2.4. Intracellular ROS evaluationTo

2.4. Intracellular ROS evaluation
To evaluate the ROS production, cells were grown in SC medium
supplemented with 0.5%, 2% and 20% glucose and were harvested
when they reached the cellular density of 0.8 O.D./ml. One O.D. of cells
was washed twice in 10 mM HEPES buffer, then resuspended in the
same buffer and incubated at 30 °C in the dark for 2 h with
dihydrorhodamine 123 (Molecular Probes) in order to highlight ROS
production on a Leica TCS SP5 confocal microscope.
2.5. Sample preparation and 2D-GE
For two-dimensional experiments, cells were harvested during the
exponential phase at a cellular density of 0.8 O.D./ml. Cells were lysed
in RIPA buffer (50 mM Tris–HCl pH 7, 1% NP-40, 150 mM NaCl, 2 mM
EGTA, 100 mM NaF) plus a cocktail of yeast protease inhibitors
(Sigma) with glass beads in a Fastprep instrument (Savant). Protein
extracts were clarified by centrifugation at 8000×g for 10 min.
Proteins were precipitated following the chloroform/methanol
protocol [30] and the pellet was resuspended in 8 M urea, 4% 3-[(3-
cholamidopropyl) dimethylammonio]-1- propanesulfonate (CHAPS)
and 20 mM dithiothreitol (DTT). For each experimental condition at
least three samples were run in order to assess biological and
analytical variation. Isoelectrofocusing (IEF) was carried out on
nonlinear wide-range immobilized pH gradients (pH 3–10; 18 cm
long IPG strips; GE Healthcare, Uppsala, Sweden) and achieved using
the EttanTM IPGphorTM system (GE Healthcare, Uppsala, Sweden).
MS-Preparative-run IPG-strips were rehydrated at 16 °C with 350 μg
of proteins in 350 μl of lysis buffer and 0.2% carrier ampholyte for 1 h
at 0 V and for 8 h at 30 V. The strips were then focused at 16 °C
according to the following electrical conditions: 200 V for 1 h, from 300 to 3500 V in 30 min, 3500 V for 3 h, from 3500 to 8000 V in
30 min, 8000 V until a total of 80,000 Vh was reached. After focusing
MS-preparative IPG strips were equilibrated for 12 min in 6 M urea,
30% glycerol, 2% sodium dodecylsulfate (SDS), 0.05 M Tris–HCl, pH
6.8, 2% DTT, and subsequently for 5 min in the same urea/SDS/Tris
buffer solution but substituting the 2% DTT with 2.5% iodoacetamide.
The second dimension was carried out on 9–16% polyacrylamide
linear gradient gels (18 cm×20 cm×1.5 mm) at 40 mA/gel constant
current and 10 °C until the dye front reached the bottom of the gel.
The MS-preparative gels were stained with colloidal Coomassie [31].

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4. intracellular ROS ประเมินการประเมินการผลิต ROS เซลล์ถูกปลูกใน SCเสริม ด้วยกลูโคส 0.5%, 2% และ 20% และได้เก็บเกี่ยวเมื่อพวกเขาถึงความหนาแน่นโทรศัพท์มือถือของ 0.8 O.D./ml O.D. หนึ่งของเซลล์ถูกล้างในบัฟเฟอร์ HEPES 10 มม.สองครั้ง แล้ว resuspended ในการเดียวกับกันชน และ incubated ที่ 30 ° C ในมืดสำหรับ h 2 กับdihydrorhodamine 123 (Probes โมเลกุล) เพื่อเน้น ROSผลิตในกล้องจุลทรรศน์ confocal ไล TCS SP52.5 การเตรียมและ 2D-GE ตัวอย่างสำหรับการทดลองสอง เซลล์เก็บเกี่ยวในช่วงระยะเนนที่มีหนาแน่น 0.8 O.D./ml. เซลล์โทรศัพท์มือถือถูก lysedในริป้าราคาบัฟเฟอร์ (pH ตรี – HCl 50 มม. 7, 1% NP-40, NaCl, 2 มม. 150 มม.EGTA, 100 มม. NaF) พร้อมค็อกเทลของยีสต์รติเอส inhibitors(ซิกมา) กับลูกปัดแก้วในเครื่องมือ Fastprep (Savant) โปรตีนสารสกัดได้ขึ้ โดย centrifugation ที่ 8000 ซื้อ g สำหรับ 10 นาทีโปรตีนตกตะกอนต่อคลอโรฟอร์ม/เมโพรโทคอล [30] และเม็ดถูก resuspended ในยูเรีย 8 เมตร 4% 3-[(3-dimethylammonio cholamidopropyl)] -1-propanesulfonate (CHAPS)และ dithiothreitol 20 มม. (DTT) สำหรับแต่ละเงื่อนไขการทดลองที่อย่างน้อยที่สุดสามถูกเรียกใช้การประเมินทางชีวภาพ และการเปลี่ยนแปลงวิเคราะห์ Isoelectrofocusing (IEF) ได้ดำเนินการในไม่เชิงเส้นหลากหลายหาไล่ระดับสีค่า pH (pH 3-10; 18 ซม.ยาว IPG แถบ ดูแลสุขภาพ GE, Uppsala สวีเดน) และได้ใช้ระบบ EttanTM IPGphorTM (GE สุขภาพ Uppsala สวีเดน)เรียก MS Preparative IPG-แถบที่ rehydrated ที่ 16 ° C กับ 350 μgของโปรตีนใน μl 350 lysis บัฟเฟอร์และ 0.2% ampholyte ผู้ขนส่งสำหรับ 1 hที่ 0 V และ h 8 ที่ 30 V ในแถบนั้นได้เน้นที่ 16 ° Cตามสภาพไฟฟ้า: 200 V สำหรับ h 1 จาก 300 ไป 3500 V ใน 30 นาที V 3500 สำหรับ 3 h จาก 3500 ไป 8000 V ใน30 นาที 8000 V จนถึงจำนวน 80000 Vh หลังจากเน้นแถบ IPG MS preparative ถูก equilibrated สำหรับ 12 นาทีในยูเรีย 6 Mกลีเซอร 30%, 2% โซเดียม dodecylsulfate (SDS), 0.05 M ตรี – HCl ค่า pH6.8, 2% DTT และในเวลาต่อมา 5 นาทีในเดียวกันกับยู เรีย/SDS/ทริ สเรทติ้งบัฟเฟอร์โซลูชันแต่แทนที่ 2% DTT กับ iodoacetamide 2.5%มิติที่สองถูกดำเนินใน polyacrylamide 9 – 16%เจเส้นไล่ระดับสี (× 18 ซม. × 20 ซม. 1.5 มม.) ที่คง 40 mA/เจลปัจจุบันและ 10 ° C จนหน้าย้อมถึงด้านล่างของเจเจ MS preparative ถูกสี ด้วย Coomassie colloidal [31]

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 ภายในเซลล์ ROS การประเมินผล
เพื่อประเมินการผลิต ROS เซลล์ที่ถูกปลูกใน SC กลาง
เสริมด้วย 0.5%, 2% และกลูโคส 20% และได้รับการเก็บเกี่ยว
เมื่อพวกเขามาถึงความหนาแน่นของเซลล์ 0.8 OD / ml หนึ่ง OD ของเซลล์ที่
ถูกล้างสองครั้งใน 10 บัฟเฟอร์มิลลิ HEPES แล้ว resuspended ใน
บัฟเฟอร์เดียวกันและบ่มที่อุณหภูมิ 30 องศาเซลเซียสในที่มืดเป็นเวลา 2 ชั่วโมงกับ
dihydrorhodamine 123 (วัดระดับโมเลกุล) เพื่อที่จะเน้น ROS
ผลิตใน SP5 confocal Leica TCS กล้องจุลทรรศน์
2.5 การเตรียมสารตัวอย่างและ 2D-GE
สำหรับการทดลองสองมิติเซลล์ได้รับการเก็บเกี่ยวในช่วง
ขั้นตอนการชี้แจงที่มีความหนาแน่นของเซลล์ 0.8 OD / ml เซลล์ที่ถูก lysed
ในบัฟเฟอร์ RIPA (50 มิลลิเมตร Tris-HCl pH 7, 1% NP-40, 150 มิลลิเมตรโซเดียมคลอไรด์, 2 มิลลิ
EGTA, 100 มิลลิเมตร NaF) บวกค๊อกเทลของสารยับยั้งยีสต์โปรติเอส
(ซิกม่า) กับลูกปัดแก้วในตราสาร Fastprep (เมธี) โปรตีน
สารสกัดที่ได้ชี้แจงโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 8000 ×กรัมเป็นเวลา 10 นาที
โปรตีนที่ตกตะกอนต่อไปนี้คลอโรฟอร์ม / เมทานอล
โพรโทคอ [30] และเม็ดถูก resuspended ใน 8 M ยูเรีย, 4% 3 - [(3
cholamidopropyl) dimethylammonio] -1 - propanesulfonate (CHAPS)
และ 20 มิลลิ dithiothreitol (DTT) สำหรับแต่ละสภาพการทดลองที่
อย่างน้อยสามตัวอย่างวิ่งเพื่อประเมินทางชีวภาพและ
การเปลี่ยนแปลงการวิเคราะห์ Isoelectrofocusing (IEF) ได้รับการดำเนินการใน
เชิงกว้างตรึงไล่ระดับพีเอช (pH 3-10; 18 ซม.
แถบ IPG ยาวจีอีเฮลธ์แคร์, สวีเดน) และประสบความสำเร็จในการใช้
ระบบ EttanTM IPGphorTM (GE Healthcare, สวีเดน)
MS-เตรียมวิ่ง IPG แถบถูก rehydrated ที่ 16 ° C 350 ไมโครกรัม
ของโปรตีนใน 350 ไมโครลิตรของ buffer สลายและ 0.2% ampholyte ให้บริการเป็นเวลา 1 ชั่วโมง
ที่ 0 V และ 8 ชั่วโมงวันที่ 30 V. แถบนั้นได้มุ่งเน้นที่ 16 ° C
เป็นไปตามเงื่อนไขดังต่อไปนี้ไฟฟ้า: 200 V เป็นเวลา 1 ชั่วโมง, 300-3500 V ใน 30 นาที, 3500 V เวลา 3 ชั่วโมง, 3500-8000 V ใน
30 นาที, 8000 V จนถึงรวม 80,000 Vh ก็มาถึง . หลังจากที่มุ่งเน้น
แถบ IPG MS-เตรียมถูก equilibrated เวลา 12 นาทีใน 6 M ยูเรีย
30% กลีเซอรอล, 2% โซเดียม dodecylsulfate (SDS), 0.05 M Tris-HCl, pH
6.8, 2% DTT และต่อมาเป็นเวลา 5 นาทีในที่เดียวกัน ยูเรีย / SDS / TRIS
สารละลายบัฟเฟอร์ แต่แทน 2% DTT กับ 2.5% iodoacetamide
มิติที่สองได้รับการดำเนินการใน 9-16% polyacrylamide
เจลลาดเชิงเส้น (18 เซนติเมตร× 20 ซม× 1.5 มม) ที่ 40 mA / เจลอย่างต่อเนื่อง
ในปัจจุบัน และ 10 ° C จนด้านหน้าสีย้อมมาถึงด้านล่างของเจล
เจล MS-เตรียมถูกย้อมด้วยสีคอลลอยด์ Coomassie [31]

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.4 . การประเมินผลการรอส
ประเมินผลตอบแทนการผลิตเซลล์เติบโตใน SC ขนาดกลาง
เสริมด้วย 0.5% , 2% และกลูโคสร้อยละ 20 และเก็บเกี่ยว
เมื่อพวกเขามาถึงเซลล์ / มิลลิลิตรความหนาแน่น 0.8 OD OD ของหนึ่งเซลล์
ซักสองครั้งใน 10 มิลฮีเปส บัฟเฟอร์ แล้ว resuspended ใน
บัฟเฟอร์เดียวกัน บ่มที่ 30 °องศาเซลเซียสในที่มืดเป็นเวลา 2 ชั่วโมงกับ
dihydrorhodamine 123 ( โมเลกุลโพรบ ) เพื่อเน้นผลตอบแทน
การผลิตในงาน sp5 กล้องจุลทรรศน์ Leica ด้วย .
2.5 ตัวอย่างการเตรียม และ 2d-ge
2 มิติเซลล์เก็บในระหว่าง
ระยะ exponential ที่ความหนาแน่นเซลล์ / มิลลิลิตร ) 0.8 OD เซลล์ lysed
ใน RIPA บัฟเฟอร์ ( 50 มม. โดย–กรดไฮโดรคลอริก pH 7 , 1% np-40 150 mM NaCl หน่วย 2 mm
, ,100 มิลลิเมตร นาฟ ) บวกค็อกเทลของตัวยับยั้งโปรตีเอสยีสต์
( Sigma ) กับลูกปัดแก้วใน fastprep เครื่องดนตรี ( เมธี ) สารสกัดโปรตีน
มีการชี้แจงโดยปั่นที่ 8000 ×กรัมโปรตีนตกตะกอน ต่อไปนี้เป็น 10 นาที

/ เมทานอลคลอโรฟอร์มโปรโตคอล [ 30 ] และเม็ดเป็น resuspended 8 M ยูเรีย , 4 % [ 3 - ( 3 -
cholamidopropyl ) dimethylammonio ] - 1 - propanesulfonate ( Chaps )
และ 20 มม. บัตรแข็ง ( DTT ) สำหรับทดลองแต่ละเงื่อนไขที่
อย่างน้อยสามตัวอย่างที่เรียกใช้เพื่อประเมินและวิเคราะห์การเปลี่ยนแปลงทางชีวภาพ
. isoelectrofocusing ( IEF ) ถูกหามออก
ไม่เชิงเส้นตรึง pH ( pH หลากหลายไล่ 3 – 10 ; 18 ซม.
ยาว IPG แถบ ; GE Healthcare อุปซอลา , สวีเดน ) และได้ใช้ระบบ ipgphortm
ettantm ( GE Healthcare อุปซอลา , สวีเดน ) .
นางสาวเตรียมวิ่ง IPG แถบคือได้ทำการ รีไฮเดรทมที่ 16 ° C 350 μ g
ของโปรตีนในμ 350 ลิตร กันชน เสื่อมและ 0.2% ผู้ให้บริการ ampholyte 1 H
0 V และ 8 H ที่ 30 โวลต์แถบ จึงเน้นที่ 16 ° C
ตามสภาพ 200 V สำหรับไฟฟ้า 1 H จาก 300 , 500 V ใน 30 นาที 3 V 3 H จาก 3 000 5 000 V
30 นาทีจนกว่าทั้งหมดของ 80 , 000 แต่ครบหลังจากเน้น
MS = IPG แถบเป็น equilibrated 12 นาที 6 M ยูเรีย
30 % กลีเซอรอล 2% โซเดียม dodecylsulfate ( SDS ) 0.05 M ทริส– HCl , pH 6.8 %
2 ส่วนและต่อมาเป็นเวลา 5 นาทีในสารละลายบัฟเฟอร์ซียูเรียเดียวกัน / /
แต่ทริสแทน 2 % ส่วน 2.5 % iodoacetamide .
มิติที่สองดำเนินการในวันที่ 9 – 16 % สาร
เส้นลาดเจล ( 18 cm × 20 cm × 15 มม. ) ที่ 40 MA / เจลคงที่ในปัจจุบันและ 10 ° C
จนย้อมหน้าถึงด้านล่างของเจล
MS เตรียมเจลถูกย้อมด้วยสีเหล่านี้น่าจะเป็นคอลลอยด์ [ 31 ]