MATERIALS AND METHODS Birds Used Al

MATERIALS AND METHODS Birds Used All experimental procedures involving live embryos older than 6 d of incubation were approved by the Faculty of Agricultural, Life and Environmental Sciences Animal Policy and Welfare Committee at the University of Alberta (Edmonton, Alberta, Canada) according to the guidelines outlined by the Canadian Council on Animal Care (1993).
Daily Embryo Weight A total of 540 Ross 308 broiler-breeder hatching eggs were obtained from 33-wk-old flocks, placed on racks, and stored for 4 and 14 d under light between 16 and 18°C and 70 to 80% RH. The hatchery light was obtained from fluorescent bulbs, which did not contribute any significant heat to the cooler. To arrive at storage durations of 4 and 14 d, half of the eggs were first obtained and stored for 10 d, after which the eggs stored for 4 d were obtained. Both were then stored for an additional 4 d before incubation. The hatchery conditions met standard conditions of a typical hatchery in Alberta. The egg collection and storage practices were repeated when the flock age reached 37 wk. For each trial, a total of 270 eggs per storage treatment were
incubated at 37.5°C and 56 to 57% RH, and in the last 3 d, the eggs were transferred into a hatcher with a temperature of 36.9°C and 60% RH. Beginning at 4 d and up to 21 d of incubation, 30 eggs (15 eggs/storage treatment) were opened to determine daily embryonic wet weight. The wet samples were dried in an oven (Despatch V Series, model VRC2-26-IE, Despatch, Minneapolis, MN) at 65°C for 4 d to obtain the DM weight.
Cellular and Molecular Evaluation of Apoptosis and Necrosis Blastoderm Preparation. Three groups of 120 freshly laid fertile hatching eggs were also obtained from Ross 308 experimental flocks, divided into 2 groups, and stored as mentioned above. For each storage treatment, whole blastoderms with an intact area pellucida and area opaca were obtained and separated into individual cells for analysis on a flow cytometer (BD FACScan, Becton Dickinson and Co., San Jose, CA) as described previously (Hamidu et al., 2010). To separate each blastoderm, it was aspirated twice at 10 and 20 min in a 50μL, prewarmed (37°C), commercially available 0.25% trypsin:0.04% EDTA solution (Invitrogen Canada Inc., Burlington, Ontario, Canada) after incubation at 37°C. A total of 40 blastoderms were isolated and pooled together per storage treatment, and an aliquot of 100 μL of cell suspension containing approximately 5.0 × 105 cells was stained with annexin V-fluorescein isothiocyanate (Annexin V) and propidium iodide (PI) fluorescent dyes to differentiate between apoptotic and necrotic cell populations (Molecular Probes Inc., Eugene, OR). The cell suspensions were subjected to flow cytometry data analysis (BD FACScan) to differentiate between live or viable cells (Annexin V−/PI−), early apoptotic cells (Annexin V+/PI), necrotic cells (Annexin V−/PI+), and late apoptotic-necrotic cells (Annexin V+/PI+). The data were confirmed by ImageStream multispectral flow cytometry analysis (Amnis Corporation, Seattle, WA) with a photo snapshot of each cell passing through the flow chamber as reported previously (Hamidu et al., 2010). RNA Extraction and First-Strand cDNA Synthesis. In a similar manner, hatching eggs obtained from Ross 308 flocks were stored for 4 and 14 d, as outlined previously for gene expression analysis of typical apoptosis genes. Forty eggs per storage treatment were used; intact blastoderms were isolated by using ribonucleasefree water, pooled together, and snap-frozen in liquid nitrogen for further studies. An additional 36 eggs from each storage treatment were incubated for 6 d at 37.5°C and 56 to 57% RH for gene expression analysis of growing embryos. The 6 d of incubation was chosen because, at this time point, practically all embryonic morphology was present and the RNA extracted was a representative sample of the entire embryo body. The embryos were harvested under sterile conditions

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการนกใช้ทดลองกระบวนงานทั้งหมดเกี่ยวข้องกับโคลนอยู่มากกว่า 6 d ของคณะทันตแพทยศาสตร์ได้รับการอนุมัติ โดยคณะของเกษตร ชีวิต และสิ่งแวดล้อมวิทยาศาสตร์สัตว์นโยบาย และคณะ กรรมการสวัสดิการมหาวิทยาลัยเบอร์ (เอ็ดมันตัน อัลเบอร์ตา แคนาดา) ตามแนวทางที่ล้อมกรอบ ด้วยสภาแคนาดาในสัตว์ดูแล (1993)ทุกวันตัวอ่อนน้ำหนักของไข่ฟักไข่ไก่เนื้อพันธุ์ Ross 308 540 ได้รับมาจากอายุ 33 wk จำนวนเกือบเท่าเดิม วางบนชั้นเก็บสินค้า และเก็บไว้ใน d 4 และ 14 ภายใต้แสงระหว่าง 16 และ 18 ° C และ 70-80% RH ไฟโรงเพาะได้รับจากหลอดเรืองแสง ที่ไม่นำความร้อนที่สำคัญใด ๆ การแช่เย็นการ ไปถึงช่วงเวลาเก็บของ d 4 และ 14 ครึ่งของไข่ครั้งแรกได้รับ และเก็บไว้สำหรับ 10 d หลังจากได้รับไข่ที่ถูกเก็บไว้ใน 4 d แล้วทั้งสองถูกเก็บไว้ใน d 4 เพิ่มเติมก่อนที่คณะทันตแพทยศาสตร์ เงื่อนไขโรงเพาะตามเงื่อนไขมาตรฐานของโรงเพาะปกติในอัลเบอร์ตา แนวทางเก็บรวบรวมและเก็บไข่ได้ซ้ำเมื่อแกะอายุ 37 wk สำหรับการทดลองแต่ละ จำนวนไข่ 270 ต่อเก็บรักษาได้ incubated ที่ 56-57% RH และ 37.5° C และ d 3 ล่าสุด ไข่ถูกโอนเข้า hatcher กับไข้ 36.9 องศาเซลเซียสและ 60% RH เริ่มต้นที่ 4 d และค่าการ d 21 ของคณะทันตแพทยศาสตร์ ไข่ 30 (15 ไข่/เก็บรักษา) ก็กำหนดน้ำหนักเปียกทุกวันตัวอ่อน ตัวอย่างเปียกได้แห้งในเตาอบ (ส่งออก V ชุด รุ่น VRC2-26-IE ส่งออก มิ MN) ที่ 65° C สำหรับ d 4 รับน้ำหนัก DMการประเมินระดับโมเลกุล และเซลล์ Apoptosis และการตายเฉพาะส่วน Blastoderm เตรียม กลุ่ม 120 เอาสดอุดมฟักไข่ไข่ได้รับจาก Ross 308 ทดลองจำนวนเกือบเท่าเดิม ยังแบ่งออกเป็น 2 กลุ่ม และเก็บไว้ดังกล่าวข้างต้น สำหรับแต่ละเก็บรักษา blastoderms ทั้งหมดที่ตั้งเหมือนเดิม pellucida และ opaca ตั้งได้รับ และแบ่งออกเป็นเซลล์แต่ละเซลล์สำหรับการวิเคราะห์ในการ cytometer กระแส (BD FACScan, Becton สัน และ บริษัท San Jose, CA) อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Hamidu et al., 2010) แยกแต่ละ blastoderm มันถูก aspirated ครั้งที่ 10 และ 20 นาทีใน 50μL, prewarmed (37° C) ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ 0.25% trypsin:0.04% EDTA โซลูชั่น (Invitrogen Canada Inc. เบอร์ลิงตัน Ontario ประเทศแคนาดา) หลังจากบ่มที่ 37 องศาเซลเซียส จำนวน 40 blastoderms ถูกแยก และรวมกันต่อเก็บรักษา และเป็นส่วนลงตัวของ μL 100 การระงับเซลล์เซลล์ประมาณ 5.0 × 105 ถูกสี ด้วย annexin V fluorescein isothiocyanate (Annexin V) และไอโอไดด์ (PI) propidium เรืองแสงสีเพื่อแยกความแตกต่างระหว่าง apoptotic necrotic เซลล์ประชากร (โมเลกุล Probes Inc., Eugene, OR) บริการเซลล์ถูกต้องวิเคราะห์ข้อมูลเซลล์กระแส (BD FACScan) เพื่อแบ่งแยกระหว่างถ่ายทอดสด หรือการทำงานเซลล์เซลล์ apoptotic (Annexin V−/PI−), ก่อน (Annexin V + /mts PI), เซลล์ necrotic (Annexin V− / PI +), และเซลล์ปลาย apoptotic necrotic (Annexin V + /mts PI +) ข้อมูลถูกยืนยัน โดย ImageStream multispectral เซลล์การวิเคราะห์การไหล (Amnis Corporation ซีแอตเทิล WA) ด้วยภาพถ่ายภาพรวมของแต่ละเซลล์ผ่านหอไหลตามรายงานก่อนหน้านี้ (Hamidu et al., 2010) แยกอาร์เอ็นเอและสแตรนด์แรก cDNA สังเคราะห์ ในลักษณะที่คล้ายกัน ไข่ฟักไข่ที่ได้รับจาก Ross 308 จำนวนเกือบเท่าเดิมถูกเก็บไว้ใน d 4 และ 14 ตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้สำหรับการวิเคราะห์นิพจน์ทั่วไป apoptosis ยีนยีน ใช้ไข่สี่สิบต่อเก็บรักษา blastoderms เหมือนเดิมได้แยกต่างหาก โดยใช้น้ำ ribonucleasefree รวมกัน และ snap แช่ในไนโตรเจนเหลวสำหรับศึกษาเพิ่มเติม ไข่ 36 เพิ่มเติมจากแต่ละเก็บรักษาถูก incubated สำหรับ d 6 ที่ 37.5° C และ 56-57% RH สำหรับวิเคราะห์นิพจน์ยีนการโคลนเติบโต D 6 ของคณะทันตแพทยศาสตร์ได้รับเลือก เพราะ จุดนี้เวลา สัณฐานวิทยาตัวอ่อนทั้งหมดจริงมีอาร์เอ็นเอที่สกัดได้ตัวอย่างตัวแทนของตัวอ่อนทั้งหมด โคลนได้เก็บเกี่ยวผลผลิตภายใต้เงื่อนไขกอซ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการใช้นกทุกขั้นตอนการทดลองที่เกี่ยวข้องกับตัวอ่อนสดที่มีอายุมากกว่า 6 d ของการบ่มได้รับอนุมัติจากคณะเกษตรชีวิตและวิทยาศาสตร์นโยบายสัตว์สิ่งแวดล้อมและคณะกรรมการสวัสดิการที่มหาวิทยาลัยอัลเบอร์ต้า (เอดมันตัน, อัลเบอร์ต้า, แคนาดา) ตามแนวทาง ที่ระบุไว้โดยแคนาดาสภาการดูแลสัตว์ (1993).
ทุกวันตัวอ่อนน้ำหนักรวมของรอสส์ 540 308 ไก่พันธุ์ไข่ฟักไข่ที่ได้รับจากฝูง 33 สัปดาห์เก่าวางอยู่บนชั้นวางและเก็บไว้สำหรับ 4 และ 14 d ภายใต้แสงระหว่าง 16 และ 18 องศาเซลเซียสและ 70-80% RH แสงโรงเพาะฟักที่ได้รับจากหลอดไฟนีออนซึ่งไม่ได้มีส่วนร่วมใด ๆ ที่สำคัญในการให้ความร้อนเย็น ที่จะมาถึงระยะเวลาการเก็บรักษาที่ 4 และ 14 d ครึ่งหนึ่งของไข่ที่ได้รับครั้งแรกและเก็บไว้เป็นเวลา 10 วันหลังจากที่ไข่ที่เก็บไว้เป็นเวลา 4 วันที่ได้รับ ทั้งสองถูกเก็บไว้แล้วสำหรับการเพิ่ม 4 d ก่อนการบ่ม เงื่อนไขในโรงเพาะฟักตามเงื่อนไขมาตรฐานของโรงเพาะฟักทั่วไปในอัลเบอร์ต้า คอลเลกชันไข่และการปฏิบัติจัดเก็บข้อมูลซ้ำเมื่ออายุฝูงถึง 37 สัปดาห์ สำหรับการทดลองแต่ละทั้งหมด 270 ฟองต่อการเก็บรักษาการรักษาที่ถูก
บ่มที่ 37.5 องศาเซลเซียสและ 56-57% RH และในช่วง 3 D, ไข่ถูกย้ายไปแฮทที่มีอุณหภูมิ 36.9 องศาเซลเซียสและ 60% RH . เริ่มต้นที่ 4 d และได้ถึง 21 วันของการบ่ม 30 ไข่ (15 ฟอง / การรักษาการเก็บรักษา) ถูกเปิดเพื่อตรวจสอบน้ำหนักเปียกในชีวิตประจำวันของตัวอ่อน ตัวอย่างเปียกแห้งในเตาอบ (Despatch V ซีรี่ส์รุ่น VRC2-26-IE, การส่ง, มินนิอาโปลิส) ที่ 65 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 4 วันเพื่อให้ได้น้ำหนัก DM.
เซลล์และโมเลกุลประเมินกระบวนการตายของเซลล์เนื้อร้ายและ Blastoderm เตรียม สามกลุ่ม 120 วางฟักไข่สดที่อุดมสมบูรณ์ที่ได้รับจากรอสส์ 308 ฝูงทดลองแบ่งออกเป็น 2 กลุ่มและเก็บไว้ดังกล่าวข้างต้น สำหรับการรักษาจัดเก็บแต่ละ blastoderms ทั้งมีพื้นที่เหมือนเดิม opaca pellucida และพื้นที่ที่ได้รับและแยกออกเป็นแต่ละเซลล์สำหรับการวิเคราะห์การไหล cytometer (BD FACScan, Becton Dickinson และ Co. , San Jose, CA) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Hamidu et al, ., 2010) ที่จะแยก blastoderm แต่ละมันก็สำลักสองครั้งที่ 10 และ 20 นาทีใน50μL, prewarmed (37 ° C) ในเชิงพาณิชย์ trypsin 0.25% 0.04% วิธีการแก้ปัญหา EDTA (Invitrogen แคนาดาอิงค์เบอร์ลิงตัน, Ontario, แคนาดา) หลังจากที่การบ่ม 37 องศาเซลเซียส ทั้งหมด 40 blastoderms ถูกแยกและรวบรวมเข้าด้วยกันรักษาต่อการจัดเก็บและ aliquot 100 ไมโครลิตรของการระงับเซลล์ที่มีประมาณ 5.0 × 105 เซลล์ถูกย้อมด้วยสี annexin V-fluorescein isothiocyanate (Annexin V) และไอโอไดด์ propidium (PI) สีเรืองแสงที่จะ ความแตกต่างระหว่าง apoptotic และประชากรเซลล์ตาย (วัดระดับโมเลกุลอิงค์ Eugene, OR) เซลล์แขวนลอยถูกยัดเยียดให้ไหลภูมิคุ้มกันการวิเคราะห์ข้อมูล (BD FACScan) เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างเซลล์สดหรือที่ทำงาน (Annexin V- / PI-) apoptotic เซลล์ต้น (Annexin V + / PI) เซลล์ตาย (Annexin V- / PI +) และปลายเซลล์ apoptotic-เศษ (Annexin V + / PI +) ข้อมูลที่ได้รับการยืนยันโดยการไหล ImageStream multispectral วิเคราะห์ภูมิคุ้มกัน (Amnis คอร์ปอเรชั่นซีแอตเทิ) กับภาพรวมภาพของเซลล์ที่ผ่านแต่ละไหลผ่านห้องตามที่รายงานก่อนหน้านี้ (Hamidu et al., 2010) อาร์เอ็นเอสกัดและ First-Strand ยีนสังเคราะห์ ในลักษณะที่คล้ายกันฟักไข่ที่ได้รับจากรอสส์ 308 ฝูงถูกเก็บไว้ที่ 4 และ 14 d ที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนของยีน apoptosis ทั่วไป สี่สิบฟองต่อการจัดเก็บรักษาถูกนำมาใช้; blastoderms เหมือนเดิมที่แยกได้โดยใช้น้ำ ribonucleasefree, รวบรวมเข้าด้วยกันและสแน็ปอินแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวสำหรับการศึกษาต่อไป เพิ่มเติม 36 ไข่จากการจัดเก็บข้อมูลการรักษาแต่ละถูกบ่มเป็นเวลา 6 d ที่ 37.5 องศาเซลเซียสและ 56-57% RH สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนของการเจริญเติบโตของตัวอ่อน 6 d ของการบ่มได้รับเลือกเพราะที่จุดเวลานี้จริงทุกสัณฐานวิทยาตัวอ่อนอยู่ในปัจจุบันและ RNA ที่สกัดเป็นตัวอย่างที่เป็นตัวแทนของร่างกายตัวอ่อนทั้งหมด ตัวอ่อนเก็บเกี่ยวภายใต้เงื่อนไขที่ผ่านการฆ่าเชื้อ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการทดลองที่เกี่ยวข้องกับนก ใช้ขั้นตอนตัวอ่อนอาศัยอยู่กว่า 6 D 1 ได้รับอนุมัติจากคณะเกษตร ชีวิตสัตว์และวิทยาศาสตร์สิ่งแวดล้อมนโยบายและคณะกรรมการสวัสดิการมหาวิทยาลัยแอลเบอร์ตา ( Edmonton , Alberta , Canada ) ตามแนวทางที่ระบุไว้โดยสภาแคนาดาดูแลสัตว์
( 1993 )ทุกวัน น้ำหนักรวม 540 รอสตัวอ่อน 308 ไก่พันธุ์ไข่ฟักได้จากฝูงเก่า 33 wk ที่วางไว้บนชั้นวางและจัดเก็บ 4 และ 14 D ภายใต้แสงระหว่าง 16 และ 18 ° C และ 70 ถึง 80 เปอร์เซ็นต์ แสงในโรงเพาะฟักได้จากหลอดไฟ ซึ่งไม่ได้ส่งผลใด ๆต่อระดับความร้อนเย็น มาถึงกระเป๋าระยะเวลา 4 และ 14 วันครึ่งหนึ่งของไข่ก่อนได้และเก็บไว้เป็นเวลา 10 วัน ซึ่งหลังจากที่ไข่เก็บไว้ 4 D ที่ได้รับ ทั้งคู่แล้วเก็บไว้อีก 4 D ก่อนการบ่ม เงื่อนไขเงื่อนไขมาตรฐานของโรงเพาะฟักอนุบาล พบทั่วไปในอัลเบอร์ต้า ไข่รวบรวมและจัดเก็บการทำซ้ำเมื่อฝูงอายุถึง 37 wk . ในแต่ละคดีรวม 270 ต่อไข่ที่เก็บรักษาอุณหภูมิ 37.5 องศา C )
, 56 และ 57 เปอร์เซ็นต์ และในช่วง 3 D , ไข่ถูกลง แฮทเชอร์กับอุณหภูมิ 36.9 องศา C และ 60 เปอร์เซ็นต์ ต้นที่ 4 D และ D 1 ถึง 21 , 30 ไข่ ( 15 ฟอง / ที่เก็บรักษา ) ถูกเปิดเพื่อตรวจสอบทุกวัน ร่างกาย น้ำหนักเปียก ตัวอย่างเปียกแห้งในเตาอบ ( ส่ง 5 ชุดส่ง vrc2-26-ie , รูปแบบ , Minneapolis , MN ) 65 ° C 4 D รับ DM น้ำหนัก .
การประเมินระดับเซลล์และโมเลกุลของการตาย และการเตรียมการของบลาสโทเดิร์ม . สามกลุ่ม 120 สดวางอุดมสมบูรณ์ไข่ฟักยังได้รับจากฝูงรอส 308 ทดลองแบ่งเป็น 2 กลุ่ม และจัดเก็บ ดังกล่าวข้างต้น สำหรับแต่ละที่เก็บรักษามีพื้นที่ทั้งหมด blastoderms เหมือนเดิม pellucida และพื้นที่ opaca ได้แยกออกเป็นเซลล์แต่ละเซลล์เพื่อการวิเคราะห์การใช้โมโน ( BD facscan เบคตอน , ดิกคินสันและ บริษัท ซานโฮเซ่ แคลิฟอร์เนีย ) ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( hamidu et al . , 2010 ) แยกแต่ละบลาสโทเดิร์ม มันสูดลมหายใจเข้าสองครั้งที่ 10 และ 20 นาที 50 μ L , prewarmed ( 37 ° C ) , อาด 0.25 % ซิน : 004 % ตามลำดับ โซลูชั่น ( Invitrogen แคนาดาอิงค์ , Burlington Ontario , แคนาดา ) หลังจากบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศา รวม 40 blastoderms ถูกแยก และรวมกันต่อการเก็บรักษา และการเทศนาของ 100 μชั้นของเซลล์แขวนลอยที่มีประมาณ 50 × 105 เซลล์เปื้อนของเซลล์ v-fluorescein ไอโซไทโอไซยาเนต ( ของเซลล์ V ) และ propidium ไอโอไดด์ ( PI ) เรืองแสงสีเพื่อแยกความแตกต่างระหว่างกลุ่มที่มีอาการและประชากรเซลล์ ( โมเลกุลโพรบอิงค์ ยูจีน หรือ ) เซลล์แขวนลอยอยู่ภายใต้การวิเคราะห์การไหลของข้อมูล ( facscan ( BD ) เพื่อแยกความแตกต่างระหว่างอยู่หรือใช้เซลล์ของเซลล์ V −− / PI )เซลล์ในกลุ่มที่มีต้น ( ของเซลล์ v / PI ) ที่เซลล์ของเซลล์ V − / PI ) และกลุ่มที่มีอาการสายเซลล์ของเซลล์ V / PI ) ข้อมูลที่ได้รับการยืนยันโดยการวิเคราะห์การไหล imagestream หลายเซลล์ ( amnis Corporation , Seattle , WA ) พร้อมรูปถ่าย ภาพรวมของแต่ละเซลล์ผ่านการไหลของห้องตามที่รายงานก่อนหน้านี้ ( hamidu et al . , 2010 ) การสกัด DNA และเกลียวยีนสังเคราะห์ในลักษณะที่คล้ายกัน , ไข่ฟักที่ได้จากฝูงรอส 308 เก็บไว้ 4 และ 14 วัน ตามที่ระบุไว้ก่อนหน้านี้สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนของยีนที่พบโดยทั่วไป จำนวนไข่ต่อกระเป๋ารักษาใช้ ; เหมือนเดิม blastoderms แยกได้โดยใช้ ribonucleasefree น้ำ พูกัน และฉวยแช่แข็งในไนโตรเจนเหลว เพื่อการศึกษาต่อเพิ่มเติมจากการรักษามี 36 ไข่แต่ละที่เก็บบ่มเป็นเวลา 6 D ที่ 37.5 ° C และความชื้นสัมพัทธ์ 56 57 % สำหรับการวิเคราะห์การแสดงออกของยีนของการเจริญเติบโตระยะก่อนการฝังตัว 6 D 1 ได้รับเลือกเพราะ ณ เวลานี้จุด เกือบทั้งหมดของตัวอ่อนที่เป็นปัจจุบันและอาร์เอ็นเอที่สกัดได้ตัวอย่างที่เป็นตัวแทนของร่างกายตัวอ่อนทั้งหมด เมื่อนำเก็บภายใต้สภาพปลอดเชื้อ