2.3. Extraction of DNA from isolate

2.3. Extraction of DNA from isolates
DNA extraction was carried out following the method described by Soumet, Ermel, Fach, and Colin (1994). The isolates were grown in Tryptone Soy Broth (TSB) (Oxoid) for 24 h at 37 °C; the cells were harvested by centrifugation at 12,000 ×g for 5 min and the obtained pellets were suspended in 200 μL doubly distilled sterile water. After heating at 100 °C for 15 min, the tubes were placed on ice for 5 min, and then
centrifuged at 12,000 ×g for 10 min. Finally the supernatant (DNA extract) was stored at − 20 °C.
2.4. Identification of isolates by PCR methods
The isolates which were preliminary classified as Gram-positive and catalase-positive were identified by means of multiplex PCR allowing the simultaneous identification of Staphylococcus spp., Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus and Staphylococcus aureus (Morot-Bizot, Talon, & Leroy, 2004). As it was not possible to identify all the isolates at the species level by multiplex PCR, those belonging to the Staphylococcus genus were subjected to a single species-specific PCR method allowing the identification of the Staphylococcus equorum species according to the procedure described by Blaiotta, Ercolini, Mauriello, Salzano, and Villani (2004). The primers used are listed in Table 1.
The isolates which were preliminary classified as Gram-positive and catalase-negative were identified by means of a genus specific PCR assay, allowing the identification of Lactobacillus spp. using the primers lactoF/lactoR (Byun et al., 2004). Isolates belonging to the Lactobacillus genus were identified at the species level by using two independent PCR assays because the dissimilarity of the annealing temperature hinders the development of a multiplex PCR. Species-specific primers LbPl1 and LbPl2 were used for the identification of Lactobacillus plantarum (Quere, Deschamps, & Urdaci, 1997) and 16FOR and LSakeR for the identification of Lactobacillus sakei (Rachman et al., 2004). Isolates that could not be assigned to the Lactobacillus genus were subjected to an Enterococcus genus-specific PCR assay using primers EntF/EntR (Ke et al., 1999). Species specific primers FK1/FK2 and Fae1/Fae2 were used for the identification of Enterococcus faecalis and Enterococcus faecium, respectively, by means of a multiplex PCR (Dutka-Malen, Evers, & Courvalin, 1995).
The size of PCR products was checked by 1% agarose gel electropho- resis in TBE buffer (40 mM Tris–borate, 89 mM boric acid, 2 mM EDTA; pH 8) using a 100 bp DNA ladder (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) as marker. The gel was stained with ethidium-bromide and the bands were visualized under UV light.
2.5. Physicochemical analysis
Salt content was assessed according to the recommended standard as cited by Marra, Salgado, Prieto, and Carballo (1999). The pH was measured using a pH meter Micro pH 2002 (Crison Instruments, Barcelona, Spain) after mixing 10 g of the sample with 90 mL of distilled water for 2 min in a Sorvall Omnimixer homogenizer (Omni International, Water- bury, CT, USA). Determination of water activity (aw) was performed using a Decagon CX-1 Water Activity System apparatus (Decagon De- vices, Pullman, WA, USA), according to the manufacturer's instructions.
2.6. Statistical analysis
All statistical analyses were performed using the Statistica 8.0 com- puter program for Windows (Statsoft Inc., Tulsa, OK, USA). Significant differences between different samples, between the two salting times and the olive oil and paprika effect were determined using analysis of variance, with a significance level P b 0.05, P b 0.01 and P b 0.001.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.3 การสกัดดีเอ็นเอจากแยกสกัดดีเอ็นเอถูกดำเนินการตามวิธีที่อธิบายไว้ โดย Soumet, Ermel, Fach โคลิน (1994) แยกถูกปลูกใน Tryptone ถั่วเหลืองซุป (TSB) (Oxoid) 24 ชมที่ 37 ° C เซลล์มีการเก็บเกี่ยว โดย centrifugation ที่ 12000 × g สำหรับ 5 นาที และเกล็ดได้รับถูกหยุดชั่วคราว 200 μL สองเหตุการณ์กลั่นน้ำฆ่าเชื้อ หลังจากความร้อนที่ 100 ° C สำหรับ 15 นาที หลอดถูกวางไว้บนน้ำแข็ง 5 นาที และcentrifuged ที่ 12000 × g สำหรับ 10 นาที สุดท้าย supernatant (สกัดดีเอ็นเอ) ถูกเก็บไว้ที่− 20 องศาเซลเซียส2.4 การระบุแยกโดยวิธี PCRการแยกซึ่งเบื้องต้นจัดเป็นแบคทีเรียแกรมบวก และ บวก catalase ได้ระบุวิธี multiplex PCR ให้ระบุพร้อมโอ Staphylococcus, Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus และ Staphylococcus หมอเทศข้างลาย (Morot Bizot, Talon, & Leroy, 2004) ก็ไม่สามารถระบุทั้งหมดแยกได้ในระดับสปีชีส์โดย multiplex PCR สกุล Staphylococcus ที่ถูกต้องเดียว species-specific PCR วิธีการให้รหัสพันธุ์ใน Staphylococcus equorum ตามขั้นตอนที่อธิบายไว้ โดย Blaiotta, Ercolini, Mauriello, Salzano และ Villani (2004) ไพรเมอร์ที่ใช้แสดงในตารางที่ 1การแยกซึ่งเบื้องต้นจัดเป็นแบคทีเรียแกรมบวก และลบ catalase ระบุโดยใช้เป็นพืชสกุลเฉพาะ PCR assay ให้รหัสของโอแลคโตบาซิลลัสไพรเมอร์ lactoF/lactoR (Byun et al., 2004) โดยใช้ ของพืชสกุลแลคโตบาซิลลัสที่แยกได้ระบุที่ระดับสปีชีส์ โดยใช้ PCR assays อิสระสองเนื่องจากการพัฒนา multiplex PCR ทำ dissimilarity ของอุณหภูมิหลอม ไพรเมอร์ species-specific LbPl1 และ LbPl2 ถูกใช้สำหรับการระบุของแลคโตบาซิลลัส plantarum (Quere, Deschamps, & Urdaci, 1997) และ 16FOR และ LSakeR สำหรับรหัสของแลคโตบาซิลลัส sakei (Rachman et al., 2004) แยกที่ไม่สามารถกำหนดให้พืชสกุลแลคโตบาซิลลัสอยู่ภายใต้การทดสอบ PCR เฉพาะสกุล Enterococcus ที่ใช้ไพรเมอร์ EntR EntF (Ke et al., 1999) พันธุ์ไพรเมอร์เฉพาะ FK1/FK2 และ Fae1/Fae2 ใช้สำหรับการระบุ Enterococcus faecalis และ Enterococcus faecium ตามลำดับ วิธีการ multiplex PCR (Dutka Malen, Evers, & Courvalin, 1995)มีการตรวจสอบขนาดของผลิตภัณฑ์ PCR โดย 1% agarose เจ electropho-resis ในบัฟเฟอร์ TBE (40 มม.ตรี – borate กรด boric 89 mM, 2 mM EDTA; pH 8) ใช้ 100 bp DNA บันได (Invitrogen คาร์ลส CA, USA) เป็นเครื่องหมาย เจมีสีกับโบรไมด์ ethidium และวงดนตรีที่มี visualized ภายใต้แสง UV2.5. physicochemical วิเคราะห์เนื้อหาเกลือถูกประเมินตามมาตรฐานแนะนำตามที่อ้าง โดย Marra, Salgado ใน และ Carballo (1999) มีวัด pH โดยใช้ pH มิเตอร์ Micro pH 2002 (เครื่องมือ Crison บาร์เซโลนา สเปน) หลังจากการผสมของตัวอย่าง 10 กรัมกับ 90 mL ของน้ำกลั่นสำหรับ 2 นาทีใน homogenizer Sorvall Omnimixer (ออมอินเตอร์เนชั่นแนล น้ำ - ฝัง CT สหรัฐอเมริกา) กำหนดน้ำกิจกรรม (สะสม) ที่ดำเนินการโดยใช้อุปกรณ์ Decagon CX-1 น้ำกิจกรรม (Decagon เด - vices พูลแมน WA สหรัฐอเมริกา), ตามคำแนะนำของผู้ผลิต2.6. สถิติวิเคราะห์สถิติวิเคราะห์ทั้งหมดที่ดำเนินการโดยใช้โปรแกรม Statistica 8.0 com puter สำหรับ Windows (Statsoft Inc., Tulsa ตกลง สหรัฐอเมริกา) ความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญระหว่างตัวอย่างที่แตกต่างกัน ระหว่างสอง salting ครั้งน้ำมันมะกอก และพริกขี้หนูผลถูกกำหนดโดยใช้ผลต่างของการวิเคราะห์ b ระดับนัยสำคัญ P 0.05, P b 0.01 และ P b 0.001

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.3 การสกัดดีเอ็นเอจากแยก
สกัดดีเอ็นเอได้ดำเนินการตามวิธีการอธิบายโดย Soumet, Ermel, Fach และโคลิน (1994) สายพันธุ์ที่ปลูกในน้ำซุปถั่วเหลือง Tryptone (TSB) (Oxoid) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 ° C; เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาทีและเม็ดได้ถูกระงับใน 200 ไมโครลิตรกลั่นทวีคูณน้ำหมัน หลังจากที่ความร้อนที่ 100 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 15 นาทีหลอดถูกวางไว้บนน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาทีและจากนั้น
หมุนเหวี่ยงที่ 12,000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาที สุดท้ายใส (สารสกัดจาก DNA) ที่ถูกเก็บไว้ที่. - 20 ° C
2.4 บัตรประจำตัวของสายพันธุ์โดยวิธี PCR
ไอโซเลทซึ่งเบื้องต้นจัดเป็นแกรมบวกและ catalase บวกถูกระบุโดยวิธี PCR multiplex ช่วยให้ประชาชนพร้อมกันของเชื้อ Staphylococcus spp., Staphylococcus xylosus, Staphylococcus epidermidis, Staphylococcus saprophyticus และ Staphylococcus aureus (Morot- Bizot, กรงเล็บและ Leroy, 2004) ในขณะที่มันเป็นไปไม่ได้ที่จะระบุสายพันธุ์ทุกชนิดในระดับ multiplex PCR โดยผู้ที่อยู่ในสกุลเชื้อ Staphylococcus ถูกยัดเยียดให้เป็นวิธี PCR เดียวสายพันธุ์เฉพาะที่ช่วยให้บัตรประจำตัวของสายพันธุ์ eQuorum Staphylococcus ตามขั้นตอนที่อธิบายโดย Blaiotta, Ercolini, Mauriello, Salzano และ Villani (2004) ไพรเมอร์ที่ใช้มีการระบุไว้ในตารางที่ 1
ไอโซเลทซึ่งเบื้องต้นจัดเป็นแกรมบวกและลบ catalase ถูกระบุโดยใช้วิธีการทดสอบ PCR ประเภทที่เฉพาะเจาะจงที่ช่วยให้บัตรประจำตัวของแลคโตบาซิลลัสเอสพีพี โดยใช้ไพรเมอร์ lactoF / lactoR (Byun et al., 2004) แยกเป็นของจำพวกแลคโตบาซิลลัสที่ถูกระบุในระดับสายพันธุ์โดยใช้สองการตรวจ PCR อิสระเพราะความแตกต่างของอุณหภูมิการหลอมเป็นอุปสรรคต่อการพัฒนาของ multiplex PCR ไพรเมอร์สายพันธุ์เฉพาะ LbPl1 LbPl2 และถูกนำมาใช้เพื่อระบุตัวตนของ Lactobacillus plantarum (Quere, Deschamps และ Urdaci, 1997) และ 16FOR และ LSakeR สำหรับบัตรประจำตัวของแลคโตบาซิลลัส sakei (Rachman et al., 2004) แยกที่ไม่สามารถกำหนดให้กับชนิดแลคโตบาซิลลัสถูกยัดเยียดให้ทดสอบ PCR Enterococcus ประเภทที่เฉพาะเจาะจงโดยใช้ไพรเมอร์ EntF / Entr (Ke et al., 1999) ไพรเมอร์สายพันธุ์ที่เฉพาะเจาะจง FK1 / FK2 และ Fae1 / Fae2 ถูกนำมาใช้สำหรับการระบุของ Enterococcus faecalis และ Enterococcus faecium ตามลำดับโดยใช้วิธีการหลายวิธี PCR (Dutka-Malen, Evers และ Courvalin, 1995).
ขนาดของผลิตภัณฑ์พีซีอาร์ที่ได้รับการตรวจสอบ 1% agarose เจล electropho- resis ในบัฟเฟอร์ TBE (40 มิลลิ Tris-borate 89 มิลลิกรดบอริก, 2 มิลลิ EDTA; ค่า pH 8) โดยใช้บันไดดีเอ็นเอ 100 bp (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) เป็นเครื่องหมาย เจลถูกย้อมด้วย ethidium-โบรไมด์และวงดนตรีที่ได้รับการมองเห็นภายใต้แสงยูวี.
2.5 การวิเคราะห์ทางเคมีกายภาพ
เกลือได้รับการประเมินตามมาตรฐานการแนะนำโดยอ้าง Marra, Salgado, ฆีและ Carballo (1999) พีเอชที่ได้รับการวัดโดยใช้เครื่องวัดค่า pH ค่า pH ไมโคร 2002 (เครื่องมือ Crison, บาร์เซโลนา, สเปน) หลังจากผสม 10 กรัมของกลุ่มตัวอย่าง 90 มิลลิลิตรของน้ำกลั่นเป็นเวลา 2 นาทีใน Sorvall Omnimixer homogenizer (Omni นานาชาติด้วยการป้องกันน้ำฝัง, CT, สหรัฐอเมริกา) การกำหนดกิจกรรมทางน้ำ (มีอั) ได้รับการดำเนินการโดยใช้เครื่องมือรูปสิบเหลี่ยม CX-1 ระบบน้ำกิจกรรม (ความชั่วร้ายรูปสิบเหลี่ยม De- โรงแรมพูลแมน, WA, USA) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต.
2.6 การวิเคราะห์ทางสถิติ
วิเคราะห์ทางสถิติทั้งหมดถูกดำเนินการโดยใช้ Statistica 8.0 โปรแกรม puter สั่งสำหรับ Windows (Statsoft อิงค์ทูลซา, สหรัฐอเมริกา) ความแตกต่างที่สำคัญระหว่างกลุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกันระหว่างสองครั้งเกลือและผลน้ำมันมะกอกและพริกขี้หนูได้รับการพิจารณาโดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนที่มีระดับความสำคัญ P ข 0.05, P ข 0.01 และ P ข 0.001

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.3 การสกัดดีเอ็นเอจากเชื้อ
การสกัดดีเอ็นเอได้ดำเนินการตามวิธีการที่อธิบายโดย soumet ermel fach , , , และ โคลิน ( 1994 ) การเจริญเติบโตในทริพโทนซุปถั่วเหลือง ( TSB ) ( oxoid ) เป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่อุณหภูมิ 37 องศา C ; เซลล์ถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยงที่ 12000 ×กรัมเป็นเวลา 5 นาที และได้ถูกระงับการใน 200 เม็ดμผมเป็นหมันทวีคูณกลั่นน้ำหลังจากความร้อนที่อุณหภูมิ 100 องศา C เป็นเวลา 15 นาที หลอดอยู่ในน้ำแข็งเป็นเวลา 5 นาทีและจากนั้น
ระดับที่ 12 × G 10 นาทีในที่สุด น่าน ( สกัดดีเอ็นเอ ) คืออุณหภูมิ− 20 ° C .
2.4 . การจำแนกชนิดของเชื้อโดยวิธี PCR
แยกได้ ซึ่งเบื้องต้นจัดเป็นเชื้อแกรมบวกและสามารถระบุได้โดยวิธีการบวก multiplex PCR ช่วยให้ตัวพร้อมกันของ Staphylococcus spp . , Staphylococcus xylosus อาหารแบคทีเรีย Staphylococcus , saprophyticus และ Staphylococcus aureus ( morot bizot ทาลอน& Leroy , 2004 )มันไม่ได้เป็นไปได้ที่จะระบุทุกไอโซเลทที่ระดับโดย multiplex PCR ชนิดเหล่านั้นของแบคทีเรียสกุลถูกเดียวเฉพาะ - ขยายพันธุ์ วิธีพีซีอาร์ให้ตัวของแบคทีเรีย equorum ชนิดตามขั้นตอนที่อธิบายโดย blaiotta ercolini mauriello salzano , , , , และ villani ( 2004 ) ไพรเมอร์ที่ใช้อยู่ใน ตารางที่ 1 .
แยกได้ ซึ่งเบื้องต้นจัดเป็นเชื้อแกรมบวกและลบสามารถระบุวิธีการของพืชโดยเฉพาะโดยให้ระบุชนิด Lactobacillus ใช้ไพรเมอร์ lactof / lactor ( บุน et al . , 2004 )สายพันธุ์ที่เป็นของสกุลแลคโตบาซิลลัสที่ถูกระบุในสายพันธุ์ระดับโดยใช้สองวิธี PCR อิสระ เพราะความแตกต่างของอุณหภูมิการอบอ่อนที่เป็นอุปสรรคต่อการพัฒนาเทคนิค multiplex ไพรเมอร์ชนิดที่เฉพาะเจาะจงและ lbpl1 lbpl2 ถูกใช้เพื่อระบุตัวตนของ Lactobacillus plantarum ( quere Deschamps & urdaci , ,1997 ) และ 16for และ lsaker เพื่อระบุตัวตนของ Lactobacillus sakei ( ราชมัน et al . , 2004 ) สายพันธุ์ที่ไม่สามารถมอบหมายในสกุล Lactobacillus ถูกไปเอ็นเทโรค็อกคัสสกุลเฉพาะ PCR assay โดยใช้ไพรเมอร์ entf / ยา ( Ke et al . , 1999 ) ไพรเมอร์ชนิดที่เฉพาะเจาะจงและ fk1 / fk2 fae1 / fae2 ถูกใช้เพื่อระบุตัวตนของเอ็นเทโรค็อกคัส และเอ็นเทโรค็อกคัสจากออกซิเจน ,ตามลำดับ โดยความหมายของเทคนิค multoplex PCR ( dutka malen Evers & , courvalin , 1995 ) .
ขนาดของผลิตภัณฑ์ PCR ถูกตรวจสอบโดย 1% เจล electropho - รีซิซในทีบีบัฟเฟอร์ ( 40 มม. นอกจากนี้ – บอเรต , 89 มม. boric acid 2 mM EDTA ; พีเอช 8 ) ใช้ 100 BP ดีเอ็นเอบันได ( Invitrogen Carlsbad , CA , USA ) เป็นเครื่องหมาย เจลเปื้อนโบรไมด์คู่และวงดนตรีได้มองเห็นแสงยูวี .
2.5และวิเคราะห์ปริมาณเกลือ
ประเมินตามมาตรฐานที่แนะนำโดยอ้างเซ็นโซ มาร์รา salgado ี้ ปรีเ ต , , , และ carballo ( 1999 ) ค่า pH คือการวัดโดยใช้เครื่องวัด pH 2002 ( เครื่องมือ crison ไมโคร , บาร์เซโลนา , สเปน ) หลังจากผสม 10 กรัม จำนวน 90 มล. น้ำกลั่น 2 นาทีใน sorvall omnimixer โฮโมจิไนซ์ ( Omni นานาชาติ , น้ำ - ฝัง , CT , สหรัฐอเมริกา )การกำหนดกิจกรรมน้ำ ( AW ) มีการใช้น้ำ ( ระบบกิจกรรม cx-1 สิบเหลี่ยมอุปกรณ์สิบเหลี่ยม de - vices , พูลแมน , WA , USA ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต
2.6 สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล สถิติที่ใช้วิเคราะห์
มีการปฏิบัติการใช้ statistica 8.0 - puter com โปรแกรมสำหรับ Windows ( StatSoft อิงค์ ทัลซ่า โอเค , USA ) ความแตกต่างระหว่างกลุ่มตัวอย่างที่แตกต่างกันระหว่างสองเกลือครั้งและผลกระทบน้ำมันและพริกมะกอกวิเคราะห์โดยใช้การวิเคราะห์ความแปรปรวนกับ P B อย่างมีนัยสำคัญทางสถิติที่ระดับ 0.05 , 0.01 และ 0.001 P P B B .