in truncated CRD3 Al-module (accord

in truncated CRD3 Al-module (according to definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) with amino acid sequence 108-126 (i.e., 19-meric peptide RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; see SEQ ID NO: 34) on ภายนอกเซลล์ ฮิวเมน CD134, หรือ amino acid sequence 108-126 (i.e., 19-25 meric peptide RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; see SEQ ID NO: 34) formed a part for binding to a non-linear/conformational เอพิโทป in truncated CRD3 Al- module/CRD4 Al-Bl-module (according to definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683), and possibly in the hinge-like structure, with amino acid
sequence 108-214 (see SEQ ID NO: 35) on ภายนอกเซลล์ ฮิวเมน CD134.
These
30 results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 seemed
to recognize a linear หรือ non-linear/conformational เอพิโทป in truncated CRD4 Al-
module (according to definition of Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-1330),
and possibly in the hinge-like structure, with amino acid sequence 147-214 (SEQ ID NO:36) on ภายนอกเซลล์ ฮิวเมน CD134.
Using a crystallography, Compaan et al. (Structure 2006; 14: 1321-1330)
recently discovered critical involvement of CRD1, CRD2 (especially Al loop and
5 immediately following residues), and CRD3 (primarily Al loop) on ฮิวเมน CD134
during OX40ลิแกนด์ (CD252)/CD134 (=OX40) interaction. This discovery คือ in good
agreement with our findings that (1, see above) mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 20E5 did not seem to recognize a ฮิวเมน CD134 เอพิโทป in CRD1, CRD2, and
truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain Al module (according to definition of 10 Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) หรือ alternatively CRD1-CRD2-CRD3
A1-B1-module (according to definition of Compaan et al. Structure 2006; 14: 1321-
1330) on ภายนอกเซลล์ ฮิวเมน CD134, and (2, see above) mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 20E5 bound simultaneously with ฮิวเมน OX4OL on PHA stimulated
T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 . This suggested that mouse anti ฮิวเมน 15 CD134 antibody clone 20E5 recognized an เอพิโทป on ฮิวเมน CD134, which was not
critically involved in interaction of ฮิวเมน CD134 with ฮิวเมน OX4OL. Moreover,
our findings that (1, see above) mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3
seemed to recognize a linear หรือ non-linear/conformational เอพิโทป in truncated
CRD3 Al-module (according to definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 20 677-683) with amino acid sequence 108-126 (i.e., 19-meric peptide
RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; see SEQ ID NO: 34) on ภายนอกเซลล์ ฮิวเมน CD134,
or amino acid sequence 108-126 (i.e., 19-meric peptide
RCRAGTQPLDSYKPGVDCA; see SEQ ID NO: 34) formed a part for binding to a
non-linear/conformational เอพิโทป in truncated CRD3 Al-module/CRD4 Al-B1-
25 module (according to definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683),
and possibly in the hinge-like structure, with amino acid sequence 108-214 (see
SEQ ID NO: 35) on ภายนอกเซลล์ ฮิวเมน CD134, and (2, see above) mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 bound simultaneously with ฮิวเมน OX4OL on
T ลิมโฟไซต์ ที่แสดงออก ฮิวเมน CD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA , substantiated the idea 30 that the เอพิโทป (as described above) on ฮิวเมน CD134 that was recognized by
mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone 12H3 was not critically involved in
interaction of ฮิวเมน CD134 with ฮิวเมน OX4OL.
(c). เอพิโทป mapping (1) of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 using ฮิวเมน CD134-derived peptide ELISA
In order to further analyze the fine specificity of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3, the location of the เอพิโทป recognized by mouse 5 แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 was determined by เอพิโทป
mapping. The ability of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3
to bind with a ฮิวเมน CD134-derived peptide, which corresponded to amino acid
sequence of truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain Al-module (according to
definition of Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677 683), was determined by
10 ELISA.
Ninety six-wells flat-bottom ELISA plates (Corning) were coated with 10 ng/well ฮิวเมน CD134-derived peptide (synthesized by Pepscan Presto, Lelystad, The Netherlands), which corresponded to amino acid sequence of truncated CRD3
A1-module-CRD4 subdomain Al module (see SEQ ID NO: 38) หรือ with 10 ng/well 15 ฮิวเมน fibronectin-derived control peptide (synthesized by Pepscan Presto,
Lelystad, The Netherlands), which corresponded to amino acid sequence of extra
type III structural domain (see SEQ ID NO: 37) in PBS o/n at 4°C. After extensive
washing in PBS/0.05% Tween 20, plates were blocked in PBS/0.05% Tween 20/1%
BSA fraction V (Roche) for 1 hour at RT. Subsequently, plates were incubated with 20 0, 0.00005 - 50.0 (10-fold dilution steps in block buffer) p.g/mL mouse แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 หรือ mouse IgGlx ไอโซไทป์ control antibody
(BD Biosciences) for 1 hour at RT. After extensive washing in PBS/0.05% Tween
20, การยึดเกาะของ antibodies was determined with 1:5000 diluted horseradish
peroxidase-conjugated goat แอนติ-mouse IgG Fcy specific antibodies (Jackson
25 ImmunoResearch) for 1 hour at RT, followed by a ready-to-use สารละลาย of TMB
substrate (Invitrogen) for colorimetric detection. After adding 1 M H2SO4, optical
densities was measured at a wavelength of 450 nm (reference wavelength of 655
nm) using a microplate reader (BioRad).
As shown in รูป 23A (n=1), mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
30 antibody clone 12H3 dose-dependently and specifically bound ฮิวเมน CD134-
derived peptide, whereas mouse IgGix ไอโซไทป์ control antibody demonstrated no binding to ฮิวเมน CD134-derived peptide. Both mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134
โมโนโคลนอล antibody clone 12H3 and IgGiK ไอโซไทป์ control antibody demonstrated no binding to ฮิวเมน fibronectin-derived control peptide.
These results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody clone
12H3 specifically recognized an เอพิโทป on ฮิวเมน CD134 (comparison of ฮิวเมน 5 CD134-derived peptide vs. ฮิวเมน fibronectin-derived control peptide).
Furthermore, these results demonstrated that mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 antibody
clone 12H3 seemed to recognize a linear หรือ non-linear/conformational เอพิโทป in
truncated CRD3 A1-module-CRD4 subdomain Al-module (according to definition of
Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24: 677-683) with amino acid sequence 108-146
10 (i.e., 39-meric peptide
RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN; see SEQ ID NO: 38) on ภายนอกเซลล์ ฮิวเมน CD134.
(d) เอพิโทป mapping (2) of mouse แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 15 12H3 and 20E5 using CLIPS เอพิโทป Mapping Technology by Pepscan
CLIPS เอพิโทป Mapping Technology by Pepscan (Lelystad, The
Netherlands) may be used to determine the เอพิโทป recognized by mouse แอนติ-
ฮิวเมน CD134 antibodies clones 12H3 and 20E5. This CLIPS technology enables
the determination of linear, conformational, discontinuous, and complex เอพิโทป 20 involving dimeric หรือ multimeric protein complexes. For this purpose, the linear
amino acid sequence of ฮิวเมน CD134 = OX40 (SEQ ID NO: 1) คือ used as the target
protein.
Example 9. Characterization of ฮิวเมน CD134 domains and เอพิโทป recognized 25 by ไคเมริก ฮิวเมน IgG4/kappa and/or IgGl/kappa แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibodies clones 12H3 and 20E5
(a). Binding ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K and/or IgG1K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล
antibodies clones 12H3 and 20E5 with full-length ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ and 30 various truncated ฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์ expressed on 293-F cell line (domain
mapping)
In order to analyze the fine specificity of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K and/or IgG1K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5, the


location of เอพิโทป(s) recognized by ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K and/or IgG1K แอนติ-
ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5 was determined by
domain mapping. The ability of ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K and/or IgG1K แอนติ-ฮิวเมน
CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5 to bind to truncated ฮิวเมน 5 CD134 คอนสตรัคต์ (see Example 8 (b) above), expressed on the surface of (HEK-
derived) 297-F cells, was determined by FACS analysis.
Using the FreeStyleTm 293 Expression System (Invitrogen), FreeStyleTm
293-F cells (Invitrogen) were transiently transfected with the 5 generated variants
of ฮิวเมน CD134 (see above). After 48-72h, surface ฮิวเมน CD134 expression on 10 transfected cells was analyzed by FACS analysis. To this end, transfected cells
were harvested and put at 1-2x106 cells/mL in ice-chilled PBS/BSA/NaN3. Cells
were incubated with หรือ without 20.0 lig/mL ไคเมริก ฮิวเมน IgG4K and/or IgG1K
แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล antibodies clones 12H3 and 20E5 for 30 minutes at
4°C.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ในตัด CRD3 อัลโม (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24:677-683) กับกรดอะมิโนลำดับ 108-126 (เช่น 19 meric เปป RCRAGTQPLDSYKPGVDCA ดูเลข ID ลำดับ: 34) บนภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134 กรดอะมิโนหรือลำดับ 108-126 (เช่น 19-25 meric เปป RCRAGTQPLDSYKPGVDCA ดูเลข ID ลำดับ: 34) เกิดขึ้นเป็นส่วนหนึ่งสำหรับผูกกับเอพิโทปไม่ใช่เชิง เส้น/conformational ในตัด CRD3 อัลโมดู ล/CRD4 อัล-Bl-โม (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24 : 677-683), และอาจจะ ในโครง สร้างเช่นบานพับ มีกรดอะมิโน ลำดับ 108-214 (ดูเลขลำดับ ID: 35) ในภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134 เหล่านี้ แสดงผล 30 ประจักษ์นั้นเม้าส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 รู้จักเอพิโทปเป็นเชิงเส้นหรือไม่เชิง เส้น/conformational ในตัด CRD4 อัล- โมดูล (ตามคำนิยามของ Compaan et al. 2006 โครงสร้าง 14:1321-1330),และอาจจะในโครงสร้างเช่นบานพับ มีกรดอะมิโนลำดับ 147-214 (ลำดับ ID ไม่: 36) ในภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134ใช้การผลิกศาสตร์ Compaan et al. (2006 โครงสร้าง 14:1321-1330) ล่าสุด พบมีส่วนร่วมที่สำคัญของ CRD1, CRD2 (โดยเฉพาะอย่างยิ่งอัลวน และ 5 ทันทีหลังตกค้าง), และ CRD3 (หลักวนอัล) ในฮิวเมน CD134 ระหว่าง OX40ลิแกนด์ (CD252) / (= OX40) CD134 โต้ตอบ คือการค้นพบนี้ในดี ข้อตกลงกับผลการวิจัยของเราที่ (1 โปรดดูข้างต้น) แอนติบอดี CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์ 20E5 โคลนไม่ได้ดูเหมือนไม่ รู้จักฮิวเมนเป็น CD134 เอพิโทปใน CRD1, CRD2 และ โดเมนย่อย CRD3 A1-โม-CRD4 ตัดโมดูอัล (ตามคำนิยามของ 10 Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24:677-683) หรืออีกวิธีหนึ่งคือ CRD1-CRD2-CRD3A1 B1-โมดูล (ตามคำนิยามของ Compaan et al. ปี 2006 โครงสร้าง 14:1321-ฮิวเมนภายนอกเซลล์ใน 1330) CD134 และ (2 โปรดดูข้างต้น) เมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ผูกกัน ด้วยฮิวเมน OX4OL บนผาถูกกระตุ้นT ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 นี้แนะนำเมาส์ที่ต่อต้านฮิวเมน 15 CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 รู้จักเอพิโทปบนฮิวเมน CD134 ไม่ มิได้เกี่ยวข้องในการโต้ตอบของฮิวเมน CD134 กับฮิวเมน OX4OL นอกจากนี้ ผลการวิจัยของเราที่ (1 โปรดดูข้างต้น) แอนติบอดี CD134 แอนติ-ฮิวเมนเมาส์โคลน 12H 3 ดูเหมือน จะรู้จักเอพิโทปเป็นเชิงเส้นหรือไม่เชิง เส้น/conformational ในตัด CRD3 อัลโมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24:20 677-683) กับกรดอะมิโนลำดับ 108-126 (เช่น 19 meric เพปไทด์ RCRAGTQPLDSYKPGVDCA ดูเลขลำดับ ID: 34) ในภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134 หรือกรดอะมิโนลำดับ 108-126 (เช่น 19 meric เพปไทด์RCRAGTQPLDSYKPGVDCA ดูเลขลำดับ ID: 34) เกิดขึ้นเป็นส่วนหนึ่งสำหรับการรวมเพื่อการ เอพิโทปไม่ใช่เชิง เส้น/conformational ในอัลอัลโมดู ล/CRD4 CRD3 ตัด-B1 -โมดูล 25 (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994; 24:677-683), และอาจจะในโครงสร้างเช่นบานพับ มีกรดอะมิโนลำดับ 108-214 (ดู ลำดับ ID ไม่: 35) ในภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134 และ (2 โปรดดูข้างต้น) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 ผูกพร้อมกับฮิวเมน OX4OL ใน T ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนที่กระตุ้นด้วย CD134 ผา substantiated ราคาคิดที่ 30 ที่จะเอพิโทป (ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) ในฮิวเมน CD134 ที่ถูกรับรู้โดย เมาส์โคลนแอนติบอดี CD134 แอนติ-ฮิวเมน 12H 3 ไม่ถึงเกี่ยวข้องกับการ โต้ตอบของฮิวเมน CD134 กับฮิวเมน OX4OL (ค) การแม็ปเอพิโทป (1) ของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ใช้เพปไทด์ CD134 มาฮิวเมน ELISAการวิเคราะห์เพิ่มเติม specificity ดีของเมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโมโนโคลนอลโคลน 12H 3 ที่ตั้งของเอพิโทปรู้จักเมาส์ 5 แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ถูกกำหนด โดยเอพิโทป การแมป ความสามารถของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 ผูกกับตัวฮิวเมนมา CD134 เพปไทด์ ที่ corresponded กับกรดอะมิโน ลำดับของการตัด CRD3 A1-โม-CRD4 โดเมนย่อยอัล-โมดูล (ตามการ คำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994 24:677 683), ถูกกำหนดโดย10 ELISAไนน์ตี้ซิกซ์บ่อล่างแบน ELISA แผ่น (คอร์นทำ) ถูกเคลือบ ด้วย 10 ng/ดี ฮิวเมนมา CD134 เพปไทด์ (สังเคราะห์ โดย Pepscan Presto, Lelystad ประเทศเนเธอร์แลนด์), ที่ corresponded กับกรดอะมิโนลำดับของ CRD3 ตัดโดเมนย่อย CRD4 A1-โมดูลโมดูอัล (ดูเลขลำดับ ID: 38) หรือกับ 10 ng/ดี 15 ฮิวเมน fibronectin มาควบคุมเพปไทด์ (สังเคราะห์ โดย Pepscan Presto Lelystad ประเทศเนเธอร์แลนด์), ที่ corresponded ลำดับกรดอะมิโนพิเศษ ชนิด III โครงสร้างโดเมน (ดูเลขลำดับ ID: 37) ใน PBS o/n ที่ 4 องศาเซลเซียส หลังจากอ่านรีวิว ซักผ้าใน PBS/0.05% Tween 20 แผ่นถูกบล็อกใน PBS/0.05% Tween 20/1% เศษส่วนของบีเอสเอวี (Roche) 1 ชั่วโมงที่ RT. ในเวลาต่อมา แผ่นก็ incubated กับ 20 0, 0.00005 - 50.0 (10-fold เจือจางขั้นตอนในบัฟเฟอร์บล็อก) p.g/mL เมาส์แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 หรือเมาส์ IgGlx ไอโซไทป์ควบคุมแอนติบอดี (เวลาออก BD) 1 ชั่วโมงที่ RT. หลังจากซักผ้าอย่างละเอียดใน PBS/0.05% Tween 20 กำหนด ด้วย 1:5000 ผสม horseradish แอนตี้การยึดเกาะของ แพะ peroxidase กลวงแอนติ-เมาส์ IgG Fcy เฉพาะแอนตี้ (Jackson 25 ImmunoResearch) 1 ชั่วโมงที่ RT ตาม ด้วยสารละลายพร้อมใช้ของทหารไทย พื้นผิว (Invitrogen) สำหรับตรวจสอบเทียบเคียง หลังจากเพิ่ม 1 M กำมะถัน ออปติคอล ความหนาแน่นมีวัดที่ความยาวคลื่นของ 450 nm (อ้างอิงความยาวคลื่นของ 655 nm) ใช้อ่าน microplate (BioRad)ดังแสดงในรูปที่ 23A (n = 1), เมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมนโมโนโคลนอลฮิวเมน 12H 3 ผูกยา dependently และโดยเฉพาะโคลน 30 แอนติบอดี CD134 -ได้เพปไทด์ ในขณะที่แอนติบอดีเมาส์ IgGix ไอโซไทป์ควบคุมแสดงไม่ผูกกับเพปไทด์ CD134 มาฮิวเมน ทั้งเมาส์ CD134 แอนติ-ฮิวเมนโมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H 3 และแอนติบอดีควบคุมไอโซไทป์ IgGiK สาธิตไม่ผูกกับเปปฮิวเมน fibronectin มาควบคุมผลเหล่านี้แสดงว่าเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H 3 รู้จักการเอพิโทปบนฮิวเมนโดยเฉพาะ CD134 (เปรียบเทียบฮิวเมน 5 เพปไทด์ CD134 มาเทียบกับเพปไทด์ fibronectin มาควบคุมฮิวเมน) นอกจากนี้ ผลเหล่านี้แสดงว่าเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 แอนติบอดี โคลน 12H 3 ดูเหมือนจะ รู้จักเอพิโทปเป็นเชิงเส้นหรือไม่เชิง เส้น/conformational ใน ตัด CRD3 A1-โม-CRD4 โดเมนย่อยอัล-โมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al. Eur J Immunol 1994 24:677-683) กับกรดอะมิโนลำดับ 108 14610 (เช่น 39 meric เพปไทด์RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN ดูเลขลำดับ ID: 38) ในภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134(d) การแม็ปเอพิโทป (2) ของเมาส์แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 15 12H 3 และ 20E5 เอพิโทปคลิปที่ใช้เทคโนโลยีการทำแผนที่ โดย Pepscan หนีบเทคโนโลยีการแม็ปเอพิโทป โดย Pepscan (Lelystad การเนเธอร์แลนด์) อาจถูกใช้เพื่อกำหนดเอพิโทปรู้จักเมาส์แอนติ-แอนตี้ฮิวเมน CD134 clones 12H 3 และ 20E5 คลิปเทคโนโลยีนี้ช่วยให้ กำหนดการเชิงเส้น conformational ไม่ต่อเนื่อง และซับซ้อนเอพิโทป 20 เกี่ยวข้องกับ dimeric หรือ multimeric โปรตีนคอมเพล็กซ์ สำหรับวัตถุประสงค์นี้ แบบเชิงเส้น กรดอะมิโนลำดับของฮิวเมน CD134 = OX40 (เลขลำดับรหัส: 1) คือใช้เป็นเป้าหมาย โปรตีนตัวอย่างที่ 9 คุณสมบัติของโดเมน CD134 ฮิวเมนและเอพิโทปรู้จัก 25 ไคเมริกฮิวเมน IgG4/kappa / IgGl/แค ปปาแอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล แอนตี้ clones 12H 3 และ 20E5(ก) การผูกไคเมริกฮิวเมน IgG4K หรือ IgG1K แอนติฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล แอนตี้ clones 12H 3 และ 20E5 กับฮิวเมนปราศจาก CD134 คอนสตรัคต์และ 30 ต่าง ๆ ตัดฮิวเมน CD134 แสดงบรรทัด 293 F เซลล์ (โดเมนคอนสตรัคต์ การแม็ป)เพื่อวิเคราะห์ specificity ดีของไคเมริกฮิวเมน แอโมโนโคลนอล CD134 แอนติ-ฮิวเมน IgG4K / IgG1K นตี้ clones 12 H 3 และ 20E5 การที่น่าจดจำไคเมริกฮิวเมน IgG4K / IgG1K แอนติ - เอพิโทป(s)ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 12H 3 และ 20E5 ถูกกำหนดโดย โดเมนการแมป ความสามารถของไคเมริกฮิวเมน IgG4K / IgG1K แอนติ-ฮิวเมน แอนตี้โมโนโคลนอล CD134 clones 12H 3 และ 20E5 ผูกกับฮิวเมนตัด 5 CD134 คอนสตรัคต์ (ดูตัวอย่างที่ 8 (b) ข้างต้น), แสดงบนพื้นผิว (HEK- เซลล์ที่ 297-F มา) ถูกกำหนด โดยวิเคราะห์ FACSใช้ FreeStyleTm 293 นิพจน์ระบบ (Invitrogen), FreeStyleTm293-F เซลล์ (Invitrogen) transiently ได้ transfected กับตัวแปรสร้าง 5 ของฮิวเมน CD134 (ดูข้างต้น) หลัง 48-72h ฮิวเมนผิว CD134 นิพจน์ในเซลล์ transfected 10 ถูกวิเคราะห์ โดยวิเคราะห์ FACS เพื่อการนี้ transfected เซลล์ เก็บเกี่ยว และ 1-2 x 106 เซลล์/มล.ในน้ำแข็งแช่ PBS/บี เอส เอ/NaN3 เซลล์ มี incubated ด้วยหรือโดย 20.0 lig/mL ไคเมริกฮิวเมน IgG4K / IgG1K แอนติ-ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนตี้ clones 12H 3 และ 20E5 30 นาทีที่ 4 องศาเซลเซียส

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ใน CRD3 ตัดอัลโมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al, Eur J Immunol 1994; 24:. 677-683) ที่มีกรดอะมิโนลำดับที่ 108-126 (เช่น 19 Meric RCRAGTQPLDSYKPGVDCA เปปไทด์ดู SEQ ID NO: 34) บน ภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134, หรือกรดอะมิโนลำดับที่ 108-126 (เช่น 19-25 RCRAGTQPLDSYKPGVDCA เปปไทด์ Meric ดู SEQ ID NO: 34) กลายเป็นส่วนหนึ่งในการเชื่อมโยงไปยังที่ไม่ใช่เชิงเส้น / โครงสร้างเอพิโทปใน CRD3 ถูกตัดทอน Al- โมดูล / CRD4 Al-Bl โมดูล (ตามคำนิยามของ Latza et al, Eur J Immunol 1994; 24:. 677-683)
และอาจเป็นไปได้ในโครงสร้างบานพับเหมือนที่มีกรดอะมิโนลำดับที่108-214 (ดู SEQ NO ID:. 35) จากภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134
เหล่านี้
30 ผลการแสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 20E5
ดูเหมือนจะรับรู้เชิงเส้นหรือไม่เชิงเส้น/ โครงสร้างเอพิโทปที่ถูกตัดทอนใน CRD4 Al-
โมดูล (ตามคำนิยามของ Compaan et al, โครงสร้าง 2006; 14:. 1321-1330)
และอาจจะอยู่ในโครงสร้างบานพับเหมือนที่มีกรดอะมิโนลำดับที่ 147-214 (SEQ ID NO: 36) บนภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134 .
การใช้ผลึกที่ Compaan et al, (โครงสร้าง 2006; 14: 1321-1330)
เพิ่งค้นพบการมีส่วนร่วมที่สำคัญของ CRD1, CRD2 (โดยเฉพาะวงอัลและ
5 ตกค้างทันทีต่อไป) และ CRD3 (ส่วนใหญ่วงอัล) ในฮิวเมน CD134
ระหว่าง OX40 ลิแกนด์ (CD252) / CD134 (= OX40) การทำงานร่วมกัน การค้นพบนี้คือในที่ดีข้อตกลงกับผลการวิจัยของเราที่ (1, ดูด้านบน) เมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5 ไม่ได้ดูเหมือนจะรู้จักฮิวเมน CD134 เอพิโทปใน CRD1, CRD2 และCRD3 ถูกตัดทอน A1-โมดูล CRD4 อัลโมดูลย่อย (ตามคำนิยามของ 10 Latza et al, Eur J Immunol 1994; 24:. 677-683) หรืออีกทางเลือกหนึ่ง CRD1-CRD2 CRD3-A1-B1 โมดูล (ตามคำนิยามของ Compaan et al, โครงสร้าง 2006; 14: 1321- 1330) บนภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134 และ (2, ดูด้านบน) เมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดี CD134 โคลน 20E5 ผูกพันพร้อมกันกับฮิวเมน OX4OL ใน PHA กระตุ้นT ลิมโฟ ไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน CD134 นี้ชี้ให้เห็นว่าเมาส์ต่อต้านฮิวเมน 15 CD134 แอนติบอดีโคลน 20E5 ได้รับการยอมรับเอพิโทปในฮิวเมน CD134 ซึ่งไม่ได้มีส่วนเกี่ยวข้องอย่างยิ่งในการทำงานร่วมกันของฮิวเมนCD134 กับฮิวเมน OX4OL นอกจากนี้ผลการวิจัยของเราที่ (1, ดูด้านบน) เมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 ดูเหมือนจะรับรู้เชิงเส้นหรือไม่เชิงเส้น / โครงสร้างเอพิโทปในการตัดทอนCRD3 อัลโมดูล (ตามคำนิยามของ Latza . et al, Eur J Immunol 1994; 24: 677-683 20) โดยมีลำดับกรดอะมิโน 108-126 (เช่นเปปไทด์ 19 Meric RCRAGTQPLDSYKPGVDCA ดู SEQ ID NO: 34) บนภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134, หรือลำดับกรดอะมิโน 108-126 (เช่น 19 Meric เปปไทด์RCRAGTQPLDSYKPGVDCA ดู SEQ ID NO: 34) กลายเป็นส่วนหนึ่งสำหรับการมีผลผูกพันไปยังที่ไม่ใช่เชิงเส้น/ โครงสร้างเอพิโทปที่ถูกตัดทอนใน CRD3 อัลโมดูล / CRD4 Al-B1- 25 โมดูล ( ตามความหมายของ Latza et al, Eur J Immunol 1994; 24:. 677-683) และอาจจะอยู่ในโครงสร้างบานพับเหมือนที่มีกรดอะมิโนลำดับที่ 108-214 (ดูSEQ ID NO: 35) บนภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134 และ (2, ดูด้านบน) เมาส์แอนติ - ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 ผูกพันพร้อมกันกับฮิวเมน OX4OL ในทีลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมนCD134 ที่กระตุ้นด้วย PHA, พิสูจน์ 30 ความคิดที่ว่า เอพิโทป (ตามที่อธิบายไว้ข้างต้น) ในฮิวเมน CD134 ที่เป็นที่ยอมรับโดยเมาส์แอนติ- ฮิวเมนแอนติบอดีโคลน CD134 12H3 ไม่ได้เกี่ยวข้องกับวิกฤตในการทำงานร่วมกันของฮิวเมนCD134 กับฮิวเมน OX4OL. (ค ) เอพิโทปการทำแผนที่ (1) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 ใช้ฮิวเมน ELISA เปปไทด์ CD134 มาเพื่อที่จะต่อไปวิเคราะห์ความจำเพาะที่ดีของเมาส์แอนติ- ฮิว เมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3, สถานที่ตั้งของเอพิโทปได้รับการยอมรับโดยใช้เมาส์ 5 แอนติ - การฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 ถูกกำหนดโดยเอพิโทปการทำแผนที่ ความสามารถของเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 การผูกกับฮิวเมนเปปไทด์ CD134 มาซึ่งตรงกับอะมิโนกรดลำดับของการตัดทอนCRD3 A1-โมดูล CRD4 ย่อยอัลโมดูล ( ตามความหมายของLatza et al, Eur J Immunol 1994; 24:. 677 683) ถูกกำหนดโดย10 วิธี ELISA. เก้าสิบหกหลุมจาน ELISA แบนด้านล่าง (Corning) ถูกเคลือบด้วย 10 ng / ดีฮิวเมน CD134 มา เปปไทด์ (สังเคราะห์โดย Pepscan Presto, Lelystad, เนเธอร์แลนด์) ซึ่งตรงกับอะมิโนกรดลำดับตัด CRD3 A1-โมดูล CRD4 อัลโมดูลย่อย (ดู SEQ ID NO: 38) หรือ 10 ng / 15 ดีฮิวเมน fibronectin- เปปไทด์ที่ได้รับการควบคุม (สังเคราะห์โดย Pepscan Presto, Lelystad, เนเธอร์แลนด์) ซึ่งตรงกับอะมิโนลำดับกรดของพิเศษประเภทที่สามโดเมนโครงสร้าง(ดู SEQ ID NO: 37) ในพีบีเอส o / n ที่ 4 ° C หลังจากที่กว้างขวางซักผ้าในพีบีเอส / 0.05% Tween 20 แผ่นถูกบล็อกในพีบีเอส / 0.05% Tween 20/1% BSA ส่วน V (Roche) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT ต่อมาแผ่นถูกบ่ม 20 0, 0.00005-50.0 (10 เท่าขั้นตอนการลดสัดส่วนในบัฟเฟอร์บล็อก) pg / มิลลิลิตรเมาส์แอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 หรือเมาส์ IgGlx ไอโซไทป์แอนติบอดีควบคุม(BD ชีววิทยาศาสตร์) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT หลังจากที่กว้างขวางในการซักผ้าพีบีเอส / 0.05% Tween 20 แอนติบอดีการยึดเกาะของถูกกำหนด 1: 5000 ปรับลดมะรุมperoxidase-ผันแพะแอนติ -mouse IgG FCY แอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจง (แจ็คสัน25 ImmunoResearch) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ RT ตามด้วย พร้อมต่อการใช้สารละลายทหารไทยพื้นผิว(Invitrogen) สำหรับการตรวจสอบสี หลังจากเพิ่ม 1 M H2SO4 แสงความหนาแน่นของวัดที่ความยาวคลื่น450 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นอ้างอิง 655 นาโนเมตร) โดยใช้เครื่องอ่าน microplate (BioRad). ดังแสดงในรูป 23A (n = 1) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอล30 แอนติบอดีโคลน 12H3 ยา dependently และผูกพันเฉพาะฮิวเมน CD134- เปปไทด์ที่ได้รับในขณะที่เมาส์ IgGix ไอโซไทป์แอนติบอดีแสดงให้เห็นถึงการควบคุมไม่ผูกพันกับฮิวเมน CD134 เปปไทด์ที่ได้มาจาก ทั้งเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ IgGiK ไอโซไทป์แอนติบอดีควบคุมแสดงให้เห็นไม่ผูกพันกับฮิวเมนเปปไทด์ควบคุม fibronectin มา. ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน แอนติบอดีโคลน CD134 12H3 ได้รับการยอมรับโดยเฉพาะเอพิโทปในฮิวเมน CD134 (เปรียบเทียบฮิวเมน 5 CD134 เปปไทด์ที่ได้มาเทียบกับฮิวเมนควบคุม fibronectin เปปไทด์ที่ได้มา). นอกจากนี้ผลเหล่านี้แสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน12H3 ดูเหมือนจะรับรู้เชิงเส้นหรือไม่เชิงเส้น / โครงสร้างเอพิโทปในCRD3 ตัด A1-โมดูล CRD4 ย่อยอัลโมดูล (ตามคำนิยามของLatza et al, Eur J Immunol 1994; 24. 677-683) ที่มีลำดับกรดอะมิโน 108-146 10 (เช่น 39 Meric เปปไทด์RCRAGTQPLDSYKPGVDCAPCPPGHFSPGDNQACKPWTN ดู SEQ ID NO. 38) จากภายนอกเซลล์ฮิวเมน CD134 (ง) เอพิโทปการทำแผนที่ (2) แอเมาส์ นติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 15 12H3 และ 20E5 ใช้คลิปเอพิโทปแมปเทคโนโลยีโดย Pepscan คลิปเอพิโทปแมปเทคโนโลยีโดย Pepscan (Lelystad ที่เนเธอร์แลนด์) อาจจะใช้ในการกำหนดเอพิ โทปได้รับการยอมรับโดยใช้เมาส์แอนติ - ฮิวเมน CD134 แอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5 ซึ่งเป็นเทคโนโลยีที่ช่วยให้คลิปการกำหนดเส้นโครงสร้างต่อเนื่องและซับซ้อนเอพิโทป 20 ที่เกี่ยวข้องกับโปรตีนคอมเพล็กซ์ dimeric หรือ multimeric เพื่อจุดประสงค์นี้เชิงเส้นลำดับกรดอะมิโนฮิวเมน CD134 = OX40 (SEQ ID NO: 1) คือใช้เป็นเป้าหมายโปรตีน. ตัวอย่าง 9. ลักษณะของฮิวเมน CD134 โดเมนและเอพิโทปได้รับการยอมรับจาก 25 ไคเม ริกฮิวเมน IgG4 / คัปปาและ / หรือ IgGl / คัปปาแอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี12H3 และ 20E5 (ก) ผูกไคเมริกฮิวเมน IgG4K และ / หรือ IgG1K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี12H3 และ 20E5 กับยาวเต็มรูปแบบฮิวเมน CD134 คอนสตรัคต์และ 30 ฮิต่างๆถูกตัดทอนวเมน CD134 คอนสตรัคต์แสดงบน 293-F สายพันธุ์ของเซลล์ (โดเมนทำแผนที่) เพื่อที่จะวิเคราะห์ความจำเพาะที่ดีของไคเมริกฮิวเมน IgG4K และ / หรือ IgG1K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลโคลนแอนติบอดี 12H3 และ 20E5 ที่ตั้งของเอพิโทป(s) ได้รับการยอมรับโดยไคเมริกฮิวเมน IgG4K และ / หรือ IgG1K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5 ถูกกำหนดโดยการทำแผนที่โดเมน ความสามารถของไคเมริกฮิวเมน IgG4K และ / หรือ IgG1K แอนติ - ฮิวเมนCD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5 ผูกกับตัดทอนฮิวเมน 5 CD134 คอนสตรัคต์ (ดูตัวอย่าง 8 ( ข) ข้างต้น) แสดงบนพื้นผิวของ (HEK- มา) เซลล์ 297-F, ถูกกำหนดโดยการวิเคราะห์มาซึ่ง. ใช้ FreeStyleTm 293 ระบบการแสดงออก (Invitrogen) FreeStyleTm เซลล์ 293-F (Invitrogen) ถูก transfected transiently กับ 5 สร้างสายพันธุ์ของฮิวเมนCD134 (ดูด้านบน) หลังจาก 48-72h พื้นผิวฮิวเมนแสดงออก CD134 เมื่อวันที่ 10 เซลล์ transfected ได้รับการวิเคราะห์โดยการวิเคราะห์มาซึ่ง ด้วยเหตุนี้เซลล์ transfected ถูกเก็บเกี่ยวและใส่ที่ 1-2x106 เซลล์ / มิลลิลิตรในพีบีเอสน้ำแข็งแช่เย็น / บีเอสเอ / NaN3 เซลล์ถูกบ่มกับหรือโดยไม่ต้อง lig 20.0 มิลลิลิตร / ไคเมริกฮิวเมน IgG4K และ / หรือ IgG1K แอนติ - ฮิวเมน CD134 โมโนโคลนอลแอนติบอดีโคลน 12H3 และ 20E5 30 นาทีที่4 ° C

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ในปลาย crd3 อัลโม ( ตามคำนิยามของ latza et al . Eur J immunol 1994 ; 24 : 677-683 ) กับลำดับกรดอะมิโน 108-126 ( เช่น 19 meric เปปไทด์ rcragtqpldsykpgvdca ; ดู seq ไม่มี ID : 34 ) ภายนอกเซลล์ฮิวเมน cd134 ค็อค , ลำดับกรดอะมิโน 108-126 ( เช่น 19-25 meric เปปไทด์ rcragtqpldsykpgvdca seq id : ไม่มี ; เห็น34 ) ที่เกิดขึ้นส่วนหนึ่งผูกพันกับเส้น / โครงสร้างเอพิโทปในปลาย crd3 อัล - โม / crd4 อัล BL โมดูล ( ตามคำนิยามของ latza et al . Eur J immunol 1994 ; 24 : 677-683 ) , และอาจจะในหลักการ เช่น โครงสร้าง ด้วยกรดอะมิโน
( ดูลำดับ 108-214 seq ไม่มี ID : 35 ) ภายนอกเซลล์ฮิวเมน cd134 .

เหล่านี้ผลลัพธ์แสดงให้เห็นว่าเมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ดูเหมือน
จำเป็นเส้นตรงเส้นหนึ่งตัดค็อค / เอพิโทปใน crd4 อัล -
โมดูล ( ตามคำนิยามของ compaan et al . โครงสร้าง 2006 ; 14 : 1321-1330 )
และอาจจะในหลักการ เช่น โครงสร้าง กับลำดับกรดอะมิโน 147-214 ( seq id ไม่ :36 ) ในภายนอกเซลล์ฮิวเมน cd134 .
ใช้ผลึกศาสตร์ compaan , et al . ( โครงสร้าง 2006 ; 14 : 1321-1330 )
ค้นพบเมื่อเร็ว ๆ นี้มีส่วนร่วมสำคัญของ crd1 crd2 , ( โดยเฉพาะวงและ
5 ต่อทันทีตกค้าง ) และ crd3 ( หลักอัล Loop ) ในฮิวเมน cd134
ในระหว่าง ox40 ลิแกนด์ ( cd252 ) / cd134 ( = ox40 ) ปฏิสัมพันธ์ ค้นพบนี้ความดี
ข้อตกลงกับผลการวิจัยของเราที่ 1 , ดูข้างต้น ) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดี
โคลน 20e5 ไม่ได้ดูเหมือนจะรับรู้ฮิวเมน cd134 เอพิโทปใน crd1 crd2 , และตัด a1-module-crd4 ซับโดเมน อัล crd3
โมดูล ( ตามคำนิยามของ 10 latza et al . Eur J immunol 1994 ; 24 : 677-683 ) หรือ crd1-crd2-crd3
ค็อคa1-b1-module ( ตามคำนิยามของ compaan et al . โครงสร้าง 2006 ; 14 : 1308 -
1180 ) ภายนอกเซลล์ฮิวเมน cd134 และ ( 2 , ดูข้างต้น ) เมาส์แอนติ - ฮิวเมน cd134 แอนติบอดีโคลน 20e5 ผูกพันพร้อมกับฮิวเมน ox4ol บนผากระตุ้น
t ลิมโฟไซต์ที่แสดงออกฮิวเมน cd134 .