3. Results and discussionA simple,

3. Results and discussion
A simple, fast and reliable protocol for extraction of genomic DNA
from dry leaves of A. occidentale was established in this study. Other
available DNA extraction protocols were either very lengthy, very
expensive or not suitable for extracting DNA from dry leaves of
A. occidentale (Doyle and Doyle, 1987; Edwards et al., 1991; Kotchoni
and Gachomo, 2009; Margam et al., 2010). For example, the use of
other rapid DNA extraction protocols such as those described by
Wang et al. (2011); Kotchoni and Gachomo (2009); and Azmat et al.
(2012) did not give DNA of good quality from dried leaves of
A. occidentale probably due to the presence of secondary metabolites.
Although the CTAB method and commercially available kits gave high
quality DNA they were either very lengthy or expensive respectively
and therefore not suited to our study.
In the method described here the plant cell wall was broken using
mechanical force in the presence of the extraction buffer. SDS in
the buffer liberated DNA by lysing cell and nuclei (Manak, 1993).
Subsequent centrifugation co-precipitated cell debris with polysaccharides
and protein complexes that interfere with the quality of the
DNA.
Our study required extraction of DNA from many samples and the
DNA quality had to be high enough to allow for PCR-based analysis
such as SSR marker based genetic characterization (Table 3). We
established a method that is simple, safe and fast compared to the
CTAB method which uses hazardous chemicals, is more time consuming
and significantly expensive (Doyle and Doyle, 1987). When using the
CTAB method it takes at least 6 h to complete a DNA extraction but
our method takes 10 min. In comparison to the CTAB method, our
protocol is safe enough to be performed on the lab bench in any laboratory
without requiring the use of a chemical hood. Commercially available
kits are expensive and therefore not an alternative for laboratories
with limited resources.
To check the quality of the genomic DNA extracted from dry leaves
of different cultivars of A. occidentale using this method, PCR amplifications
of SSR markers were done. DNA fragments were clearly obtained
from PCR following agarose gel electrophoresis from fresh leaves of
different maize varieties (Fig. 2). This was an indication that the DNA
extracted using this method was free from plant secondary metabolites
e.g. flavonoids, terpenes, and phenolic compounds, which interfere with
the yield and quality of the DNA (Porebski et al., 1997). These secondary
metabolites were successfully removed during the extraction process.
In addition, we successfully obtained a nice cartography of selected
Table 1
List of accessions numbers of Anacardium occidentale (cashew) trees from different
geographical locations of Benin, Africa tested in this study.
No ID Site of collection Age of plant (years)
1 O32 Bassila 12
2 O27 Bassila 15
3 O11 Founga 15
4 E35 Serekali 15
5 E26 Serekali 12
6 E5 Konmi 15
7 E25 Serekali 12
8 E11 Bembèrèkè 12
9 E4 Konmi 15
10 O24 Founga 12
11 E13 Bembèrèkè 12
Fig. 1. Air-dried leaf of Anacardium occidentale L. for long term storage in absence of liquid
nitrogen and −80 °C freezer for storage of fresh materials. The overall dried leaf is
depicted (A), and the preferable upper half part of the leaf used in the DNA extraction
protocol is depicted here (B).
Table 2
Microsatellites markers of Anacardium occidentale L. used for PCR-based amplification in
this study

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

3. ผลลัพธ์ และสนทนาโพรโทคอง่าย รวดเร็ว และเชื่อถือได้สำหรับการสกัดของ genomic DNAจากใบแห้งของ occidentale ได้ก่อตั้งขึ้นในการศึกษานี้ อื่น ๆมีดีเอ็นเอแยกโพรโทคอได้ยาวมาก มากแพง หรือไม่เหมาะสำหรับการแยก DNA จากใบไม้แห้งอ. occidentale (ดอยล์และดอยล์ 1987 เอ็ดเวิร์ดเอส al., 1991 Kotchoniและ Gachomo, 2009 Margam et al., 2010) ตัวอย่าง การใช้รวดเร็วดีเอ็นเอแยกโพรโทคอลอื่น ๆ เช่นโดยวัง et al. (2011); Kotchoni และ Gachomo (2009); และ Azmat et al(2012) ไม่ให้ดีเอ็นเอของดีจากใบไม้แห้งOccidentale อ.คงเนื่องจากสถานะของ metabolites รองแม้ว่าวิธี CTAB และชุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ให้สูงดีเอ็นเอคุณภาพพวกมากยาวมาก หรือมีราคาแพงตามลำดับและดังนั้นจึงไม่เหมาะกับเราในวิธีต่อ ผนังเซลล์พืชที่เสียโดยใช้กองเครื่องจักรกลในต่อหน้าของบัฟเฟอร์สกัด องค์กรในบัฟเฟอร์ liberated ดีเอ็นเอ โดย lysing เซลล์และแอลฟา (Manak, 1993)ต่อมา centrifugation เศษเซลล์ที่ตกตะกอนร่วมกับ polysaccharidesและโปรตีนคอมเพล็กซ์ที่รบกวนคุณภาพของการดีเอ็นเอเราต้องการสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างมากและคุณภาพดีเอ็นเอก็จะสูงพอที่จะอนุญาตให้สำหรับการวิเคราะห์ผลเช่นเครื่องหมาย SSR ใช้จำแนกพันธุกรรม (ตาราง 3) เราสร้างวิธีการที่ง่าย ปลอดภัย และรวดเร็วเมื่อเทียบกับการวิธี CTAB ซึ่งใช้สารเคมีอันตราย มากขึ้นใช้เวลานานและมีราคาแพงมาก (ดอยล์และดอยล์ 1987) เมื่อใช้การวิธี CTAB ใช้น้อย 6 h การสกัดดีเอ็นเอ แต่วิธีของเราใช้เวลา 10 นาที โดยวิธี CTAB ของเราโพรโทคอลจะปลอดภัยเพียงพอที่จะดำเนินการบนม้านั่งปฏิบัติในห้องปฏิบัติการใด ๆโดยไม่ต้องใช้เครื่องดูดควันสารเคมี ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ชุดมีราคาแพง และไม่มีทางเลือกสำหรับห้องปฏิบัติการมีทรัพยากรจำกัดการตรวจสอบคุณภาพของดีเอ็นเอ genomic ที่สกัดจากใบแห้งของพันธุ์ต่าง ๆ ของ A. occidentale ใช้วิธีนี้ PCR amplificationsมีทำเครื่องหมายของ SSR ชิ้นส่วนดีเอ็นเอได้รับอย่างชัดเจนจาก PCR electrophoresis เจ agarose ต่อจากสดใบของต่าง ๆ ข้าวโพดพันธุ์ (Fig. 2) นี้เป็นตัวบ่งชี้ที่ดีเอ็นเอแยกโดยใช้วิธีการนี้ได้ฟรีจากพืชรอง metabolitesเช่น flavonoids, terpenes และสิ่งทอ ม่อฮ่อม ซึ่งรบกวนผลผลิตและคุณภาพของดีเอ็นเอ (Porebski และ al., 1997) รองเหล่านี้metabolites สำเร็จได้ถูกเอาออกในระหว่างกระบวนการแยกนอกจากนี้ เราสำเร็จรับบุคคลากรที่ดีของเลือกตารางที่ 1รายการของหมายเลข accessions Anacardium occidentale (มะม่วงหิมพานต์) ต้นไม้จากแตกต่างกันเบนิน ทวีปแอฟริกาสถานที่ทดสอบในการศึกษานี้ไม่มีรหัสไซต์ของคอลเลกชันอายุของพืช (ปี)1 O32 Bassila 122 O27 Bassila 153 O11 Founga 15Serekali 4 E35 155 E26 Serekali 12Konmi 6 E5 157 E25 Serekali 128 E11 Bembèrèkè 12Konmi 9 E4 15Founga 10 O24 12Bembèrèkè 11 E13 12Fig. 1 Air-dried ลาน Anacardium occidentale L. สำหรับเก็บรักษาระยะยาวในการขาดงานของของเหลวไนโตรเจนและ −80 ° C ตู้แช่แข็งสำหรับเก็บวัสดุและสด ใบไม้แห้งโดยรวมคือแสดง (A), และกว่าส่วนครึ่งบนของใบไม้ที่ใช้ในการสกัดดีเอ็นเอโพรโทคอลเป็นภาพนี้ (B)ตารางที่ 2ตัวแสดง Microsatellites Anacardium occidentale L. ที่ใช้สำหรับการขยายผลในการศึกษานี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

3. ผลการอภิปรายและ
ง่ายโปรโตคอลรวดเร็วและเชื่อถือได้สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ
จากใบแห้งของ Occidentale เอก่อตั้งขึ้นในการศึกษาครั้งนี้ อื่น ๆ
โปรโตคอลการสกัดดีเอ็นเอสามารถใช้ได้ทั้งที่มีความยาวมาก
มีราคาแพงหรือไม่เหมาะสำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากใบแห้งของ
เอ Occidentale (ดอยล์และดอยล์ 1987; เอ็ดเวิร์ด et al, 1991;. Kotchoni
และ Gachomo 2009;. Margam et al, 2010) ยกตัวอย่างเช่นการใช้
โปรโตคอลการสกัดดีเอ็นเออย่างรวดเร็วอื่น ๆ เช่นที่อธิบายไว้โดย
วัง et al, (2011); Kotchoni และ Gachomo (2009); และ Azmat et al.
(2012) ไม่ได้ให้ดีเอ็นเอที่มีคุณภาพดีจากใบแห้ง
ก Occidentale อาจเป็นเพราะการปรากฏตัวของสารทุติยภูมิ.
แม้ว่าวิธี CTAB และชุดใช้ได้ในเชิงพาณิชย์ให้สูง
ดีเอ็นเอที่มีคุณภาพที่พวกเขามีทั้งที่มีความยาวมากหรือมีราคาแพงตามลำดับ
และดังนั้นจึงไม่เหมาะกับการศึกษาของเรา.
ในวิธีการที่อธิบายที่นี่ผนังเซลล์ของพืชที่ถูกทำลายโดยใช้
แรงกลในการปรากฏตัวของบัฟเฟอร์สกัด SDS ใน
บัฟเฟอร์ไทดีเอ็นเอโดย lysing ของเซลล์และนิวเคลียส (Manak, 1993).
การหมุนเหวี่ยงภายหลังเศษเซลล์ร่วมกับการตกตะกอน polysaccharides
และโปรตีนคอมเพล็กซ์ที่ยุ่งเกี่ยวกับคุณภาพของ
ดีเอ็นเอ.
การศึกษาของเราต้องการการสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างจำนวนมากและ
ดีเอ็นเอ ที่มีคุณภาพจะต้องสูงพอที่จะช่วยให้การวิเคราะห์ PCR-based
เช่นเครื่องหมาย SSR ลักษณะทางพันธุกรรมตาม (ตารางที่ 3) เรา
จัดตั้งขึ้นวิธีที่ง่ายปลอดภัยและรวดเร็วเมื่อเทียบกับ
วิธี CTAB ซึ่งใช้สารเคมีที่เป็นอันตรายจะเสียเวลามากขึ้น
และมีราคาแพงอย่างมีนัยสำคัญ (ดอยล์และดอยล์, 1987) เมื่อใช้
วิธี CTAB จะใช้เวลาอย่างน้อย 6 ชั่วโมงจะเสร็จสมบูรณ์ในการสกัดดีเอ็นเอ แต่
วิธีการของเราใช้เวลา 10 นาที เมื่อเปรียบเทียบกับวิธี CTAB เรา
โปรโตคอลที่มีความปลอดภัยเพียงพอที่จะดำเนินการอยู่บนม้านั่งในห้องปฏิบัติการในห้องปฏิบัติการใด ๆ
โดยไม่ต้องใช้เครื่องดูดควันสารเคมี เชิงพาณิชย์ที่มี
ชุดที่มีราคาแพงและดังนั้นจึงไม่เป็นทางเลือกสำหรับห้องปฏิบัติการ
ที่มีทรัพยากร จำกัด .
ในการตรวจสอบคุณภาพของดีเอ็นเอที่สกัดจากใบแห้ง
ของสายพันธุ์ที่แตกต่างกันของเอ Occidentale ใช้วิธีนี้ amplifications PCR
ของเครื่องหมาย SSR ได้ทำ ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ได้รับอย่างชัดเจน
จาก PCR ต่อไปนี้ข่าวคราว agarose จากใบสดของ
ข้าวโพดพันธุ์ที่แตกต่างกัน (รูปที่. 2) นี่เป็นข้อบ่งชี้ว่าดีเอ็นเอ
ที่สกัดโดยใช้วิธีการนี้เป็นอิสระจากพืชสารทุติยภูมิ
เช่น flavonoids, terpenes และสารประกอบฟีนอลซึ่งยุ่งเกี่ยวกับ
ผลผลิตและคุณภาพของดีเอ็นเอ (Porebski et al., 1997) เหล่านี้รอง
สารถูกถอดออกมาประสบความสำเร็จในระหว่างขั้นตอนการสกัด.
นอกจากนี้เราได้ประสบความสำเร็จในการทำแผนที่ที่ดีของการเลือก
ตารางที่ 1
แสดงหมายเลขสายของ Anacardium Occidentale (มะม่วงหิมพานต์) ต้นไม้ที่แตกต่างกันจาก
สถานที่ทางภูมิศาสตร์ของประเทศเบนิน, แอฟริกาทดสอบในการศึกษาครั้งนี้.
ID ไม่มี เว็บไซต์ของอายุการเก็บของพืช (ปี)
1 O32 Bassila 12
2 O27 Bassila 15
3 O11 Founga 15
4 E35 Serekali 15
5 E26 Serekali 12
6 E5 Konmi 15
7 E25 Serekali 12
8 E11 Bembèrèkè 12
E4 Konmi 9 15
10 12 O24 Founga
11 E13 Bembèrèkè 12
รูป 1. ใบอากาศแห้งของ Anacardium Occidentale ลิตรสำหรับการจัดเก็บระยะยาวในกรณีที่ไม่มีของของเหลว
ไนโตรเจนและ -80 ° C ช่องแช่แข็งสำหรับการจัดเก็บวัสดุสด ใบแห้งโดยรวม
ภาพ (A) และส่วนครึ่งบนของใบที่นิยมใช้ในการสกัดดีเอ็นเอ
โปรโตคอลเป็นภาพที่นี่ (B).
ตารางที่ 2
ไมโครเครื่องหมายของ Anacardium Occidentale ลิตรใช้สำหรับการขยาย PCR ที่ใช้ใน
การศึกษาครั้งนี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

3 . ผลและการอภิปราย : ง่าย , รวดเร็วและเชื่อถือได้สำหรับขั้นตอนการสกัด
ดีเอ็นเอจากใบไม้แห้งของ มะม่วงหิมพานต์ ก่อตั้งขึ้นในปีการศึกษานี้ อื่น ๆของการสกัดดีเอ็นเอโปรโตคอลเหมือนกัน

ยาวมากหรือแพงไม่เหมาะสำหรับการสกัดดีเอ็นเอจากใบแห้งของ
A และมะม่วงหิมพานต์ ( ดอยล์ดอยล์ , 1987 ; เอ็ดเวิร์ด et al . , 1991 ; และ kotchoni
gachomo , 2009 ; margam et al . ,2010 ) ตัวอย่างเช่นการใช้
โปรโตคอลการสกัดอย่างรวดเร็วดีเอ็นเออื่น ๆเช่นที่อธิบายไว้โดย
Wang et al . ( 2011 ) kotchoni และ gachomo ( 2009 ) ; และ azmat et al .
( 2012 ) ไม่ได้ให้ดีเอ็นเอที่มีคุณภาพดีจากใบแห้งของ
. มะม่วงหิมพานต์อาจเนื่องจากการปรากฏตัวของสารทุติยภูมิ .
ถึงแม้ว่า ctab วิธีและใช้ในเชิงพาณิชย์สูง
ชุดให้ดีเอ็นเอที่มีคุณภาพพวกเขาให้ยาวมาก หรือแพงตามลำดับ
และดังนั้นจึงไม่เหมาะกับการศึกษาของเรา ในวิธีการที่อธิบายที่นี่

เซลล์พืชผนังเสียใช้แรงกลในการปรากฏตัวของบัฟเฟอร์ในการสกัด SDS ในบัฟเฟอร์โดยอิสระ
ดีเอ็นเอต่อเซลล์และนิวเคลียส ( แมนแนค , 1993 ) .
ตามมาปั่น Co ตกตะกอนเศษเซลล์กับพอลิแซ็กคาไรด์
และโปรตีนเชิงซ้อนที่ยุ่งเกี่ยวกับคุณภาพของ

ศึกษาดีเอ็นเอ ของเราต้องการสกัดดีเอ็นเอจากตัวอย่างมากมายและ
คุณภาพดีเอ็นเอต้องสูงเพียงพอที่จะอนุญาตให้มีการวิเคราะห์ดีเอ็นเอเครื่องหมายพันธุกรรม
เช่น SSR ตามลักษณะตาม ( ตารางที่ 3 ) เรา
ตั้งขึ้นวิธีการที่ง่าย , ปลอดภัยและรวดเร็วเมื่อเทียบกับ
ctab วิธีที่ใช้สารเคมีอันตราย เป็นเวลานาน
มีราคาแพง ( ดอยล์และดอยล์ , 1987 ) เมื่อใช้
ctab วิธีการจะใช้เวลาอย่างน้อย 6 ชั่วโมงเพื่อให้สกัดดีเอ็นเอแต่
วิธีของเราใช้เวลา 10 นาทีในการเปรียบเทียบกับวิธีการ ctab , โปรโตคอลของเรา
ปลอดภัยพอที่จะใช้ห้องปฏิบัติการม้านั่งในห้องปฏิบัติการ
โดยไม่ต้องใช้สารเคมี เครื่องดูดควัน
พร้อมใช้งานในเชิงพาณิชย์ชุดก็แพง จึงไม่ใช่ทางเลือกสำหรับห้องปฏิบัติการ

มีทรัพยากรที่ จำกัด การตรวจสอบคุณภาพของดีเอ็นเอที่สกัดจากใบแห้งของพันธุ์ที่แตกต่างกันของ A .
มะม่วงหิมพานต์โดยใช้วิธีนี้ ซึ่ง amplifications
ของ SSR markers เสร็จแล้ว ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ได้จาก PCR มีความชัดเจนดังต่อไปนี้ electrophoresis ,
เจลจากใบสดของสายพันธุ์ข้าวโพด
( รูปต่าง ๆ2 ) นี้เป็นข้อบ่งชี้ว่า ดีเอ็นเอที่สกัดด้วยวิธีนี้ฟรี

รองจากพืช เช่น สารฟลาโวนอยด์ , เทอร์ปีนและสารประกอบฟีนอล ซึ่งรบกวน
ต่อคุณภาพและผลผลิตของดีเอ็นเอ ( porebski et al . , 1997 ) สารประกอบทุติยภูมิ
เหล่านี้ออกเรียบร้อยแล้วในระหว่างกระบวนการสกัด
นอกจากนี้เราเรียบร้อยแล้วได้ทำแผนที่ของเลือกดี
ตารางที่ 1
รายชื่อสายพันธุ์จำนวน anacardium มะม่วงหิมพานต์ ( มะม่วงหิมพานต์ ) ต้นไม้ จากที่ตั้งทางภูมิศาสตร์แตกต่างกัน
เบนิน , แอฟริกาทดสอบในการศึกษา .
ID ไม่มีเว็บไซต์ของคอลเลกชันของพืชอายุ ( ปี )
1 o32 bassila 12
2 o27 15 bassila
3 o11 15 founga
4
5 e35 15 serekali E26 serekali 12
6 E5 15 konmi
7 e25 serekali 12
8 e11 bemb . R . K .
9 e4 12 15 konmi
10 o24 founga 12
11 e13 bemb . R . K . 12
รูปที่ 1อากาศใบมะม่วงหิมพานต์ anacardium ลิตรสำหรับการจัดเก็บในระยะยาวในการขาดไนโตรเจนเหลว และ− 80 ° C
ตู้แช่สำหรับการจัดเก็บวัตถุดิบสดแห้ง โดยใบแห้งเป็น
ภาพ ( ) และครึ่งบนดีกว่า ส่วนของใบที่ใช้ในการสกัดดีเอ็นเอ
( ที่วาดไว้ ( B )
2
เครื่องหมายไมโครแซเทลไลต์ตารางของ anacardium มะม่วงหิมพานต์ลิตรใช้ PCR ตามแบบใน
การศึกษานี้