2.4. Real-time RT-PCR analysiscDNA

2.4. Real-time RT-PCR analysis
cDNA was synthesized from total RNA using a PrimeScript RT
Reagent Kit with gDNA Eraser (Takara), and then real-time RT-PCR
was performed using an SYBR Premix Ex Taq II (Takara). The con-
ditions for real-time RT-PCR were as follows: 37
? C for 15 min and
85
? C for 5 s for cDNA synthesis, and then 40 cycles at 95 ? C for 5 s
and at 60
? C for 30 s for PCR amplification. Nucleotide sequences of
the primers used in this study were as follows: AtPR1 primers (5 0 -
CCTGGGGTAGCGGTGACTT-3 0 and 5 0 -CGTGTTCGCAGCGTAGTTGT-3 0 ,
A. thaliana pathogenesis-related protein 1 mRNA, GenBank acces-
sion no. NM_127025), AtPDF1.2 primers (5 0 -TCACCCT-
TATCTTCGCTGCTC-3 0 and 5 0 -ACCATGTCCCACTTGGCTTC-3 0 ,
A. thaliana putative antifungal protein PDF1.2 mRNA, GenBank
accession no. AY063779), and AtACT primers (5 0 -GCCGACA-
GAATGAGCAAAGAG-3 0 and 5 0 -AGGTACTGAGGGAGGCCAAGA-3 0 ,
A. thaliana actin 1 mRNA, GenBank accession no. NM_179953).
Actin was used for normalization. Dissociation curves were
analyzed to verify the specificity of the amplification reaction using
the Thermal Cycler Dice Real Time System Single Software ver. 3.00
(Takara). The expression level of each gene was determined as the
number of amplification cycles needed to reach a fixed threshold
using the standard curve method, and then expressed as a relative
value.
2.5. Antagonistic activity of iturin A derivative peptides
Mycelial discs of Colletotrichum gloeosporioides, which causes
strawberry anthracnose and grape ripe rot diseases, were placed
on potato dextrose agar plates. At the same time, sterilized paper
discs were placed on the plates and then inoculated with 50 m L of
0.1 mg/ml iturin A or iturin A derivative peptides. The plates were
incubated at 25
? C for 5 days. The antagonistic effects of the de-
rivative peptides toward C. gloeosporioides mycelial growth were
evaluated by measuring the growth inhibition zones formed on the
plates.
2.6. Statistics
Data are presented as means ± standard deviations. Statistical
analysis was performed by Tukey's test using Excel statistics soft-
ware 2012 (Social Survey Research Information, Tokyo, Japan).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.4 วิเคราะห์ RT-PCR แบบเรียลไทม์มีสังเคราะห์ cDNA จากอาร์เอ็นเอทั้งหมดที่ใช้ PrimeScript RTรีเอเจนต์ Kit กับ gDNA ยางลบ (Takara), และแบบเรียลไทม์แล้ว RT-PCRที่ดำเนินการโดยใช้การ SYBR Premix Ex Taq II (Takara) คอน-ditions สำหรับ RT-PCR แบบเรียลไทม์มีดังนี้: 37? C สำหรับ 15 นาที และ85? C สำหรับ 5 s การสังเคราะห์ cDNA แล้ว 40 รอบที่ 95 หรือไม่ C สำหรับ 5 sและ ที่ 60? C สำหรับ 30 s สำหรับขยาย PCR ลำดับของนิวคลีโอไทด์ของไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษานี้มีดังนี้: ไพรเมอร์ AtPR1 (5 0 -CCTGGGGTAGCGGTGACTT-5 และ 0 0 - CGTGTTCGCAGCGTAGTTGT-3 0, 3A. thaliana ที่เกี่ยวข้องกับพยาธิกำเนิดโปรตีน 1 mRNA, GenBank เดิน -นไม่ NM_127025), AtPDF1.2 ไพรเมอร์ (5 0 - TCACCCT-TATCTTCGCTGCTC-5 และ 0 0 - ACCATGTCCCACTTGGCTTC-3 0, 3โปรตีนต้านเชื้อรา A. thaliana putative PDF1.2 mRNA, GenBankทะเบียนไม่มี AY063779), และ AtACT ไพรเมอร์ (5 0 - GCCGACA-GAATGAGCAAAGAG-5 และ 0 0 - AGGTACTGAGGGAGGCCAAGA-3 0, 3A. thaliana แอกติน 1 mRNA, GenBank ทะเบียนไม่ NM_179953)แอกตินถูกใช้สำหรับการฟื้นฟู Dissociation โค้งได้วิเคราะห์ตรวจสอบ specificity ใช้ปฏิกิริยาขยายระบบเวลาจริงลูกเต๋า Cycler ร้อนเดี่ยวไม่ซอฟต์แวร์ 3.00(Takara) กำหนดเป็นระดับนิพจน์ของยีนแต่ละตัวจำนวนของวงจรขยายที่จำเป็นถึงขีดจำกัดที่ถาวรใช้มาตรฐานเส้นโค้งวิธี และจากนั้น แสดงเป็นญาติค่า2.5 การกิจกรรมต่อต้านของเปปไทด์แบบ iturin Aดิสก์ mycelial Colletotrichum gloeosporioides ซึ่งทำให้วาง anthracnose สตรอเบอรี่และองุ่นสุก rot โรคในแผ่นมันฝรั่งขึ้น agar ในเวลาเดียวกัน sterilized กระดาษวางบนแผ่นดิสก์แล้ว inoculated กับ m 50 L ของ0.1 mg/ml iturin A หรือเปปไทด์แบบ iturin A แผ่นได้incubated ที่ 25? ซี 5 วัน ผลกระทบต่อต้านเดอ-เปปไทด์ rivative ไปทาง C. gloeosporioides mycelial เจริญเติบโตได้ประเมิน โดยการวัดการยับยั้งการเจริญเติบโตที่โซนเกิดขึ้นแผ่น2.6. สถิติข้อมูลจะแสดงเป็นหมายถึง ±ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ทางสถิติทำการวิเคราะห์ โดยใช้สถิติ Excel อ่อน - การทดสอบของ Tukeyเครื่อง 2012 (สังคมสำรวจวิจัยข้อมูล โตเกียว ญี่ปุ่น)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.4 Real-time วิเคราะห์ RT-PCR
ยีนสังเคราะห์จาก RNA รวมใช้ PrimeScript RT
รีเอเจนชุดกับ gDNA ยางลบ (Takara) แล้วแบบ real-time RT-PCR
ได้ดำเนินการใช้พรีมิกซ์ SYBR Ex Taq ii (Takara) อย่างต่อสภาวะแวดล้อมสำหรับแบบ real-time RT-PCR มีดังนี้ 37? C เป็นเวลา 15 นาทีและ85? C เป็นเวลา 5 วินาทีสำหรับการสังเคราะห์ยีนแล้ว 40 รอบที่ 95? C เป็นเวลา 5 วินาทีและ60? C เป็นเวลา 30 วินาทีสำหรับขยาย PCR ลำดับเบสของไพรเมอร์ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีดังนี้ AtPR1 ไพรเมอร์ (5 0 - CCTGGGGTAGCGGTGACTT-3 0 5 0 -CGTGTTCGCAGCGTAGTTGT-3 0, เอ thaliana โปรตีนทำให้เกิดโรคที่เกี่ยวข้อง 1 mRNA, GenBank acces-. ไซออนไม่มี NM_127025) ไพรเมอร์ AtPDF1.2 (5 0 -TCACCCT- TATCTTCGCTGCTC-3 0 5 0 -ACCATGTCCCACTTGGCTTC-3 0, เอ thaliana โปรตีนต้านเชื้อราสมมุติ PDF1.2 mRNA, GenBank เข้า no. AY063779) และไพรเมอร์ AtACT (5 0 -GCCGACA - GAATGAGCAAAGAG-3 0 5 0 -AGGTACTGAGGGAGGCCAAGA-3 0,. ก. thaliana โปรตีน 1 mRNA ภาคยานุวัติ GenBank ไม่มี NM_179953) โปรตีนถูกนำมาใช้สำหรับการฟื้นฟู เส้นโค้งที่แยกออกจากกันได้รับการวิเคราะห์เพื่อตรวจสอบความจำเพาะของการเกิดปฏิกิริยาการขยายโดยใช้ระบายความร้อนCycler ลูกเต๋าระบบแบบ Real Time เดี่ยวซอฟแวร์เวอร์ชั่น 3.00 (Takara) ระดับการแสดงออกของยีนแต่ละคนถูกกำหนดเป็นจำนวนรอบของการขยายความจำเป็นที่จะไปถึงเกณฑ์คงใช้วิธีโค้งมาตรฐานและการแสดงแล้วเป็นญาติค่า. 2.5 กิจกรรมปฏิปักษ์ของเปปไทด์ iturin อนุพันธ์แผ่นเส้นใยของเชื้อราColletotrichum gloeosporioides ซึ่งเป็นสาเหตุของโรคแอนสตรอเบอร์รี่และองุ่นโรคเน่าสุกถูกวางไว้บนจานอาหารเลี้ยงเชื้อเดกซ์โทรสมันฝรั่ง ในขณะเดียวกันกระดาษฆ่าเชื้อแผ่นถูกวางไว้บนจานและเชื้อแล้วกับ 50 เมตรลิตร 0.1 mg / ml iturin หรือเปปไทด์ iturin อนุพันธ์ แผ่นถูกบ่มที่25? C เป็นเวลา 5 วัน ผลกระทบที่เป็นศัตรูของ de- เปปไทด์ที่มีต่อ rivative C. gloeosporioides เจริญของเส้นใยที่ได้รับการประเมินโดยการวัดโซนยับยั้งการเจริญที่เกิดขึ้นบนแผ่น. 2.6 สถิติข้อมูลจะถูกนำเสนอเป็นหมายถึง±ค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน สถิติการวิเคราะห์ได้ดำเนินการโดยการทดสอบของ Tukey โดยใช้สถิติ Excel นุ่มเครื่อง2012 (การสำรวจข้อมูลการวิจัยสังคม, กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น)