2.7. Pulsed-field gel electrophores

2.7. Pulsed-field gel electrophoresis (PFGE)
The isolate fingerprints generated in this study were
based on PFGE separation of XbaI-digested genomic
DNA as described previously (Khan et al., 2002).
Digested DNA fragments were resolved in a 1% agarose
gel in 0.5X TBE buffer, using a contour-clamped
homogeneous electric field apparatus (CHEF-DR II,
Bio-Rad Laboratories). Electrophoresis was performed
at 6 V/cm with a 2.2–63.8 s linear ramp time for 18 h.
The Midrange PFGE marker I (BioLabs) was used. Gels
were stained with ethidium bromide and destained with
distilled water. Banding patterns were visualized in UV
and photographed.
3. Results and discussion
From the 500 food samples analysed, most of them
were negative in the microbiological test, some of them
were positive for other lactose fermenting or nonfermenting
micro-organisms and 48 of them were E.
coli positive. Forty-nine strains of E. coli were isolated
from 48 samples from soft cheese, cottage cheese, salads
with cream or mayonnaise, food with sauces, and
sandwiches. These isolates were assayed with four
multiplex PCRs to detect the presence of 10 virulence
genes. The following combinations of primers gave
adequate amplification of the respective target genes:
Stx 1, Stx 2, Stx 2e and eae A; CNF 1; CNF 2 and Einv;
and LT I, ST I and ST II. The amplified products were
analysed by agarose gel electrophoresis and 10 out of 49
isolates were positive for Stx 1and Stx2 genes (Table 1).
PCR primers in the set stx1, stx2, stx2e and eaeA amplified fragments of DNA of the predicted size for
stx1 and stx2 (Pradel et al., 2001). The two observed
PCR products elucidate the presence of both Shiga toxin
genes in the isolates, but the absence of eaeA and stx2e
genes. The other three sets of primers assayed, revealed
negative results (Table 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.7 การฟิลด์ Pulsed เจ electrophoresis (PFGE)ลายนิ้วมือแยกที่สร้างขึ้นในการศึกษานี้ได้ตาม PFGE แบ่งแยกย่อย XbaI genomicดีเอ็นเอตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (Khan et al., 2002)ชิ้นส่วนดีเอ็นเอที่ต้องได้รับการแก้ไขใน agarose 1%เจในบัฟเฟอร์ X TBE 0.5 ใช้ contour clampedสนามไฟฟ้าเหมือนเครื่อง (DR เชฟ IIห้องปฏิบัติการ Bio-Rad) ทำ electrophoresisที่ 6 V/cm มี 2.2 – 63.8 s ลาดเชิงเส้นเวลา 18 hเครื่องหมาย PFGE เป่า (BioLabs) ถูกใช้ เจสีกับโบรไมด์ ethidium และ destained ด้วยน้ำกลั่น รูปแถบมี visualized ใน UVและถ่ายภาพ3. ผลลัพธ์ และสนทนาจาก 500 อาหารตัวอย่าง analysed ส่วนใหญ่ของพวกเขาถูกลบในการทดสอบทางจุลชีววิทยา บางส่วนของพวกเขามีค่าบวกสำหรับย่อยแลคโตสอื่น ๆ fermenting หรือ nonfermentingไมโครสิ่งมีชีวิตและ 48 ของอีcoli บวก สายพันธุ์สี่สิบเก้าของ E. coli ที่แยกจากตัวอย่างที่ 48 จากนุ่มชีส เนยแข็งคอทเทจ สลัดครีม หรือมายองเนส ซอส อาหาร และแซนวิช แยกเหล่านี้ถูก assayed กับสี่PCRs multiplex เพื่อตรวจหา 10 virulenceยีน ชุดต่อไปนี้ของไพรเมอร์ให้ขยายพอของยีนเป้าหมายที่เกี่ยวข้อง:Stx 1, Stx 2, Stx 2e และ eae A CNF 1 CNF 2 และ Einvและ LT ฉัน เซนต์เซนต์ดาว ผลิตภัณฑ์เอาต์analysed electrophoresis เจ agarose และ 10 จาก 49แยกได้ค่าบวกสำหรับยีน Stx2 1and Stx (ตาราง 1)ไพรเมอร์ PCR ในการตั้งค่า stx1, stx2, stx2e และ eaeA ขยายชิ้นส่วนของดีเอ็นเอขนาดคาดการณ์สำหรับstx1 และ stx2 (Pradel และ al., 2001) 2 การสังเกตผลิตภัณฑ์ PCR elucidate ของพิษทั้งชิงะยีนในการแยก การขาดงานของ eaeA และ stx2eยีน อื่น ๆ สามชุดของไพรเมอร์ assayed เปิดเผยผลเชิงลบ (ตารางที่ 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.7 ข่าวคราวชีพจรสนาม (PFGE)
แยกลายนิ้วมือที่เกิดขึ้นในการศึกษาครั้งนี้ได้รับการขึ้นอยู่กับการแยก PFGE ของจีโนม XbaI ย่อยดีเอ็นเอตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Khan et al., 2002). ย่อยดีเอ็นเอได้รับการแก้ไขใน 1% agarose เจลใน บัฟเฟอร์ TBE 0.5 เท่าโดยใช้เส้น-จับยึดอุปกรณ์สนามไฟฟ้าเป็นเนื้อเดียวกัน(CHEF DR-II, Bio-Rad ห้องปฏิบัติการ) electrophoresis ได้ดำเนินการใน6 V / ซม. กับเวลาที่ลาดเชิงเส้น 2.2-63.8 s 18 ชม. เครื่องหมาย Midrange PFGE ฉัน (BioLabs) ถูกนำมาใช้ เจลที่ถูกย้อมด้วย ethidium bromide และ destained กับน้ำกลั่น รูปแบบแถบถูกมองเห็นในยูวีและถ่ายภาพ. 3 ผลการทดลองและการอภิปรายจาก 500 ตัวอย่างอาหารวิเคราะห์ส่วนใหญ่เป็นลบในการทดสอบทางจุลชีววิทยาบางส่วนของพวกเขาอยู่ในเชิงบวกสำหรับหมักแลคโตสหรือnonfermenting จุลินทรีย์และ 48 ของพวกเขาถูกอีโคไลในเชิงบวก สี่สิบเก้าสายพันธุ์ของเชื้อ E. coli ที่แยกได้จาก48 ตัวอย่างจากชีสนุ่มชีสกระท่อมสลัดด้วยครีมหรือมายองเนสซอสปรุงรสอาหารที่มีและแซนวิช สายพันธุ์เหล่านี้ถูก assayed กับสี่PCRs multiplex เพื่อตรวจสอบสถานะของความรุนแรง 10 ยีน ชุดต่อไปของไพรเมอร์ให้ใช้เครื่องขยายเสียงที่เพียงพอของยีนเป้าหมายที่เกี่ยวข้อง: Stx 1, Stx 2 2e Stx และ EAE; CNF 1; CNF ที่ 2 และ Einv; และ LT ผม ST I และ II ST ผลิตภัณฑ์ขยายได้รับการวิเคราะห์โดยข่าวคราว agarose และ 10 จาก 49 สายพันธุ์เป็นบวกสำหรับ Stx 1 และยีน Stx2 (ตารางที่ 1). ไพรเมอร์ PCR ใน stx1 ชุด Stx2, stx2e และ eaeA ชิ้นส่วนขยายของดีเอ็นเอที่มีขนาดที่คาดการณ์สำหรับstx1 และ Stx2 (Pradel et al., 2001) ทั้งสองสังเกตผลิตภัณฑ์ PCR อธิบายการปรากฏตัวของทั้งสอง Shiga พิษยีนในสายพันธุ์แต่กรณีที่ไม่มี eaeA และ stx2e ยีน อีกสามชุดไพรเมอร์ assayed เปิดเผยผลลบ(ตารางที่ 1)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.7 . พัลฟิลด์ gel electrophoresis ( PFGE )
แยกลายนิ้วมือที่สร้างขึ้นในการวิจัย
ตาม PFGE แยก xbai ย่อยดีเอ็นเอจีโนม
ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( ข่าน et al . , 2002 ) .
ย่อยชิ้นส่วนดีเอ็นเอถูกแก้ไขใน 1% (
เจล ( ทีบี บัฟเฟอร์ ที่ใช้เส้นบีบ
เอกไฟฟ้า เครื่องมือภาคสนาม ( chef-dr II
ชีวภาพราดห้องปฏิบัติการ )วิธีทํา
6 ซม. v / กับ 2.2 เท่าของเส้นตรงและทางลาดเป็นเวลา 18 ชั่วโมง
กลาง PFGE เครื่องหมาย ( biolabs ) คือใช้ เจล
ถูกย้อมด้วยสีคู่ด้วย
destained โบรไมด์และน้ำกลั่น แถบตรวจแบบและถ่ายภาพในแสงยูวี
.
3 ผลและการอภิปราย
จาก 500 อาหารตัวอย่างวิเคราะห์ , ที่สุดของพวกเขา
เป็นลบในการทดสอบทางจุลชีววิทยา , บางส่วนของพวกเขา
บวกๆ แลคโตส หมัก หรือ nonfermenting
จุลินทรีย์และ 48 ของพวกเขา E .
( บวก สี่สิบเก้าสายพันธุ์ของเชื้อ E . coli ที่แยกได้จากตัวอย่างจาก
48 ชีสนุ่ม คอทเทจชีส สลัด
ด้วยครีมหรือมายองเนส อาหารกับซอสและ
แซนด์วิช เหล่านี้ปริมาณไอโซเลทที่มีสี่
เพี้ยง pcrs ตรวจสอบการแสดงตนของ 10 ยีนโรค

ต่อไปนี้ชุดของไพรเมอร์ให้
( เพียงพอของยีนเป้าหมายที่เกี่ยวข้อง :
แบบ 1 แบบ 2 , 2 และ ยังรวม CNF ; 1 ; CNF 2 และ einv ;
กับมันฉันเซนต์และเซนต์ 2 การขยายผลิตภัณฑ์
วิเคราะห์ด้วยเจลอิเลคโตรโฟรีซีสและ 10 จาก 49
ไอโซเลตเป็นบวกสำหรับ STX และ stx2 ยีน ( ตารางที่ 1 ) .
วิธี PCR ในชุด stx1 stx2 , ,stx2e eaea และชิ้นส่วนของดีเอ็นเอของคาดการณ์และขนาด
stx1 stx2 ( pradel et al . , 2001 ) สองสังเกต
PCR ผลิตภัณฑ์อธิบายการปรากฏตัวของทั้งสารพิษชิกา
ยีนในสายพันธุ์ แต่ขาด eaea และ stx2e
ยีน อีกสามชุดไพรเมอร์ assayed เปิดเผย
ลบผลลัพธ์ ( ตารางที่ 1 )