; B ) เหล่านี้น่าจะเป็นหลอดสีฟ้า ( สหรัฐอเมริกาไบแรด ) คราบและสร้างเส้นใย ( แบรดฟอร์ด 1976 ) ; C ) อะนิลีนบลูสีฟ้า ( eschrich และแคลโลรี และรับส่งพัสดุ พ.ศ. 2507 ) ; D ) ไนโตรโซปฏิกิริยาสารฟีโนลิก( รีฟ ( 1959 ) การตรวจหาการเปลี่ยนแปลงโดย H2O2 ในขึ้นอยู่กับในแหล่งกำเนิดเอ 4 ขั้นตอนใช้ป้ายตามที่อธิบายไว้โดยthordal Christensen et al . ( 1997 ) พอลิเมอไรเซชันของป้ายเกิดขึ้นในสถานะของแบตเตอรี่และปรากฏเป็นตะกอนสีน้ำตาลในเนื้อเยื่อใบเพื่อสืบสวนการตายของเซลล์ ไตรแพนสีฟ้าคราบ ทำโดยการต้มเยื่อใบสำหรับ1 นาทีในการผสมของฟีนอล , กรดกลีเซอรอลและน้ำกลั่นที่มี 1 มิลลิกรัม / มิลลิลิตรไตรแพนสีฟ้า ( 1:1:1:1 ) ที่เตรียมไว้ทันที ก่อนที่จะใช้ เนื้อเยื่อแล้วชี้แจงค้างคืนในสารละลาย 2.5 มิลลิกรัม / มิลลิลิตร โคลอี้