were observed under phase contrast

were observed under phase contrast microscopy at 24 hours, 48 hours, and 96 hours after treatment.
[0201] Even at low concentrations of สฟิงโกไมอีลิน, most extensions, although not extremely long, were longer than ชุดควบคุมเชิงลบ and much more numerous. สฟิงโกไมอีลิน from bovine at 40 µM and from buttermilk at 20 µM were more effective than DHA in this protocol. See. Figs. 3A, 38, and 3C.
[0202] Among the additions of สฟิงโกไมอีลิน at various aforementioned concentrations

it was found that 40µM of สฟิงโกไมอีลิน enhanced neural differentiation of hADSCs. In light of
these results, it was determined that สฟิงโกไมอีลิน can serve as a naturally-occurring สารอาหาร

that possesses การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ actions.




[0203]

Example 3

This example describes the การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ of hADSCs by CDP-โคลีน as

compared to DHA and a negative control.



[0204] CDP-โคลีน was obtained from Kyowa Hakko Gio Co. CDP-โคลีน was dissolved to 200µM in sterile H20 in a laminar flow hood, giving a clear stock สารละลาย. The hADSCs were cultured, พาสเซจd, seeded and subjected to CDP-โคลีน via the same procedure outlined in Example 1.
[0205] Treatments of CDP-โคลีน, were tested at concentrations of 5µM and 1 OµM. CDP-โคลีน in varying concentrations was tested individually and compared to the positive control, DHA at 10 µM (รูป 4A), และ the negative control (รูป 48) under phase contrast microscopy at 3 hours, 24 hours and 48 hours after treatment. The experiments were repeated in triplicate.
[0206] นอกจากนี้, CDP-โคลีน at the concentration of 5µM demonstrated an effect to enhance การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ as observed neurite outgrowth and neuronal morphological changes were observed on hADCSs treated with CDP-โคลีน. See. รูป 4C. Note that the cytoplasm shrank and นิวไรต์ began to protrude. The corolla of light can be observed with the neuronal differentiated cells due to the shrinking cellular body and the enhanced reflection of light from the microscope. Longer neurite growth was observed.
[0207] CDP-โคลีน at 1 OµM in addition with DHA at 1 OµM exhibited synergistic การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ in hADSCs. See. รูป 40. The hADSCs underwent significant การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ in the presence of the combination of CDP-โคลีน and DHA.
[0208] นอกจากนี้, CDP-โคลีน promotes การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ on human neuronal stem cells ("hNSCs") line. ที่เปิดเผยในที่นี้ is the method for testing การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ of CDP-โคลีน on hNSCs and the results obtained.
[0209] Briefly, hNSCs were purchased from Millipore, Bellerica, MA, U.S.A., with genetic modification to constitutively express green fluorescent protein ("GFP"). The hNSCs were cultured on laminin coated plates as recommended by the manufacturer. Both laminin and DEME/F12 were obtained from Millipore. Laminin was diluted with DMEM/F12 to 20µg/ml. 10 ml of diluted laminin สารละลาย was added to 10cm tissue culture dish. Then the culture dish was incubated in a 37°C, 5% C02 incubator overnight. Just before use, the laminin สารละลาย was aspirated and rinsed once with sterile DPBS สารละลาย. hNSCs were cultured in the ReNcell NSC maintenance อาหารเพาะเลี้ยง (Millipore) supplied with 20 ng/ml bFGF and 20 ng/ml EGF in a 37°C,

5% C02 incubator. อาหารเพาะเลี้ยง was exchanged with fresh อาหารเพาะเลี้ยง containing bFGF and EGF

every other day thereafter. The cells reached 80% confluence 2 to 3 days after this step.

[0210] After hNSCs reach 80% confluence, hNSCs were ready for the differentiation experiment. Before seeding, a 96-well plate was freshly coated with 20 µg/mL laminin สารละลาย followed by a brief DPBS rinse as described above. Culture อาหารเพาะเลี้ยง was removed carefully and hNSCs were dissociated within 3ml Accutase (Millipore) in a 37°C, 5% C02 incubator for 3 minutes. Then 5ml of ReNcell NSC maintenance อาหารเพาะเลี้ยง (Millipore) supplied with 20 ng/mL bFGF and 20 ng/mL EGF were added. The cell suspension was then transferred a sterile 15ml conical tube and the cells were pelleted by the centrifugation at 300 x g for 5 minutes.
Supernatant was removed. 2ml อาหารเพาะเลี้ยง was then applied to the tube and hNSCs was

resuspended thoroughly. The hNSCs were seeded on a 96-well plate at a density of 1x104

cell/ml (1000 cells/well, 100 µI/well).

[0211] After attaching to the culture surface, the culture อาหารเพาะเลี้ยง was switched to serum-free differentiation อาหารเพาะเลี้ยง in the presence of CDP-โคลีน, or DHA, or no treatment. The serum-free differentiation อาหารเพาะเลี้ยง was prepared freshly before the switching including 40 ml DMEM/F12 (Millipore), 400 µI L-กลูตามีน at a concentration of 200mM (Life Technologies, Carlsbad, CA), 400 µI 827 สารละลาย (Life Technologies, Carlsbad, CA), and 40 µI Heperin (Sigma-Aldrich, St. Louis, Ml) สารละลาย at a concentration of 1 Omg/ml.
[0212] The cells were observed for morphological changes after 72 hours under inverted fluorescent microscopy. The entire 96-well plate was placed under the Leica DMl4000B fluorescent microscopy, และ images were taken with GFP filter under a microscope with UV light source.
[0213] CDP-โคลีน of 4µM dramatically promoted การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ when compared to no

treatment. See รูป 4E. The hNSCs observed had shrinking cellular bodies, projecting neurities and were developing dendrites. See รูป 4F. The length of neurite outgrowth in the presence of CDP-โคลีน is comparable to DHA at 20 µM which demonstrates good effects on การสร้างเซลล์ประสาทใหม่. See รูป 4G.
[0214] Further, CDP-โคลีน at 12.5 µM synergizes with other brain สารอาหาร including

DHA at 5 µM, N-ออกทาโนอิล-D-ธรีโอ-สฟิงโกซีน at 0.1 µM, ยูริดีน at 20 µM, โคเลสเทอรอล at 25

µM, เรสเวราทรอล at 8.8 µM, และ ลูทีน at 0.3 µM to dramatically promote การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ in a rapid manner. The morphological changes shown in รูป 4H, illustrates the neuronal morphological changes of hNSCs after treatment with CDP-โคลีน and these other brain สารอาหาร. These morphological changes include the appearance of more oligodendrocyte differentiation, which suggest myelination function.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สุภัคภายใต้ระยะคมชัด microscopy ที่ 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมง 96 ชั่วโมงหลังการรักษา[0201] คู่ที่ความเข้มข้นต่ำสุดของสฟิงโกไมอีลิน ขยายส่วนใหญ่ แต่ไม่มากยาว ได้นานกว่าชุดควบคุมเชิงลบและอื่น ๆ มากมาย สฟิงโกไมอีลิน จากวัวที่ 40 µM และ buttermilk ที่ 20 µM ได้มีประสิทธิภาพกว่าดีเอชเอในโพรโทคอลนี้ ดู Figs. 3A, 38 และ 3 c[0202] ระหว่างการเพิ่มของสฟิงโกไมอีลินที่ความเข้มข้นดังกล่าวต่าง ๆมันถูกค้นพบที่ 40µM ไปยังสร้างความแตกมากประสาทและต่างที่ต่าง ๆ สฟิงโกไมอีลินเพิ่มเติมของ hADSCs Light ของผลลัพธ์เหล่านี้ ได้กำหนดสฟิงโกไมอีลินที่สามารถทำหน้าที่เป็นสารอาหารที่เกิดขึ้นตามธรรมชาติที่มีการดำเนินการการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ [0203] ตัวอย่างที่ 3ตัวอย่างนี้อธิบายการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ของ hADSCs โดย CDP-โคลีนเป็น เมื่อเทียบกับดีเอชเอและควบคุมลบ[0204] CDP โคลีนได้รับจาก Kyowa บริษัทฮากโก้ Gio Co. CDP-โคลีนถูกส่วนยุบเพื่อ 200µM ในกอซเอท 20 ในฮูดเป็นกระแส laminar สารละลายหุ้นล้างให้ HADSCs มี อ่าง พาสเซจd, seeded และต้องผ่านขั้นตอนเดียวกันที่ระบุไว้ในตัวอย่าง 1 CDP-โคลีน[0205] บำบัดของ CDP-โคลีน ทดสอบที่ความเข้มข้นของ 5µM และทดสอบทีละ 1 OµM การ CDP-โคลีนในความเข้มข้นแตกต่างกัน และเปรียบเทียบกับตัวควบคุมบวก ดีเอชเอที่ 10 µM (รูป 4A), และควบคุมค่าลบ (รูป 48) ภายใต้ microscopy ความคมชัดระยะที่ 3 ชั่วโมง 24 ชั่วโมงและ 48 ชั่วโมงหลังการรักษา ทดลองถูกทำซ้ำใน triplicateนอกจากนี้ [0206] CDP-โคลีนที่ความเข้มข้นของ 5µM แสดงให้เห็นว่าลักษณะพิเศษการสร้างเซลล์ประสาทใหม่เป็น neurite ที่พบไปปรับปรุง และเปลี่ยนแปลงสัณฐาน neuronal สุภัคบนรับ CDP โคลีน hADCSs ดู ค. 4 รูป หมายเหตุที่ไซโทพลาซึม shrank และนิวไรต์เริ่มป่อง โคโรลล่าไฟจะสังเกตได้จากเซลล์ต่าง ๆ neuronal ตัวเซลล์หดตัวและสะท้อนเพิ่มแสงจากกล้องจุลทรรศน์ เจริญเติบโต neurite อีกต่อไปถูกตรวจสอบโคลีน CDP [0207] ที่ 1 OµM แห่ง มีดีเอชเอที่ 1 OµM จัดแสดงการสร้างเซลล์ประสาทใหม่พลังใน hADSCs ดู รูปที่ 40 HADSCs การเปลี่ยนการสร้างเซลล์ประสาทใหม่สำคัญในต่อหน้าของ CDP โคลีนและดีเอชเอนอกจากนี้ [0208] CDP โคลีนส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทใหม่บรรทัดมนุษย์ neuronal เซลล์ต้นกำเนิด ("hNSCs") ที่เปิดเผยในที่นี้เป็นวิธีการทดสอบการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ของ CDP โคลีนบน hNSCs และผลได้รับ[0209] สั้น ๆ hNSCs ซื้อจากมาก Bellerica, MA สหรัฐอเมริกา มีการปรับเปลี่ยนพันธุกรรม constitutively แสดงโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ("GFP") HNSCs มีอ่างบนแผ่นเคลือบ laminin แนะนำ โดยผู้ผลิต Laminin และ DEME/F12 ได้รับมาจากมาก Laminin ถูกผสมกับ DMEM/F12 เพื่อ 20µg / ml. ml 10 ของสารละลาย laminin แตกออกเพิ่มไป 10 ซม.จานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ แล้ว จานวัฒนธรรมถูก incubated ใน 37° C, 5% C02 incubator ค้างคืน ก่อนใช้ laminin สารละลาย aspirated และ rinsed ด้วยสารละลาย DPBS กอซครั้ง hNSCs มีอ่างใน ReNcell NSC บำรุงรักษาอาหารเพาะเลี้ยง (มาก) ให้กับ 20 ng/ml bFGF 20 ng/ml EGF ใน 37° C บ่มเพาะวิสาหกิจของ 5% C02 อาหารเพาะเลี้ยงถูกแลกเปลี่ยนกับอาหารเพาะเลี้ยงสด bFGF และ EGFทุกวันหลังจากนั้น เซลล์ถึงบรรจบ 80% 2-3 วันหลังจากขั้นตอนนี้[0210] หลังจาก hNSCs ถึง 80% บรรจบ hNSCs มีพร้อมสำหรับการทดลองสร้างความแตกต่าง ก่อนปลูก จานดี 96 ถูกสดสามารถเคลือบ ด้วยสารละลาย laminin ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/mL 20 ตาม ด้วยการล้าง DPBS สั้น ๆ ที่อธิบายข้างต้น วัฒนธรรมอาหารเพาะเลี้ยงถูกเอาออกอย่างระมัดระวัง และ hNSCs ได้ถูกภายใน 3ml Accutase (มาก) ใน 37° C, 5% C02 incubator นาที 3 Ml แล้ว 5 ของ ReNcell NSC บำรุงรักษาอาหารเพาะเลี้ยง (มาก) ให้กับ 20 bFGF ng/mL และเพิ่ม 20 ng/mL EGF การระงับเซลล์แล้วมีการโอนย้าย 15ml ใส่หลอดทรงกรวยและเซลล์ได้ pelleted โดย centrifugation ที่ 300 กรัม x 5 นาทีSupernatant ถูกเอาออก 2ml อาหารเพาะเลี้ยงถูกแล้วใช้ท่อ และ hNSCs ได้resuspended อย่างละเอียด HNSCs ถูก seeded บนจานดี 96 ที่มีหนาแน่น 1 x 104เซลล์/มล. (1000 เซลล์/ดี µI ดี 100)[0211] หลังแนบกับพื้นผิวของวัฒนธรรม อาหารเพาะเลี้ยงวัฒนธรรมถูกสลับไปยังอาหารเพาะเลี้ยงเซรั่มปราศจากการสร้างความแตกต่างในต่อหน้าของ CDP- โคลีน หรือดีเอชเอ หรือรักษาไม่ อาหารเพาะเลี้ยงเซรั่มปราศจากการสร้างความแตกต่างได้เตรียมสดก่อนการสลับรวม 40 ml DMEM/F12 (มาก), 400 µI L-กลูตามีนที่ความเข้มข้น 200mM (เทคโนโลยีชีวิต คาร์ลส CA), 400 สารละลาย µI 827 (เทคโนโลยีชีวิต คาร์ลส CA), และ 40 µI Heperin (ซิก-Aldrich เซนต์หลุยส์ มล) สารละลายที่ความเข้มข้นของ Omg 1 ml[0212] เซลล์ถูกตรวจสอบสำหรับการเปลี่ยนแปลงสัณฐานหลังจาก 72 ชั่วโมงภายใต้ฟลูออเรส microscopy กลับ แผ่น 96-ดีทั้งหมดที่อยู่ภายใต้ microscopy ฟลูออเรส DMl4000B ไล และภาพที่ถ่าย ด้วยกรอง GFP ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ด้วยแสง UVโคลีน CDP [0213] ของ 4µM การสร้างเซลล์ประสาทใหม่เมื่อเทียบกับไม่มีการส่งเสริมอย่างมากรักษา ดูรูป 4e-fe กลไก HNSCs สังเกตมีร่างกายโทรศัพท์มือถือ neurities อาจบล็อกการหดตัว และได้พัฒนา dendrites ดูรูป 4F ความยาวของ neurite ไปในต่อหน้าของ CDP โคลีนเทียบได้กับดีเอชเอที่ 20 µM ซึ่งแสดงให้เห็นถึงผลกระทบที่ดีในการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ได้ ดูรูป 4 กรัม[0214] ต่อ synergizes โคลีน CDP ที่ 12.5 µM มีอื่น ๆ รวมทั้งสมองสารอาหารดีเอชเอที่ 5 µM, N-ออกทาโนอิล-D-ธรีโอ-สฟิงโกซีนที่ 0.1 µM ยูริดีนที่ 20 µM โคเลสเทอรอลที่ 25µM เรสเวราทรอลที่ 8.8 µM ลูทีนและที่ 0.3 µM เพื่อส่งเสริมการการสร้างเซลล์ประสาทใหม่อย่างรวดเร็วอย่างมาก เปลี่ยนแปลงของที่แสดงในรูป 4H แสดงการเปลี่ยนแปลงสัณฐาน neuronal ของ hNSCs หลังจากรักษากับ CDP โคลีนและสารอาหารสมองอื่น ๆ เหล่านี้ แปลงสัณฐานรวมลักษณะที่ปรากฏของเพิ่มเติม oligodendrocyte สร้างความแตกต่าง การแนะนำฟังก์ชัน myelination

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ถูกตั้งข้อสังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์เฟสตรงกันข้ามที่ 24 ชั่วโมง, 48 ชั่วโมงและ 96 ชั่วโมงหลังการรักษา.
[0201] แม้ในความเข้มข้นต่ำของสฟิงโกไมอีลินส่วนขยายส่วนใหญ่แม้จะไม่ยาวมากเป็นเวลานานกว่าชุดควบคุมเชิง ลบและอื่น ๆ อีกมากมาย สฟิงโกไมอีลินจากวัวที่ 40 ไมครอนและจากบัตเตอร์ที่ 20 ไมครอนมีประสิทธิภาพมากกว่าดีเอชเอในโปรโตคอลนี้ เห็น มะเดื่อ 3A, 38, และ 3C.
[0202] ในการเพิ่มของสฟิงโกไมอีลินที่ความเข้มข้นต่างๆดังกล่าวก็พบว่า40μMของสฟิงโกไมอีลินที่เพิ่มความแตกต่างของระบบประสาท hADSCs ในแง่ของผลเหล่านี้มันก็ตั้งใจว่าสฟิงโกไมอีลินสามารถทำหน้าที่เป็นธรรมชาติที่เกิดขึ้นสารอาหารที่มีคุณสมบัติการสร้างเซลล์ประสาทใหม่การกระทำ. [0203] ตัวอย่างที่ 3 ตัวอย่างนี้อธิบายถึงการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ ของ hADSCs โดย CDP- โคลีนเป็นเมื่อเทียบกับดีเอชเอและการควบคุมเชิงลบ. [0204] CDP- โคลีนที่ได้รับจาก Kyowa Hakko Gio จำกัด CDP- โคลีนก็เลือนหายไปใน200μM H20 ผ่านการฆ่าเชื้อในเครื่องดูดควันไหล ทำให้หุ้นที่ชัดเจนสารละลาย hADSCs เลี้ยง, พาสเซจ D, เมล็ดและเป็นไป CDP- โคลีนผ่านขั้นตอนเดียวกันที่ระบุไว้ในตัวอย่างที่ 1 [0205] การรักษา CDP- โคลีนได้รับการทดสอบที่ระดับความเข้มข้นของ5μM 1 OμM CDP- โคลีนในระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกันได้รับการทดสอบเป็นรายบุคคลและเมื่อเทียบกับการควบคุมในเชิงบวกที่ดีเอชเอ 10 ไมครอน (รูป 4A) และการควบคุมลบ (รูปที่ 48) ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ตรงกันข้ามเฟสที่ 3 ชั่วโมง 24 ชั่วโมงและ 48 ชั่วโมงหลังการรักษา . ทดลองซ้ำในเพิ่มขึ้นสามเท่า. [0206] นอกจากนี้, CDP- โคลีนที่ความเข้มข้น5μMแสดงให้เห็นถึงผลกระทบเพื่อเพิ่มการสร้างเซลล์ประสาทใหม่เป็นผลพลอยได้ neurite สังเกตและเส้นประสาทการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาถูกตั้งข้อสังเกตเกี่ยวกับการรักษาด้วย hADCSs CDP- โค ลีน เห็น รูป 4C โปรดทราบว่าพลาสซึมหดตัวและนิวไรต์เริ่มที่จะยื่นออกมา กลีบของแสงที่สามารถมองเห็นได้ด้วยเซลล์ประสาทที่แตกต่างกันเนื่องจากร่างกายหดตัวและโทรศัพท์มือถือที่เพิ่มขึ้นสะท้อนของแสงจากกล้องจุลทรรศน์ อีกต่อไปการเจริญเติบโต neurite พบว่า. [0207] CDP- โคลีนที่ 1 OμMในนอกจากนี้ยังมีดีเอชเอที่ 1 OμMแสดงการทำงานร่วมกันการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ใน hADSCs เห็น รูป 40 hADSCs เปลี่ยนอย่างมีนัยสำคัญการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ในที่ที่มีการรวมกันของ CDP- โคลีนและ DHA. [0208] นอกจากนี้, CDP- โคลีนส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ในเซลล์ต้นกำเนิดประสาทของมนุษย์ ( "hNSCs") สาย ที่เปิดเผยในที่นี้เป็นวิธีการสำหรับการทดสอบการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ของ CDP- โคลีนใน hNSCs และผลที่ได้รับ. [0209] สั้น ๆ , hNSCs ถูกซื้อมาจากค Bellerica, MA, สหรัฐอเมริกาและมีการดัดแปลงพันธุกรรมเพื่อ constitutively แสดงโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ("GFP") hNSCs เพาะเลี้ยงบนจานเคลือบ laminin ตามคำแนะนำของผู้ผลิต ทั้งสอง laminin และ DEME / F12 ที่ได้รับจากค laminin ถูกเจือจางด้วย DMEM / F12 เพื่อ20μg / ml 10 มิลลิลิตรของสารละลายเจือจาง laminin ถูกบันทึกอยู่ใน 10cm จานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ แล้วจานวัฒนธรรมถูกบ่มในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 5% C02 ศูนย์บ่มเพาะในชั่วข้ามคืน ก่อนที่จะใช้เป็นสารละลาย laminin สำลักและล้างครั้งเดียวกับสารละลาย DPBS ผ่านการฆ่าเชื้อ hNSCs เลี้ยงใน ReNcell NSC บำรุงรักษาอาหารเพาะเลี้ยง (ค) ที่มาพร้อมกับ 20 ng / ml bFGF และ 20 ng / ml EGF ในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 5% C02 ศูนย์บ่มเพาะ อาหารเพาะเลี้ยงได้รับการแลกเปลี่ยนกับอาหารสดเพาะเลี้ยงที่มี bFGF และ EGF ทุกวัน ๆ หลังจากนั้น เซลล์ถึง 80% บรรจบกัน 2-3 วันหลังจากขั้นตอนนี้. [0210] หลังจาก hNSCs บรรจบกันถึง 80% hNSCs มีความพร้อมสำหรับการทดสอบความแตกต่าง ก่อนที่จะเพาะแผ่น 96 หลุมถูกเคลือบสด 20 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร laminin สารละลายตามด้วยล้าง DPBS สั้น ๆ ที่อธิบายข้างต้น วัฒนธรรมอาหารเพาะเลี้ยงจะถูกลบออกอย่างระมัดระวังและ hNSCs ถูกแยกตัวภายใน 3ml Accutase (ค) ในอุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 5% C02 ศูนย์บ่มเพาะเป็นเวลา 3 นาที จากนั้น 5ml ของ ReNcell บำรุงรักษา NSC อาหารเพาะเลี้ยง (ค) ที่มาพร้อมกับ 20 ng / bFGF และ 20 นาโนกรัม / มิลลิลิตร EGF ถูกเพิ่ม เซลล์แขวนลอยจากนั้นก็ย้ายหมัน 15ml หลอดรูปกรวยและเซลล์ที่ถูกเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยงที่ 300 XG 5 นาที. ใสจะถูกลบออก 2ml อาหารเพาะเลี้ยงถูกนำมาใช้แล้วหลอดและ hNSCs ถูกresuspended อย่างทั่วถึง hNSCs เมล็ดบนจาน 96 หลุมที่ความหนาแน่น 1x104 เซลล์ / มล. (1000 เซลล์ / ดี 100 μI / ดี). [0211] หลังจากที่ติดกับพื้นผิววัฒนธรรมวัฒนธรรมอาหารเพาะเลี้ยงได้รับการเปลี่ยนไป serum- ความแตกต่างของฟรีอาหารเพาะเลี้ยงในที่ที่มี CDP- โคลีนหรือดีเอชเอหรือไม่มีการรักษา ซีรั่มที่ปราศจากความแตกต่างของอาหารเพาะเลี้ยงได้รับการปรุงสดใหม่ก่อนที่จะเปลี่ยนรวมทั้ง 40 มล. DMEM / F12 (ค) 400 μI L- กลูตามีนที่ความเข้มข้น 200mm (ไลฟ์เทคโนโลยีส์, คาร์ลส, CA) 400 827 μIสารละลาย (เทคโนโลยีชีวิต Carlsbad, CA) และ 40 μI Heperin (Sigma-Aldrich เซนต์หลุยส์ Ml) สารละลายที่ความเข้มข้น 1 Omg / ml. [0212] เซลล์ถูกตั้งข้อสังเกตการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาหลังจาก 72 ชั่วโมงภายใต้การเรืองแสงคว่ำ กล้องจุลทรรศน์ ทั้งแผ่น 96 หลุมอยู่ภายใต้กล้องจุลทรรศน์ Leica DMl4000B เรืองแสงและภาพที่ถูกถ่ายด้วย GFP กรองภายใต้กล้องจุลทรรศน์ที่มีแหล่งกำเนิดแสง UV. [0213] CDP- โคลีนของ4μMเลื่อนตำแหน่งอย่างรวดเร็วการสร้างเซลล์ประสาทใหม่เมื่อเทียบกับ ไม่มีการรักษา ดูรูป 4E hNSCs สังเกตได้หดตัวของเซลล์ร่างกายฉาย neurities และได้รับการพัฒนา dendrites ดูรูป 4F ความยาวของผลพลอยได้ neurite ในการปรากฏตัวของ CDP- โคลีนก็เปรียบได้กับดีเอชเอที่ 20 ไมครอนซึ่งแสดงให้เห็นถึงผลกระทบที่ดีในการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ ดูรูป 4G. [0214] นอกจาก CDP- โคลีนที่ 12.5 ไมครอน synergizes กับสมองอื่น ๆ รวมทั้งสารอาหารDHA 5 ไมครอน, N-ออกทาโนอิล -D- ธ รีโอ - สฟิงโกซีนที่ 0.1 ไมครอน, ยูริดีนที่ 20 ไมครอน, โคเลสเทอรอลที่ 25 ไมครอน, เรสเวราทรอลที่ 8.8 ไมครอน, และลูทีนที่ 0.3 ไมครอนไปอย่างรวดเร็วส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ในลักษณะที่รวดเร็ว . การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาที่แสดงในรูป 4H แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาของเส้นประสาท hNSCs หลังการรักษาด้วย CDP- โคลีนและสมองอื่น ๆ เหล่านี้สารอาหาร การเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาเหล่านี้รวมถึงการปรากฏตัวของความแตกต่างของโอลิโกเดนโดรไซต์มากขึ้นซึ่งแนะนำฟังก์ชั่น myelination

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

พบภายใต้กล้องจุลทรรศน์เฟสคอนที่ 24 ชั่วโมง 48 ชั่วโมงและ 72 ชั่วโมงหลังการรักษา .
[ 0201 ] แม้ที่ความเข้มข้นต่ำของสฟิงโกไมอีลินส่วนใหญ่ นามสกุล แต่ไม่ได้ยาวมาก เป็นนานกว่าชุดควบคุมเชิงลบและมากเพิ่มเติมมากมายสฟิงโกไมอีลินจากวัวที่ 40 µ M และจาก buttermilk ที่ 20 µ M มีประสิทธิภาพมากกว่า DHA ในพิธีสารนี้ เห็น มะเดื่อ . 3A , 38 และ 3 C .
[ ประเทศ ] ระหว่างเพิ่มเติมจากที่ต่าง ๆ (

สฟิงโกไมอีลินดังกล่าวพบว่า 40 µ M ของสฟิงโกไมอีลินเพิ่มความแตกต่างประสาทของ hadscs . ในแง่ของ
ผลลัพธ์เหล่านี้พบว่าสฟิงโกไมอีลินถือเป็นธรรมชาติที่เกิดขึ้นสารอาหาร

ที่ ครอบครองการกระทำการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ .




[ ]

0203 ตัวอย่าง 3

ตัวอย่างอธิบายการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ของ hadscs โดย CDP - โคลีนเป็น

เทียบกับ DHA และ negative control .



[ 0204 ] CDP - โคลีนได้จากเคียววา คโคจีโอจำกัด - โคลีน CDP ละลาย 200 เมตรขายµปลอดเชื้อในการไหลแบบราบเรียบ ฮูด ให้สารละลายหุ้นที่ชัดเจน การเพาะเลี้ยงพาสเซจ hadscs , D , seeded และภายใต้ CDP - โคลีนผ่านขั้นตอนเดียวกันที่อธิบายไว้ในตัวอย่าง 1 .
[ 0205 ] การรักษาของ CDP - โคลีนทดสอบที่ความเข้มข้น 5 µ m และ 1 O µม.CDP - โคลีนในความเข้มข้นแตกต่างกันคือการทดสอบรายบุคคลและเมื่อเทียบกับการควบคุมบวก DHA ที่ 10 µ m ( รูป 4A ) , และควบคุมเชิงลบ ( รูป 48 ) ภายใต้กล้องจุลทรรศน์เฟสคอน 3 ชั่วโมง ตลอด 24 ชั่วโมง และ 48 ชั่วโมงหลังการรักษา การทดลองซ้ำ ทั้งสามใบ 0206 นอกจากนี้
[ ] ,CDP - โคลีนที่ความเข้มข้น 5 µ M แสดงผลเพื่อเพิ่มการสร้างเซลล์ประสาทใหม่เป็นสังเกตสำหรับการเปลี่ยนแปลงทางสัณฐานวิทยาและ neurite พบใน hadcss ปฏิบัติกับ CDP - โคลีน . เห็น รูป 4C หมายเหตุ ท่อหดนิวไรต์และเริ่มแพลม .โคโรลลาแสงสามารถสังเกตความแตกต่างด้วยการเซลล์เนื่องจากการหดตัวของเซลล์ร่างกายและเพิ่มการสะท้อนของแสงจากกล้องจุลทรรศน์ การเจริญเติบโต neurite อีกต่อไป 2 .
[ 0207 ] CDP - โคลีน 1 O µ M นอกจากนี้ด้วย DHA ที่ 1 O µ M จัดแสดงที่การสร้างเซลล์ประสาทใหม่ใน hadscs . เห็น รูป 40ที่สำคัญ hadscs รับการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ในการแสดงตนของการรวมกันของ CDP - โคลีนและ DHA
[ ] นอกจากนี้ลา CDP - โคลีนส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทใหม่มนุดสเต็มเซลล์ ( " hnscs " ) สายที่เปิดเผยในที่นี้เป็นวิธีการทดสอบการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ของ CDP - โคลีนบน hnscs และผลลัพธ์ที่ได้ 0209
[ ] สั้น hnscs ซื้อมาจากมิลลิ , bellerica , MA , สหรัฐอเมริกา , ที่มีการดัดแปรพันธุกรรม เพื่อ constitutively แสดงออกโปรตีนเรืองแสงสีเขียว ( GFP )การ hnscs เพาะเลี้ยงในจานเคลือบลามินินเป็นแนะนำโดยผู้ผลิต ทั้งสองและลามินิน deme / F12 ได้รับมิลลิ . ลามินิน เพื่อเจือจางด้วย dmem / 20 µ g / ml 10 มล. เจือจาง ลามินินสารละลายเพิ่มไป 10 จานเพาะเลี้ยงเนื้อเยื่อ แล้ววัฒนธรรมอาหารถูกบ่มใน 37 ° C , 5% C02 บ่มค้างคืน ก่อนใช้และลามินินสารละลายถูกลมและล้างอีกครั้งกับงาน dpbs สารละลาย . hnscs เพาะเลี้ยงใน rencell NSC การบำรุงรักษาอาหารเพาะเลี้ยง ( มิลลิ ) มาพร้อมกับ 20 ng / ml bfgf 20 ng / ml ( 1 ) ใน 37 ° C ,
5 % C02 ตู้ฟักไข่ อาหารเพาะเลี้ยงแลกเปลี่ยนกับสดอาหารเพาะเลี้ยงที่มี bfgf EGF

และทุก ๆ วัน หลังจากนั้น เซลล์ถึง 80% บรรจบ 2 ถึง 3 วัน หลังจากขั้นตอนนี้

[ 0210 ] หลังจาก hnscs ถึง 80% บรรจบ hnscs พร้อมสำหรับการทดลอง ก่อนเพาะ , 96 ดีจานสดเคลือบด้วย 20 µ g / ml ลามินินสารละลายตามด้วยบทสรุป dpbs ล้างตามที่อธิบายไว้ข้างต้นอาหารเพาะเลี้ยงวัฒนธรรมถูกลบออกอย่างระมัดระวัง และ hnscs เป็นทางใจภายในม. accutase ( มิลลิ ) ใน 37 ° C , 5% เอ C02 เป็นเวลา 3 นาที จากนั้น กของ rencell NSC การบำรุงรักษาอาหารเพาะเลี้ยง ( มิลลิ ) มาพร้อมกับ 20 ng / ml bfgf 20 ng / ml ( 1 ) ถูกเพิ่มเซลล์แขวนลอยถูกโอนเป็นหมัน 15ml กรวยหลอด และเซลล์ก็อัดเม็ด โดยปั่น 300 x G สำหรับ 5 นาทีที่ .
น่านถูกลบออก อาหารเพาะเลี้ยง 2ml ก็ใช้กับหลอด และ hnscs ถูก

resuspended อย่างละเอียด การ hnscs ถูก seeded ใน 96 ดีจานที่ความหนาแน่นของ 1x104

เซลล์ / มิลลิลิตร ( 1 , 000 เซลล์ / งั้น 100 µดี

/ )[ 0211 ] หลังแนบกับพื้นผิว วัฒนธรรม วัฒนธรรมอาหารเพาะเลี้ยงถูกสลับ serum-free ความแตกต่างอาหารเพาะเลี้ยงในการแสดงตนของ CDP - โคลีนหรือ DHA หรือการ การ serum-free ความแตกต่างอาหารเพาะเลี้ยงเตรียมสดก่อนเปลี่ยนรวม 40 ml dmem / F12 ( มิลลิ )400 µผม - กลูตามีนที่ความเข้มข้น 200 ( เทคโนโลยี , Carlsbad , CA ) , 400 µผมก็สารละลาย ( เทคโนโลยี , Carlsbad , CA ) และ 40 µผม heperin ( ซิกม่า Aldrich เซนต์ หลุยส์ มล. ) สารละลายความเข้มข้น 1 OMG / มล.
[ 0212 ] เซลล์คือ สังเกตการเปลี่ยนแปลงลักษณะทางสัณฐานวิทยาหลังจาก 72 ชั่วโมง ภายใต้กล้องจุลทรรศน์แบบฟลูออเรสเซนต์ .ทั้งหมด 96 ดีจานวางไว้ใต้กล้องจุลทรรศน์ Leica dml4000b เรืองแสง , ภาพที่ถูกถ่ายด้วยและ GFP กรองภายใต้กล้องจุลทรรศน์ ด้วยแสง UV .
[ 0213 ] CDP - โคลีน 4 µ M อย่างมากเมื่อเทียบกับการการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ไม่มี

รักษา ดูรูปจอฟ้า . hnscs สังเกตได้ลดขนาดร่างกายของเซลล์การ neurities และการพัฒนาเดนไดร ดูรูปแทนที่ ความยาวของ neurite ผลพลอยได้ในการปรากฏตัวของ CDP - โคลีนเปรียบกับ DHA ที่ 20 µ M ซึ่งแสดงผลที่ดีในการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ . ดูรูป 4G .
[ 0214 ] เพิ่มเติม CDP - โคลีนที่ 12.5 µ M synergizes กับสมองสารอาหารรวมถึง DHA ที่µ

5 M- ออกทาโนอิล - D - ธรีโอ - สฟิงโกซีนµ 0.1 M ยูริดีนที่ 20 µ M , โคเลสเทอรอล 25

µ M , เรสเวราทรอลที่ 8.8 µ M , และลูทีนที่ 0.3 µ M เพื่อช่วยส่งเสริมการสร้างเซลล์ประสาทใหม่ในลักษณะที่รวดเร็ว . การศึกษาลักษณะสัณฐานวิทยาการเปลี่ยนแปลงที่แสดงในรูป 4แสดงให้เห็นถึงการเปลี่ยนแปลงของลักษณะทางสัณฐานวิทยา hnscs หลังจากการรักษาด้วย CDP - โคลีนเหล่านี้อื่น ๆและสมองสารอาหาร . การเปลี่ยนแปลงลักษณะทางสัณฐานวิทยาเหล่านี้รวมถึงลักษณะของโกเดนโดรไซท์ความแตกต่างซึ่งแนะนำฟังก์ชัน
ไมอิลีนเนชั่น .