Growth experiments are typically un

Growth experiments are typically undertaken in liquid media, in part because measuring the optical density of a liquid culture is straightforward. However, liquid cultures present a number of problems in microgravity. Most organisms that passed our screening did not grow well under anaerobic conditions, and thus required some sort of gas exchange with the surrounding air. On the ground, aerobic conditions are easily created by incubating in open or loosely capped vessels. This is impractical and unsafe in microgravity; there is no “safe” orientation in which the liquid will remain in place. We explored several unsuccessful approaches to this problem. For example, we found that gas-permeable plate seals leak when inverted, and their adhesion failed completely after freezing. We also fabricated custom plates with seals made from hydrophobic polydimethylsiloxane (PDMS) with micron-diameter vent holes, but these also leaked when inverted.

We eventually concluded that the design requirements were mutually exclusive; either we could achieve containment for liquid cultures at the expense of aerobic conditions, or we could achieve aerobic conditions at the expense of liquid culture containment. We chose the latter, so our plates were prepared with solid media. Solid media is not traditionally used for OD measurements, and so our results need to be interpreted differently from OD in liquid culture. Using clear agar to maximize transparency, we programmed the plate reader to take OD measurements at nine different locations in each well, each of which was measured twenty five times per observation. The plates were inoculated in a manner intended to create many small colonies (see ‘Materials and Methods’). As these colonies grow, their edges intersect with reading points, and the OD for that point increases in a stepwise fashion. As the colony thickens, the OD gradually increases. OD in liquid media is thought to correspond to scattering of light by individual cells, whereas our measurements correspond to the number, diameter, and thickness of the colonies. The intervals elapsed between occultations of the reading points decrease exponentially, and so the average OD across each well behaves very similarly to traditional observations of log-phase growth in liquid media. However, in the absence of correlation with the gold standard of dilution plate counts, this should be considered as a relative measure of growth. This was validated by repeated growth experiments on Earth, showing normal growth kinetics of colonies grown with this method, a sample dataset is shown in Fig. S1. To our knowledge this is the first use of solid media to measure bacterial growth kinetics in this manner. The data from the different plate readers (Tecan and Molecular Dynamics) was compared at 96 h by plotting the OD600 values against each other. While the concordance was not perfect, there was a strong relationship between the two machines which provided validation of the data from both Molecular Dynamics machines (ground and space).

By this measure, the vast majority of the bacteria (45/48) behaved very similarly in space and on Earth (Table 1). Only three bacteria showed a significant difference in the two conditions; Bacillus safensis, Bacillus methylotrophicus, and Microbacterium oleivorans. As part of double checking these results, we performed Sanger sequencing of rRNA genes from the wells corresponding to each of these species of the space plates and ground plates. A few wells produced mixed Sanger sequence, suggesting the presence of more than one organism in the well. In addition, a couple of wells gave a clear identification of a contaminating organism. We therefore inferred that there had been some contamination of the B. methylotrophicus and M. oleivorans wells. Since the remaining 45 organisms were not tested for contamination, it is possible that some of those represent false negatives. The B. safensis wells were all clear of any signs of contamination.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ทดลองการเจริญเติบโตอยู่โดยทั่วไปดำเนินการในสื่อของเหลว ในส่วนเนื่องจากการวัดความหนาแน่นออปติคัลของวัฒนธรรมของเหลวตรงไปตรงมา อย่างไรก็ตาม วัฒนธรรมของเหลวอยู่จำนวนปัญหาใน microgravity สิ่งมีชีวิตส่วนใหญ่ที่ผ่านการคัดกรองของเราไม่ได้เติบโตได้ดีภายใต้สภาพปลอดออกซิเจน แล้วจึง จำเป็นต้องเรียงลำดับของการแลกเปลี่ยนก๊าซกับอากาศรอบ ๆ บนพื้นดิน สภาพแอโรบิกได้อย่างง่ายดายสร้าง โดย incubating ในเรือเปิด หรือต่อยอดหลวม ๆ นี่คือทำไม่ได้ และไม่ปลอดภัยใน microgravity มีแนวไม่ปลอดภัย"ซึ่งของเหลวจะยังคงเดิม เราสำรวจวิธีสำเร็จหลายปัญหานี้ ตัวอย่างเช่น เราพบว่า แมวน้ำซึมเข้าไปได้แก๊สจานรั่วไหลเมื่อคว่ำ และการยึดเกาะของพวกเขาล้มเหลวอย่างสมบูรณ์หลังจากแช่แข็ง เราประดิษฐ์เองแผ่นพร้อมซีลเครื่องทำจากฝ่ามือ polydimethylsiloxane (PDMS) กับไมครอนเส้นผ่าศูนย์กลางปล่องหลุม แต่เหล่านี้ยัง รั่วเมื่อคว่ำยังWe eventually concluded that the design requirements were mutually exclusive; either we could achieve containment for liquid cultures at the expense of aerobic conditions, or we could achieve aerobic conditions at the expense of liquid culture containment. We chose the latter, so our plates were prepared with solid media. Solid media is not traditionally used for OD measurements, and so our results need to be interpreted differently from OD in liquid culture. Using clear agar to maximize transparency, we programmed the plate reader to take OD measurements at nine different locations in each well, each of which was measured twenty five times per observation. The plates were inoculated in a manner intended to create many small colonies (see ‘Materials and Methods’). As these colonies grow, their edges intersect with reading points, and the OD for that point increases in a stepwise fashion. As the colony thickens, the OD gradually increases. OD in liquid media is thought to correspond to scattering of light by individual cells, whereas our measurements correspond to the number, diameter, and thickness of the colonies. The intervals elapsed between occultations of the reading points decrease exponentially, and so the average OD across each well behaves very similarly to traditional observations of log-phase growth in liquid media. However, in the absence of correlation with the gold standard of dilution plate counts, this should be considered as a relative measure of growth. This was validated by repeated growth experiments on Earth, showing normal growth kinetics of colonies grown with this method, a sample dataset is shown in Fig. S1. To our knowledge this is the first use of solid media to measure bacterial growth kinetics in this manner. The data from the different plate readers (Tecan and Molecular Dynamics) was compared at 96 h by plotting the OD600 values against each other. While the concordance was not perfect, there was a strong relationship between the two machines which provided validation of the data from both Molecular Dynamics machines (ground and space).By this measure, the vast majority of the bacteria (45/48) behaved very similarly in space and on Earth (Table 1). Only three bacteria showed a significant difference in the two conditions; Bacillus safensis, Bacillus methylotrophicus, and Microbacterium oleivorans. As part of double checking these results, we performed Sanger sequencing of rRNA genes from the wells corresponding to each of these species of the space plates and ground plates. A few wells produced mixed Sanger sequence, suggesting the presence of more than one organism in the well. In addition, a couple of wells gave a clear identification of a contaminating organism. We therefore inferred that there had been some contamination of the B. methylotrophicus and M. oleivorans wells. Since the remaining 45 organisms were not tested for contamination, it is possible that some of those represent false negatives. The B. safensis wells were all clear of any signs of contamination.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การทดลองการเจริญเติบโตจะดำเนินการโดยทั่วไปในสื่อที่มีสภาพคล่องส่วนหนึ่งเป็นเพราะการวัดความหนาแน่นของแสงของวัฒนธรรมที่เป็นของเหลวตรงไปตรงมา อย่างไรก็ตามวัฒนธรรมของเหลวนำเสนอจำนวนของปัญหาในสภาวะไร้น้ำหนัก ชีวิตส่วนใหญ่ที่ผ่านการคัดกรองของเราไม่ได้เจริญเติบโตได้ดีภายใต้สภาวะไร้ออกซิเจนและทำให้ต้องเรียงลำดับของการแลกเปลี่ยนก๊าซกับอากาศโดยรอบบาง บนพื้นดินเงื่อนไขแอโรบิกที่ถูกสร้างขึ้นได้อย่างง่ายดายโดยการบ่มในภาชนะเปิดหรือต่อยอดคับ นี้จะทำไม่ได้และไม่ปลอดภัยในสภาวะไร้น้ำหนัก; ไม่มีการวางแนวทาง "ปลอดภัย" ในที่ที่มีสภาพคล่องจะยังคงอยู่ในสถานที่ เราสำรวจวิธีการประสบความสำเร็จในหลาย ๆ ปัญหานี้ ตัวอย่างเช่นเราพบว่าก๊าซซึมเข้าไปแมวน้ำแผ่นรั่วไหลเมื่อคว่ำและการยึดเกาะของพวกเขาล้มเหลวอย่างสมบูรณ์หลังจากการแช่แข็ง นอกจากนี้เรายังประดิษฐ์แผ่นที่กำหนดเองกับแมวน้ำทำจาก polydimethylsiloxane ชอบน้ำ (PDMS) กับไมครอนเส้นผ่าศูนย์กลางระบายหลุม แต่เหล่านี้รั่วไหลออกมาเมื่อคว่ำ

ในที่สุดเราสรุปได้ว่าความต้องการการออกแบบเป็นพิเศษร่วมกัน; ทั้งที่เราสามารถบรรลุบรรจุของเหลววัฒนธรรมที่ค่าใช้จ่ายของเงื่อนไขแอโรบิกหรือเราสามารถบรรลุเงื่อนไขแอโรบิกที่ค่าใช้จ่ายของการบรรจุของเหลววัฒนธรรม เราเลือกอย่างหลังเพื่อให้แผ่นของเราได้จัดทำกับสื่อที่เป็นของแข็ง สื่อที่เป็นของแข็งไม่ได้ใช้แบบดั้งเดิมสำหรับการตรวจวัด OD และเพื่อให้ผลของเราจะต้องมีการตีความที่แตกต่างจาก OD ในวัฒนธรรมของของเหลว ใช้วุ้นที่ชัดเจนเพื่อเพิ่มความโปร่งใสเราโปรแกรมอ่านแผ่นที่จะใช้วัด OD ที่เก้าสถานที่ที่แตกต่างกันในแต่ละดีซึ่งแต่ละวัดหมื่นห้าครั้งต่อการสังเกต แผ่นถูกเชื้อในลักษณะที่ตั้งใจจะสร้างอาณานิคมขนาดเล็กจำนวนมาก (ดู 'วัสดุและวิธีการ) ในฐานะที่เป็นอาณานิคมเหล่านี้เติบโตขอบของพวกเขาตัดกับจุดที่อ่านและ OD สำหรับจุดที่เพิ่มขึ้นในแฟชั่นแบบขั้นตอน ในฐานะที่เป็นอาณานิคมข้นที่ OD ค่อยๆเพิ่มขึ้น OD ของเหลวในสื่อเป็นความคิดที่สอดคล้องกับการกระเจิงของแสงโดยแต่ละเซลล์ในขณะที่การวัดของเราสอดคล้องกับจำนวนเส้นผ่าศูนย์กลางและความหนาของอาณานิคม ช่วงเวลาที่ผ่านไประหว่างปรากฏการณ์ของจุดการอ่านลดชี้แจงและเพื่อ OD เฉลี่ยทั่วแต่ละดีมากมีลักษณะการทำงานคล้าย ๆ กับการสังเกตแบบดั้งเดิมของการเจริญเติบโตเข้าสู่ระบบเฟสของเหลวในสื่อ อย่างไรก็ตามในกรณีที่ไม่มีความสัมพันธ์กับมาตรฐานทองคำนับจานเจือจางนี้ควรได้รับการพิจารณาเป็นมาตรการญาติของการเจริญเติบโต นี้ได้รับการตรวจสอบโดยการทดลองซ้ำเจริญเติบโตบนโลกแสดงจลนพลศาสตร์เจริญเติบโตตามปกติของอาณานิคมที่ปลูกด้วยวิธีนี้เป็นชุดตัวอย่างที่แสดงในรูป S1 เพื่อความรู้ของเรานี้เป็นครั้งแรกที่ใช้สื่อที่มั่นคงในการวัดการเจริญเติบโตของแบคทีเรียจลนศาสตร์ในลักษณะนี้ ข้อมูลที่ได้จากผู้อ่านแผ่นที่แตกต่างกัน (Tecan และอณู Dynamics) เมื่อเทียบที่ 96 ชั่วโมงโดยการวางแผนค่า OD600 กับแต่ละอื่น ๆ ในขณะที่ความสอดคล้องที่ไม่ได้สมบูรณ์แบบมีความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งระหว่างสองเครื่องซึ่งให้การตรวจสอบข้อมูลจากเครื่องทั้งสองกลศาสตร์โมเลกุล (พื้นดินและพื้นที่)

โดยวัดนี้ส่วนใหญ่ของเชื้อแบคทีเรีย (45/48) ประพฤติมากในทำนองเดียวกันในพื้นที่และบนโลก (ตารางที่ 1) เพียงสามแบคทีเรียที่แสดงให้เห็นความแตกต่างอย่างมีนัยสำคัญในช่วงสองเงื่อนไข safensis Bacillus, Bacillus methylotrophicus และ oleivorans Microbacterium ในฐานะที่เป็นส่วนหนึ่งของการตรวจสอบคู่ผลเหล่านี้เราดำเนินการลำดับแซงเจอร์ของยีน rRNA จากบ่อที่สอดคล้องกับแต่ละสายพันธุ์เหล่านี้ของแผ่นพื้นที่และแผ่นพื้น ไม่กี่หลุมผลิตลำดับแซงเจอร์ผสมซึ่งแสดงว่ามากกว่าหนึ่งในสิ่งมีชีวิตที่ดี นอกจากนี้ยังมีคู่ของหลุมให้ระบุชัดเจนของสิ่งมีชีวิตที่ปนเปื้อน ดังนั้นเราจึงสรุปได้ว่ามีการปนเปื้อนของบีเอ็ม methylotrophicus และ oleivorans หลุมบาง ตั้งแต่ส่วนที่เหลืออีก 45 ชีวิตที่ไม่ได้ผ่านการทดสอบการปนเปื้อนก็เป็นไปได้ว่าบางส่วนของผู้แทนปลอมเนกาทีฟ บี safensis หลุมทุกคนที่ชัดเจนของสัญญาณของการปนเปื้อนใด ๆ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การทดลองการเจริญเติบโตมักจะดำเนินการในอาหารเหลว , ส่วนหนึ่งเป็นเพราะการวัดความหนาแน่นของแสงของอาหารเหลวคือตรงไปตรงมา อย่างไรก็ตาม วัฒนธรรม ของเหลว ปัจจุบันตัวเลขของปัญหาในน้ำหนัก . ส่วนใหญ่ของสิ่งมีชีวิตที่ผ่านการคัดกรองของเราไม่ได้เจริญเติบโตได้ดีภายใต้สภาวะไร้อากาศ และดังนั้นจึง ต้องบางประเภทของการแลกเปลี่ยนก๊าซกับอากาศโดยรอบ บนพื้นดิน , เงื่อนไขแอโรบิกจะถูกสร้างขึ้นได้อย่างง่ายดาย โดยการแช่ในเปิดหรือหลวม ๆปกคลุมเรือ นี้ไม่ได้ และไม่ปลอดภัยในน้ำหนัก ไม่มี " เซฟ " ปฐมนิเทศที่ของเหลวจะยังคงอยู่ในสถานที่ เราสำรวจหลายวิธีไม่ประสบความสำเร็จกับปัญหานี้ ตัวอย่างเช่น , เราพบว่าก๊าซซึมผ่านแผ่นซีลรั่ว เมื่อคว่ำ และการยึดเกาะของพวกเขาล้มเหลวอย่างสมบูรณ์หลังจากการแช่แข็ง เรายังประดิษฐ์จานเองด้วยตราประทับทำจาก ) O ( PDMS ) กับไมครอนขนาดเส้นผ่านศูนย์กลางท่อ หลุม แต่เหล่านี้ยังรั่วไหลเมื่อกลับด้านสุดท้ายเราก็สรุปได้ว่า ความต้องการในการออกแบบเป็นพิเศษร่วมกัน ; ให้เราสามารถบรรลุการควบคุมของวัฒนธรรมที่เป็นของเหลวที่ค่าใช้จ่ายของเงื่อนไขแอโรบิก หรือเราสามารถบรรลุเงื่อนไขแอโรบิกที่ค่าใช้จ่ายในการบรรจุอาหารเหลว . เราเลือกอย่างหลัง ดังนั้นแผ่นของเราเตรียมรับมือกับสื่อที่เป็นของแข็ง สื่อที่เป็นของแข็งไม่ใช้แบบดั้งเดิมสำหรับการวัด OD และดังนั้นผลลัพธ์ของเราต้องมีการตีความแตกต่างกันจาก OD ในวัฒนธรรมของของเหลว ใช้ล้างวุ้นเพื่อเพิ่มความโปร่งใส เราโปรแกรมแผ่นอ่านเพื่อการวัด OD 9 สถานที่ที่แตกต่างกันในแต่ละดี ซึ่งแต่ละวัดยี่สิบห้าครั้งต่อการสังเกต แผ่นปลูกเชื้อในลักษณะวัตถุประสงค์เพื่อสร้างโคโลนีขนาดเล็กมาก ( เห็น ' วิธีการ ' ) เป็นอาณานิคมเหล่านี้เติบโต ตัดกับขอบของคะแนนการอ่านและ OD ที่จุด เพิ่มขึ้นในแฟชั่นคน เป็นอาณานิคมข้น , OD ค่อยๆเพิ่มขึ้น OD ในอาหารเหลวที่เป็นความคิดที่สอดคล้องกับการกระจายของแสง โดยเซลล์แต่ละเซลล์ในขณะที่การวัดของเราสอดคล้องกับขนาดเส้นผ่าศูนย์กลางและความหนาของอาณานิคม ช่วงเวลาที่ผ่านไประหว่างที่ occultations ของการอ่านจุด ลดลงเป็นจำนวนมาก และเพื่อให้มี OD ในแต่ละดีทำตัวมากในทํานองเดียวกันกับการสังเกตแบบบันทึกระยะการเจริญเติบโตในสื่อที่เป็นของเหลว อย่างไรก็ตาม ในกรณีที่ไม่มีความสัมพันธ์กับมาตรฐานทองของการนับจานเจือจางนี้ควรจะถือว่าเป็นมาตรการญาติเจริญ นี้คือการตรวจสอบโดยการทำซ้ำการทดลองบนโลกแสดงจลนศาสตร์การเจริญเติบโตตามปกติของอาณานิคมที่ปลูกด้วยวิธีนี้ ตัวอย่างข้อมูลที่แสดงในรูปที่ S1 . ความรู้ของเรา นี้เป็นครั้งแรกที่ใช้สื่อที่เป็นของแข็งวัดจลนศาสตร์การเจริญเติบโตของแบคทีเรีย ในลักษณะนี้ ข้อมูลจากผู้อ่านที่แตกต่างกัน ( และจาน TECAN พลศาสตร์โมเลกุล ) เทียบ 96 ชั่วโมง โดยจะ od600 คุณค่ากับแต่ละอื่น ๆ ในขณะที่ความสอดคล้อง ไม่สมบูรณ์ มีความสัมพันธ์ที่แข็งแกร่งระหว่างสองเครื่องซึ่งให้ความถูกต้องของข้อมูลจากทั้งพลศาสตร์โมเลกุลเครื่องจักร ( พื้นดินและพื้นที่ )โดยวัดนี้ ส่วนใหญ่ของแบคทีเรีย ( 45 / 48 ) มีพฤติกรรมเดียวกันในพื้นที่และบนดิน ( ตารางที่ 1 ) เพียงสามแบคทีเรียพบว่ามีความแตกต่างกันใน 2 เงื่อนไข safensis เชื้อ Bacillus methylotrophicus และ microbacterium oleivorans . เป็นส่วนหนึ่งของการตรวจสอบคู่ผลลัพธ์เหล่านี้ เราก็แสดงลำดับของแซงเกอร์ rRNA ยีนจากบ่อน้ำที่สอดคล้องกับแต่ละ ของเหล่านี้ ชนิด ของ พื้นที่ แผ่น และแผ่นพื้น ไม่กี่หลุมผลิต ผสม แซงเจอร์ลำดับว่า การปรากฏตัวของสิ่งมีชีวิตมากกว่าหนึ่งในดี นอกจากนี้ คู่ของ เวลส์ ให้รหัสที่ชัดเจนของการปนเปื้อนสิ่งมีชีวิต . ดังนั้นเราจึงบอกได้ว่า มีการปนเปื้อนของ พ. methylotrophicus และ oleivorans เวลส์ เนื่องจากเหลือ 45 สิ่งมีชีวิตไม่ได้ทดสอบการปนเปื้อน , มันเป็นไปได้ว่าบางส่วนของผู้ที่เป็นตัวแทนเชิงลบเท็จ B . safensis Wells ทั้งหมดที่ชัดเจนของสัญญาณใด ๆของการปนเปื้อน