2. Materials andmethods2.1. Yeast s

2. Materials andmethods
2.1. Yeast strains
Ninety-three yeast isolates from mawè, gowé, ogi and tchoukoutou,
previously identified (Greppi et al., 2013a,b), were investigated in this
study. They belong to nine species namely: P. kudriavzevii (n = 44),
S. cerevisiae (n = 20), Clavispora lusitaniae (n = 13), K. marxianus
(n = 3), Millerozyma farinosa (n = 3), Candida glabrata (n = 3),
Wickerhamomyces anomalus (n = 2), Hanseniaspora guilliermondii
(n=3) and Debaryomyces nepalensis (n = 2). The isolate names were
given as follows: the first letter represents the sample (M-G-O-T)
followed by the progressive number of isolation. A genetically modified
strain able to produce phytases constitutively was used as positive control
(S. cerevisiae BY80, Euroscarf Acc. No. YO1692). All the isolateswere
stored at −80 °C in YPD medium (1% yeast extract (BD, Brøndby,
Denmark), 2% glucose (Merk, Darmstadt, Germany), 2% bacto-peptone
(BD), 15 g/l bacto agar (BD)) with 30% (v/v) glycerol.
2.2. Screening of phytase producing isolates
The ability of the isolates to grow in the presence of phytate as a
unique phosphate source was tested on solid and liquid media as described
by Nuobariene et al. (2011). Briefly, three different defined
media were prepared: Delft Phy, a medium containing phytic acid
dipotassium salt (1850 mg/l; Sigma P5681) as a unique phosphate
source, Delft+, a medium containing phosphate (3510 mg/l) but no
phytate, used as positive control, and Delft−, a phosphate-free medium,
used as negative control. The protocols for preparation and composition
of each medium were reported by Nuobariene et al. (2011). Few
yeast colonies were inoculated in 10 ml sterile YPD medium and cultivated
overnight in a water bath at 30 °C with shaking (170 rpm/min).
Yeasts cultures, OD600 level set at 0.1, were transferred in 50 ml of
YPDmediumand cultivated for 10 h in a water bath at 30 °Cwith shaking
(170 rpm/min). Subsequently, cells were spun down (Hermle Z216
MK, Germany) at 5000 ×g for 10 min, 4 °C, and the cell pellet was
washed three times with 20 ml of sterile ultrapure water. The cell concentrationwas
thereafter adjusted to an initial OD600=1.0. Two microliters
of the 10−3 dilutionwas spotted in triplicates on Delft Phy, Delft+
and Delft−agar plates. The plates were incubated at 25 °C for 72 h and
photographed afterwards. The growthwas estimated bymeasuring the
diameter of the colonies. Considering the same diameter range on
Delft+ medium, results on Delft Phy plates were considered: negative
(−), weak growth (+) when colony diameter was lower than 0.5 cm,
normal growth (++) when diameter crossed 0.5 cm, high growth
(+++) for all colonies reaching 1 cm and intense growth (++++)
for colonies exceeding 1 cm. For liquid growth tests, 96-well microtiter
plates (92096, TPP), wells were filled in triplicate with 200 μl of corresponding
medium, inoculated with 2 μl of prepared yeast inocula and
cultivated at 25 °C for 48 h. Yeast growth was monitored at OD600
using a Microplate reader (Varioskan Flash, Thermo Scientific, MA,
USA). Measurements were taken every 2 h and 3 s shaking (300 rpm)
was applied prior to data acquisition. For each medium, ln(ODtx /
ODt = 0) for each time point was determined and standard deviation of
three measurements was calculated. For each strain, OD600 measured at
48h inDelft Phywas related to theOD600 in Delft+medium. S. cerevisiae
BY80was used as positive control for all the growth-based tests.
2.3. P. kudriavzevii phytase gene expression
2.3.1. Yeast strains and growth conditions
Based on the results from the screening tests, five P. kudriavzevii
strains were selected for further analysis. Four of them showed a high
growth rate in Delft Phy (G6, G5, M31 and M30) while one failed to
grow in Delft Phy medium (M16). Yeast inoculum was prepared as
described above. Cells in exponential phase were used for inoculation
of Delft Phy (100 ml) and Delft+ to an initial OD600 = 1.0. For extraction
of total RNA, cells were spun down (1000 ×g for 1 min, 4 °C) at 0,
2, 4, 6, 8, 10, 14, 24 and 48 h. All pellets were frozen at −20 °C in the
presence of RNAlater (50 μl) and stored until RNA extraction.
2.3.2. RNA extraction, quantification and reverse transcription
Total RNA was isolated using Total RNA Mini Kit (Qiagen, Hilden,
Germany) according to the supplier's manual. Cell lysis was performed
by a step of bead-beating (3× 45 s, 4.5 m/s) in β-mercaptoethanol
(600 μl) (Fast Prep, FP120 BIO 101, Savant, Santa Ana, CA, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2. วัสดุ andmethods2.1. ยีสต์90 3 ยีสต์ที่แยกได้จาก mawè, gowé, ogi และ tchoukoutouระบุไว้ก่อนหน้านี้ (Greppi et al., 2013a, b), ถูกสอบสวนในศึกษา พวกเขาเป็นเก้าชนิดได้แก่: P. kudriavzevii (n = 44),S. cerevisiae (n = 20), Clavispora lusitaniae (n = 13), คุณ marxianus(n = 3), Millerozyma farinosa (n = 3), โรคไข่ (n = 3),Wickerhamomyces anomalus (n = 2), Hanseniaspora guilliermondii(n = 3) และ Debaryomyces nepalensis (n = 2) ชื่อแยกได้ให้เป็นดังนี้: ตัวอย่าง (M-G-O-T) หมายถึงตัวอักษรแรกตาม ด้วยหมายเลขก้าวหน้าแยก ดัดแปลงพันธุกรรมต้องใช้ผลิต phytases constitutively สามารถใช้เป็นควบคุมบวก(S. cerevisiae BY80 หมายเลขบัญชี Euroscarf YO1692) Isolateswere ทั้งหมดเก็บไว้ที่ −80 ° C ใน YPD (สารสกัดจากยีสต์ 1% (BD, Brøndbyเดนมาร์ก), bacto-peptone 2%, 2% กลูโคส (Merk ดาร์มส เยอรมนี)(BD), 15 g/l bacto agar (BD)) กับกลีเซอร 30% (v/v)2.2 การตรวจคัดกรองของคุณสมบัติที่ผลิตที่แยกได้ความสามารถของการแยกการเติบโตในต่อหน้าของ phytate เป็นการแหล่งฟอสเฟตเฉพาะทดสอบบนสื่อที่เป็นของแข็ง และของเหลวตามที่อธิบายไว้โดย Nuobariene et al. (2011) สั้น ๆ สามอื่นกำหนดมีเตรียมสื่อ: Delft Phy สื่อที่ประกอบด้วยไฟเตตเกลือ dipotassium (1850 mg/l ซิก P5681) เป็นฟอสเฟตเฉพาะแหล่งที่มา Delft + สื่อที่ประกอบด้วยฟอสเฟต (3510 mg/l) แต่ไม่มีphytate ใช้เป็นควบคุมบวก Delft− สื่อฟรีฟอสเฟตใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบ โพรโทคอลที่การเตรียมองค์ประกอบของแต่ละสื่อได้รายงานโดย Nuobariene et al. (2011) ไม่กี่inoculated ใน 10 ml ใส่ YPD และ cultivated อาณานิคมยีสต์นอนในอ่างน้ำที่ 30 ° C มีสั่น (170 rpm/min)มีการถ่ายโอนวัฒนธรรม yeasts ระดับ OD600 ที่ตั้งค่าไว้ที่ 0.1 ใน 50 ml ของYPDmediumand cultivated สำหรับ h 10 ในอ่างน้ำที่ 30 ° Cwith สั่น(170 rpm/นาที) ในเวลาต่อมา เซลล์ถูกปั่นลง (Hermle Z216เอ็มเค เยอรมนี) ที่ซื้อ 5000 g 10 นาที 4 ° C และเม็ดเซลล์ถูกล้าง 3 ครั้ง ด้วยปริมาณ 20 ml น้ำ ultrapure กอซ Concentrationwas เซลล์หลังจากนั้นปรับเป็น OD600 เริ่มต้น = 1.0 Microliters สองของ dilutionwas 10−3 ที่พบใน triplicates บน Delft Phy, Delft +และแผ่น Delft−agar แผ่นก็ incubated ที่ 25 ° C สำหรับ 72 h และถ่ายหลังจากนั้น Growthwas การประเมิน bymeasuringเส้นผ่าศูนย์กลางของอาณานิคม พิจารณาช่วงเส้นผ่าศูนย์กลางเดียวกันในDelft + กลาง ผลบนแผ่น Delft Phy ได้ถือ: ลบ(−) เจริญเติบโตที่อ่อนแอ (+) เมื่อเส้นผ่าศูนย์กลางโคโลนีน้อยกว่า 0.5 cmเจริญเติบโตปกติ (++) เมื่อเส้นผ่าศูนย์กลาง 0.5 ซม. สูงเจริญเติบโตที่เดินข้าม(+++) สำหรับอาณานิคมทั้งหมดถึง 1 ซ.ม.และเติบโตรุนแรง (+++)สำหรับอาณานิคมเกิน 1 ซม. สำหรับการทดสอบการเจริญเติบโตของเหลว microtiter 96-ดีแผ่น (92096, TPP), บ่อเต็มไปใน triplicate กับ μl 200 ของที่สอดคล้องปานกลาง inoculated กับ μl 2 ของ inocula ยีสต์ที่เตรียมไว้ และcultivated ที่ 25 ° C สำหรับ 48 h. ยีสต์เจริญเติบโตถูกตรวจสอบที่ OD600ใช้อ่าน Microplate (แฟลช Varioskan วิทยาศาสตร์เทอร์โม MAสหรัฐอเมริกา) วัดที่ถ่ายทุก h 2 และ 3 s งก ๆ (300 rpm)นำมาใช้ก่อนซื้อข้อมูล แต่ละขนาดกลาง ln(ODtx /ODt = 0) สำหรับแต่ละจุดเวลามีค่าเบี่ยงเบนที่กำหนด และมาตรฐานของวัดที่สามไม่ได้ สำหรับแต่ละต้องใช้ OD600 วัดinDelft 48h Phywas ที่เกี่ยวข้องกับ theOD600 ใน Delft + กลาง S. cerevisiaeBY80was ที่ใช้เป็นตัวควบคุมค่าบวกสำหรับทดสอบทั้งหมดเติบโตขึ้น2.3. P. kudriavzevii คุณสมบัติยีน2.3.1. ยีสต์สายพันธุ์และสภาพการเจริญเติบโตตามผลลัพธ์จากการทดสอบการคัดกรอง P. 5 kudriavzeviiสายพันธุ์ที่เลือกสำหรับการวิเคราะห์เพิ่มเติม สี่พบมากอัตราการเติบโตใน Phy Delft (G6, G5, M31 และ M30) ขณะหนึ่งไม่สามารถเติบโตใน Delft Phy (M16) มีเตรียม inoculum ยีสต์เป็นอธิบายไว้ข้างต้น ใช้สำหรับ inoculation เซลล์ในระยะเนนPhy Delft (100 ml) และ Delft + เพื่อ OD600 การเริ่มต้น = 1.0 สำหรับแยกของอาร์เอ็นเอรวม เซลล์ถูกปั่นลง (1000 × g ใน 1 นาที 4 ° C) ที่ 02, 4, 6, 8, 10, 14, 24 และ 48 h ขี้ทั้งหมดถูกแช่แข็งที่ −20 ° C ในการของ RNAlater (50 μl) และเก็บไว้จนสกัดอาร์เอ็นเอ2.3.2. อาร์เอ็นเอสกัด นับ และ transcription ย้อนอาร์เอ็นเอทั้งหมดถูกแยกโดยใช้อาร์เอ็นเอรวมมินิชุด (Qiagen, Hildenเยอรมนี) ตามคู่มือของผู้ผลิต ทำการ lysis เซลล์โดยขั้นตอนของลูกปัดทั้ง (3 × 45 s, 4.5 m/s) ในβ-mercaptoethanol(600 μl) (เตรียมอย่างรวดเร็ว FP120 ชีวภาพ 101, Savant ไทเป CA, USA)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2 . วิธีการวัสดุ
2.1 . ยีสต์สายพันธุ์ยีสต์ที่แยกได้จาก
เก้าสิบสามบาท . โกว , กระเพาะปลา , โอกิ และ tchoukoutou
, ระบุก่อนหน้านี้ ( greppi et al . , 2013A , B ) ศึกษาในการศึกษานี้

พวกเขาอยู่ถึง 9 ชนิดคือ : P kudriavzevii ( n = 44 )
S . cerevisiae ( n = 20 ) , clavispora lusitaniae ( n = 13 ) , K . marxianus
( n = 3 ) millerozyma farinosa ( n = 3 ) , Candida flava ( n = 3 ) ,
wickerhamomyces anomalus ( n = 2 ) , hanseniaspora guilliermondii
( n = 3 ) และ debaryomyces nepalensis ( n = 2 ) แยกชื่อ
ได้รับดังนี้ : จดหมายฉบับแรกแสดงถึงตัวอย่าง ( m-g-o-t )
ตามด้วยหมายเลขของการแยก การดัดแปลงทางพันธุกรรมสายพันธุ์ที่สามารถผลิต phytases

constitutively ใช้ควบคุมบวก ( S . cerevisiae by80 euroscarf ACC , ไม่ yo1692 )ทั้งหมด isolateswere
อุณหภูมิ− 80 ° C ใน ypd ขนาดกลาง ( สารสกัดจากยีสต์ 1 % ( BD , BR ขึ้น ndby
, เดนมาร์ก ) กลูโคส 2 % ( นั่นดาร์มสตัดท์ , เยอรมนี ) , 2% Bacto เปปโตน
( BD ) 15 กรัม / ลิตร Bacto ( BD ) 30 % ( V / V ) กลีเซอรอล .
2.2 . การคัดเลือกและการผลิตไอโซ
ความสามารถของเชื้อจะเจริญเติบโตในที่ที่มีไฟเตทเป็นแหล่งฟอสเฟต
้ได้รับการทดสอบในของแข็งและของเหลวเป็นสื่ออธิบาย
โดย nuobariene et al . ( 2011 ) สั้น ๆ ทั้งสามต่างนิยาม
สื่อเตรียม : Delft phy , อาหารที่มีกรดไฟติก
ไดเกลือ ( 850 mg / l ; Sigma p5681 ) เป็นเฉพาะฟอสเฟต
แหล่ง , เดลฟต์ , อาหารที่มีฟอสเฟต ( 3510 mg / L )
: แต่ไม่ใช้เป็นตัวควบคุมบวกและเดลฟท์− , ฟอสเฟตฟรีขนาดกลาง
ใช้ควบคุมลบโปรโตคอลสำหรับการเตรียมการและองค์ประกอบของแต่ละสื่อได้รายงานโดย
nuobariene et al . ( 2011 ) อาณานิคมไม่ปลูกเชื้อยีสต์ในอาหาร
ypd ปลอดเชื้อและปลูก
ค้างคืนในอ่างน้ำที่ 30 ° C เขย่า 10 ml ( 170 รอบ / นาที )
วัฒนธรรมยีสต์ od600 ไว้ที่ระดับ 0.1 , ถูกย้ายใน 50 มล.
ypdmediumand ปลูก 10 H ในอ่างน้ำที่ 30 องศา cwith สั่น
( 170 รอบ / นาที ) ต่อมา เซลล์ก็ปั่นลง ( เฮอร์เมิล z216
MK , เยอรมนี ) ที่ 5000 × G สำหรับ 10 นาที , 4 ° C และเซลล์เม็ดคือ
ล้าง 3 ครั้ง 20 มล. ปราศจากเชื้อบริสุทธิ์มากน้ำ เซลล์ concentrationwas
หลังจากนั้นปรับเริ่มต้น od600 = 1.0 สองตัวเลข
ของ 10 − 3 dilutionwas ด่าง 3 ซ้ำในเดลฟต์ PHY และเดลฟท์
, เดลฟต์−วุ้นแผ่นแผ่นอุณหภูมิ 25 ° C เป็นเวลา 72 ชั่วโมงและ
ถ่ายภาพหลังจากนั้น การประมาณโดย growthwas
เส้นผ่าศูนย์กลางของอาณานิคม พิจารณาช่วงเส้นผ่าศูนย์กลางเดียวกัน
เดลฟท์ ปานกลาง , ผลลัพธ์ในเดลฟต์ phy จานถือว่า : ลบ
( − ) , การเจริญเติบโตที่อ่อนแอ ( ) เมื่อขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางโคโลนีน้อยกว่า 0.5 ซม.
การเจริญเติบโตปกติ ( ) เมื่อขนาดเส้นผ่าศูนย์กลาง 0.5 ซม.
ข้าม , การเจริญเติบโตสูง( ) สําหรับอาณานิคมถึง 1 ซม. และการเจริญเติบโตที่รุนแรง ( )
สำหรับอาณานิคมเกิน 1 เซนติเมตร สำหรับการทดสอบการเจริญเติบโตของของเหลว , 96 ดีไมโคร
แผ่น ( 92096 TPP , ) , บ่อเต็มทั้งสามใบด้วย 200 ลิตรμสอดคล้องกัน
ปานกลาง ใส่ 2 μล. เตรียม inocula ยีสต์และบ่มที่อุณหภูมิ 25 ° C
48 ชั่วโมง ยีสต์คือการตรวจสอบใน od600
ใช้พื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่าน varioskan แฟลชเทอร์โมวิทยาศาสตร์
, MA , USA ) การวัดทุก 2 ชั่วโมงและ 3 s สั่น ( 300 รอบต่อนาที )
ใช้ก่อนการเก็บข้อมูล สำหรับแต่ละ ( ln ( odtx /
odt = 0 ) สำหรับแต่ละจุดเวลาที่ถูกกำหนด และส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐานของ
3 วัดคือการคำนวณ สำหรับแต่ละสายพันธุ์ od600 วัดที่เลี้ยง indelft
phywas เกี่ยวข้องกับ theod600 ใน เดลฟท์ ปานกลาง S . cerevisiae
by80was ใช้เป็นตัวควบคุมบวกสำหรับการเจริญเติบโตตามการทดสอบ .
2.3 หน้า kudriavzevii ระดับการแสดงออกของยีน
2.3.1 . สายพันธุ์ยีสต์และเงื่อนไขการเจริญเติบโต
ขึ้นอยู่กับผลที่ได้จากการทดสอบการคัดกรอง 5 หน้า kudriavzevii
สายพันธุ์ได้ถูกเลือกสำหรับการวิเคราะห์ต่อไป สี่คน มีอัตราการเติบโตสูง
ในเดลฟต์ phy ( G6 G5 , การพิมพ์และ M30 ) ในขณะที่หนึ่งล้มเหลวที่จะเติบโตในเดลฟท์ ( PHY
( M16 )เชื้อยีสต์ที่เตรียมไว้เป็น
ที่อธิบายข้างต้น เซลล์ระยะ exponential ถูกใช้สำหรับการฉีดวัคซีน
ของเดลฟท์ phy ( 100 มล. ) และเดลฟท์ เพื่อเริ่มต้น od600 = 1.0 สำหรับการสกัด
ของ RNA ทั้งหมด เซลล์ก็ปั่นลง ( 1 × g 1 นาที , 4 ° C ) 0
2 , 4 , 6 , 8 , 10 , 14 , 24 และ 48 ชั่วโมง เม็ดทั้งหมดถูกแช่แข็งที่อุณหภูมิ 20 ° C −
ตนของ rnalater ( 50 μ L ) และ เก็บไว้จนกว่า การสกัด DNA .
2.3.2 .การสกัดอาร์เอ็นเอ ปริมาณและย้อนกลับถอดความ
รวมแยก RNA ใช้ RNA ชุดมินิ ( QIAGEN Hilden เยอรมนี , ,
) ตามคู่มือของผู้ผลิต การสลายเซลล์แสดง
โดยขั้นตอนของลูกแก้วเต้น ( 3 × 45 S , 4.5 m / s ) ในบีตา - mercaptoethanol
( 600 μ L ) ( รวดเร็วเตรียม fp120 ไบโอ 101 , เมธี , ซานตาอานา , แคลิฟอร์เนีย , สหรัฐอเมริกา