at day 3 from the start of the การเ

at day 3 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ, 3 µM CHIR99021 was added, 10 µM SU-5402 was added, 3 µM CHIR99021 and 10 µM 20 SU-5402 were simultaneously added, 1 nM recombinant human BMP4 protein was added, or 50 ng/ml recombinant human แอคทิวิน was added, and the การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ was continued. Similar culture was performed under conditions free of the addition of the aforementioned substances. The อาหาร was exchanged every 3 25 days, and the level of epithelial formation was observed under a microscope at day 40 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย. When 3 µM CHIR99021 was added at day 24 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย (Fig. SB), the cells เปลี่ยนแปลงพัฒนาd into darker เรเร as compared to the 30 control free of the addition (Fig. SA). By simultaneous addition of 3 µM CHIR99021 and 10 µM SU-5402 (Fig. SD), pigment epithelium colored darker than by a single addition of 3 µM CHIR99021 (Fig. SB) was obtained. When 1 nM recombinant human BMP4 protein was added (Fig. SE), or 50 ng/ml recombinant human 35 acti vin was added (Fig. SF) , more uniform epithelium was obtained as compared to the control free of the addition (Fig. 5A).

[0077] Example 6: Production of retinal pigment epithelial cell sheet 5 using human ES cells โกร๊ตธ์แฟคเตอร์ Reduced Matrigel™ (diluted 30-fold), or Synthemax™ (Corning Incorporated) (diluted 40-fold) was added by 100 µleach to the wells of a 65 mm Boyden chamber (Transwell, Corning Incorporated). The above-mentioned chamber 10 added with Matrigel was incubated at 4°C for 24 hr, and the above-mentioned chamber added with Synthemax™ was incubated at room temperature for 2 hr, whereby a coating treatment of the culture vessel materials was performed. A single cell suspension was prepared from the กลุ่มก้อนs at day 21 from the 15 start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย by the method described in Example 4, the suspended cells were seeded in a อาหารที่ปราศจากซีรัม (200 µl), which was a 1:1 mixture of DMEM/F-12 อาหาร and Neurobasal อาหาร added with 10% KSR, 1/2 N2 supplement, 1/2 B27 supplement, 20 µM Y27632 at 2x105 cells per well, a 20 อาหาร (1 ml) having the same composition was also added to a lower well, and การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ was performed at 37°C, 5% C02• Adhesion and epithelium formation of the cells were observed at day 5 from the seeding to a Boyden chamber. In a culture. vessel material coated with Synthemax™ (Fig. 25 6B), cultured cells derived from the กลุ่มก้อนs adhered, in the same manner as in a culture vessel material coated with Matrigel, which is a เมมเบรนชั้นฐาน preparation (Fig. 6A), and a retinal pigment epithelial-like form โดยที่ cells are closely adhered to each other, was observed. 30 [0078] Example 7: Production Example of retinal pigment epithelial cell using induced พีพีs (iPS cells) Human iPS cell line 201B7 (available from RIKEN BioResource center or iPS Academia Japan Inc.) is cultivated 35 according to the methods described in ~ueno, M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" and ~watanabe, K. et al. Nat Biotech 2007, 25, 68l-686u. As the อาหาร, a อาหาร obtained by adding 20% KSR (Knockout™ สิ่งทดแทนซีรัม; Invitrogen), 0.1 mM 2- เมอร์แคปโตเอธานอล, 2 ml:v1 L-glutamine, lx non-essential amino acid, s 5 ng/ml bFGF to DMEM/F12 อาหาร (Sigma) is used. The cultured iPS cells are dispersed into single cells using TrypLE Express (Invitrogen), suspended in 100 µl of a อาหารที่ปราศจากซีรัม at 1.2xl04 cells per one well of a non-cell adhesive 96 well culture plate (sumilon spheroid plates, SUMITOMO BAKELITE Co., 10 Ltd.) to allow for rapid formation of กลุ่มก้อนs and subjected to การเพาะเลี้ยงแบบลอย at 37°C, 5% C02• As the อาหารที่ปราศจากซีรัม therefor, a อาหารที่ปราศจากซีรัม obtained by adding 10% KSR, 450 µM 1-monothioglycerol, lx Chemically defined ไลปิด concentrate, 20 µM Y27632 to a 1:1 mixture of F-12 อาหาร and IMDM อาหาร is 15 used. At day 3 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, BMP4 is added at a final concentration of 1.5 nM, and the การเพาะเลี้ยงแบบลอย is continued. A half amount of the culture อาหาร in the well is exchanged every 3 days with the above-mentioned อาหาร not supplemented with any substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the BMP 20 วิถีการส่งสัญญาณ. At day 18 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, the กลุ่มก้อนs are transferred to a serum• free อาหาร, which was DMEM/F-12 อาหาร containing 3 µM CHIR99021 and added with lx N2 supplement, and cultured until day 21 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย. At day 21 from 25 the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, the กลุ่มก้อนs are disrupted by injecting and ejecting the solution by a micropipette, and the resulting cells are subjected to การเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ in a อาหารที่ปราศจากซีรัม, which is DMEM/F-12 อาหาร containing 3 µM CHIR99021 (a substance ที่ออกฤทธิ์ต่อ the วิถีสัญญาณ Wnt) and 30 added with lx N2 supplement, at 37°C, 5% C02• At day 27 from the start of the การเพาะเลี้ยงแบบลอย, cell form is observed under a microscope and expression of retinal pigment epithelial marker

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ในวันที่ 3 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ 3 ไมโครเมตร CHIR99021 เพิ่ม 10 µM SU-5402 ถูก 3 ไมโครเมตร CHIR99021 และ 10 µM 20 SU-5402 ได้พร้อมกันเพิ่ม เพิ่ม 1 nM recombinant มนุษย์ BMP4 โปรตีน หรือ ng/ml 50 แอคทิวินมนุษย์ recombinant ถูกเพิ่ม และการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะมีอย่างต่อเนื่อง วัฒนธรรมคล้ายกันได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขฟรีนอกจากนี้สารดังกล่าว อาหารถูกแลกเปลี่ยนทุกวัน 3 25 และระดับของการสร้างเยื่อบุผิวพบว่า ภายใต้กล้องจุลทรรศน์วัน 40 จากการเพาะเลี้ยงแบบลอยการ เมื่อ 3 ไมโครเมตร CHIR99021 เพิ่มที่ 24 วันจากการเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย (มะเดื่อ SB), เปลี่ยนแปลงพัฒนาd เซลล์ลงในเรเรเข้มเป็นเมื่อเทียบกับตัวควบคุม 30 ฟรีนอกเหนือจาก (มะเดื่อ SA) โดยนอกจากนี้พร้อมกันของ 3 ไมโครเมตร CHIR99021 10 µM และ SU-5402 (มะเดื่อ SD), เยื่อบุผิวเม็ดสีสีที่เข้มกว่า โดยนอกจากนี้ที่เดียวที่ 3 ไมโครเมตร CHIR99021 (มะเดื่อ SB) ได้รับ เมื่อ 1 nM recombinant มนุษย์ BMP4 โปรตีนเพิ่ม (มะเดื่อ SE), หรือ 50 ng/ml acti recombinant มนุษย์ 35 วินถูกเพิ่ม (มะเดื่อ SF), เยื่อบุผิวสม่ำเสมอมากขึ้นได้รับเมื่อเทียบกับควบคุมฟรีนอกเหนือจาก (รูป 5A) [0077] ตัวอย่างที่ 6: การผลิตแผ่นเยื่อบุผิวเซลล์เม็ดสีที่จอประสาทตา 5 ใช้มนุษย์ ES เซลล์โกร๊ตธ์แฟคเตอร์ (ปรับลด 30-fold Reduced Matrigel™ หรือ Synthemax™ (Corning Incorporated) ปรับลด 40-fold) ถูก โดย 100 µleach ของ 65 มม. Boyden หอ (Corning Transwell, Incorporated) ห้องดังกล่าว 10 เพิ่ม Matrigel incubated ที่ 4° C 24 ชั่วโมง และห้องดังกล่าวเพิ่ม Synthemax™ incubated ที่อุณหภูมิห้อง 2 ชั่วโมง โดยทำการเคลือบรักษาวัฒนธรรมเรือวัสดุ ระงับเซลล์เซลล์เดียวถูกเตรียมจาก กลุ่มก้อนs ที่วันที่ 21 ที่เริ่มการเพาะเลี้ยงแบบลอย 15 วิธีที่อธิบายไว้ในตัวอย่าง 4 ระงับเซลล์ถูกเตรียมในอาหารที่ปราศจากซีรัม (200 µl), ซึ่งเป็นส่วนผสม 1:1 ของ DMEM/F-12 อาหารและ Neurobasal อาหารเพิ่ม 10% KSR อาหารเสริมของ N2 1/2, 1/2 B27 เสริม 20 µM Y27632 ที่ 2 x 105 เซลล์ต่อ อาหาร 20 (1 ml) มีองค์ประกอบเดียวกันถูกเพิ่มไปล่างที่ดี และการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะทำที่ 37° C, 5% ก่อตัวยึดเกาะ C02• และเยื่อบุผิวของเซลล์ถูกตั้งข้อสังเกตในวันที่ 5 จากการเพาะห้อง Boyden เพื่อ วัฒนธรรม ภาชนะวัสดุที่เคลือบ ด้วย Synthemax™ (25 รูป 6B), เซลล์อ่างมาจาก กลุ่มก้อนs การปฏิบัติ ตาม ในลักษณะเดียวกันเช่นในวัฒนธรรมเรือวัสดุเคลือบ ด้วย Matrigel ซึ่งเป็นการเตรียมเมมเบรนชั้นฐาน (รูปที่ 6A), และปฏิบัติตามอย่างใกล้ชิดกันเป็นเซลล์โดยที่เยื่อบุผิวแบบเม็ดสีที่จอประสาทตา พบว่า 30 [0078] ตัวอย่างที่ 7: ตัวอย่างการผลิตโดยใช้เยื่อบุผิวเซลล์เม็ดสีที่จอประสาทตาเกิด พีพีs (เซลล์ iPS) 201B7 บรรทัดเซลล์มนุษย์ iPS (มีจากบริษัทริเก้น BioResource ศูนย์หรือ iPS ภาคญี่ปุ่น Inc.) เป็น 35 ปลูกตามวิธีที่อธิบายไว้ใน ~ อุเอโนะ M. et al. PNAS 2006, 103(25), 9554-9559" และ ~ วาตานาเบะ K. et al. Nat เทคโนโลยีชีวภาพ 2007, 25, 68 l-686u เป็นอาหาร อาหารได้รับ โดยการเพิ่ม 20% KSR (Knockout™ สิ่งทดแทนซีรัม Invitrogen), 0.1 mM 2-เมอร์แคปโตเอธานอล 2 ml:v1 L-กลูตา กรดอะมิโนไม่จำเป็น lx ใช้ s 5 ng/ml bFGF เพื่ออาหาร DMEM/F12 (Sigma) เซลล์ล้าง iPS จะกระจายเข้าไปในเซลล์เดียวที่ใช้ระงับใน 100 µl ของอาหารที่ปราศจากซีรัมที่ 1.2xl04 เซลล์ต่อหนึ่งจานมีวัฒนธรรมดีกาว-เซลล์ 96 ด่วน TrypLE (Invitrogen), (ทรงคล้ายทรงกลมอัลแผ่น SUMITOMO bakelite ขั้ว Co., 10 จำกัด) เพื่อให้การก่อตัวอย่างรวดเร็วของ กลุ่มก้อนs และขึ้นอยู่กับการเพาะเลี้ยงแบบลอยที่ 37° C, 5% C02• เป็นอาหารที่ปราศจากซีรัมดังนั้น อาหารที่ปราศจากซีรัมที่ได้รับ โดยการเพิ่ม 10% KSR, 450 ไมโครเมตร 1-monothioglycerol, lx เคมีกำหนดข้นไลปิด 20 µM Y27632 การส่วนผสม 1:1 ของ F-12 อาหารและ IMDM อาหารคือ 15 ใช้ วันที่ 3 จากจุดเริ่มต้นของการการเพาะเลี้ยงแบบลอย BMP4 เพิ่มที่ความเข้มข้นสุดท้าย 1.5 nM และการเพาะเลี้ยงแบบลอยการดำเนินการต่อ เป็นจำนวนครึ่งหนึ่งของอาหารวัฒนธรรมได้มีการแลกเปลี่ยนทุก 3 วันกับอาหารดังกล่าวข้างต้นที่เสริม ด้วยวิถีการส่งสัญญาณที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP 20 สารใด ๆ ไม่ วันที่ 18 จากการเริ่มต้นของการการเพาะเลี้ยงแบบลอย กลุ่มก้อนs จะโอนย้ายไป serum• ฟรีอาหาร ซึ่ง DMEM/F-12 อาหาร 3 ไมโครเมตรที่มี CHIR99021 และเพิ่มอาหารเสริม lx N2 และล้างจนถึงวันที่ 21 จากการการเพาะเลี้ยงแบบลอย วันที่ 21 จาก 25 เริ่มต้นการเพาะเลี้ยงแบบลอย กลุ่มก้อนs อยู่ระหว่างสองวัน โดยการฉีด และเลิกการแก้ปัญหา โดยการ micropipette และเซลล์เกิดอยู่ภายใต้การการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะในอาหารที่ปราศจากซีรัม ซึ่งเป็น DMEM/F-12 อาหาร 3 ไมโครเมตรที่มี CHIR99021 (ที่ออกฤทธิ์ต่อเป็นสารวิถีสัญญาณ Wnt) และ 30 เพิ่ม ด้วยอาหารเสริม lx N2, 37° c, 5% C02• ที่วันที่ 27 จากการการเพาะเลี้ยงแบบลอย แบบฟอร์มเซลล์เป็นที่สังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์และนิพจน์ของเยื่อบุผิวเม็ดสีที่จอประสาทตา

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ในวันที่ 3 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะ 3 ไมครอน CHIR99021 ถูกเพิ่ม 10 ไมครอน SU-5402 ถูกบันทึก 3 ไมครอน CHIR99021 และ 10 ไมครอน 20 SU-5402 ถูกเพิ่มพร้อมกัน 1 นาโนเมตร recombinant โปรตีน BMP4 มนุษย์เป็น เพิ่มหรือ 50 ng / ml recombinant มนุษย์แอคทิวินถูกเพิ่มเข้ามาและการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะได้อย่างต่อเนื่อง วัฒนธรรมที่คล้ายกันได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขที่เป็นอิสระจากการเพิ่มขึ้นของสารดังกล่าวข้างต้น อาหารได้รับการแลกเปลี่ยนทุก 3 วันที่ 25 และระดับของการสร้างเยื่อบุผิวได้สังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์ในวันที่ 40 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย เมื่อ 3 ไมครอน CHIR99021 ถูกเพิ่มเข้ามาในวันที่ 24 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย (รูป. SB) เซลล์เปลี่ยนแปลงพัฒนา D เข้าไปเข้มเรเรเมื่อเทียบกับ 30 การควบคุมฟรีนอกจากนี้ (รูป. SA) โดยการเพิ่มพร้อมกันของ 3 ไมครอน CHIR99021 และ 10 ไมครอน SU-5402 (รูป. SD) เม็ดสีเยื่อบุผิวสีเข้มกว่าโดยนอกจากเดียวของ 3 ไมครอน CHIR99021 (รูป. SB) ที่ได้รับ เมื่อ 1 นาโนเมตร recombinant โปรตีน BMP4 มนุษย์ถูกเพิ่มเข้ามา (รูป. SE) หรือ 50 ng / ml recombinant มนุษย์ 35 Acti VIN ถูกเพิ่มเข้ามา (รูป. เอสเอฟ), เยื่อบุผิวสม่ำเสมอมากขึ้นที่ได้รับเมื่อเทียบกับการควบคุมฟรีนอกจากนี้ (รูปที่ . 5A) [0077] ตัวอย่างที่ 6: การผลิตเซลล์แผ่นม่านตาสีเยื่อบุผิว 5 โดยใช้เซลล์ ES มนุษย์โกร๊ตธ์แฟคเตอร์ลด Matrigel ™ (ปรับลด 30 เท่า) หรือ Synthemax ™ (Corning Incorporated) (ปรับลด 40 เท่า ) ถูกบันทึกโดย 100 μleachเวลส์ของ 65 มมห้อง Boyden นี้ (Transwell, Corning Incorporated) ดังกล่าวข้างต้นห้อง 10 เพิ่มด้วย Matrigel ถูกบ่มที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 24 ชั่วโมงและห้องดังกล่าวข้างต้นเพิ่มด้วย Synthemax ™ถูกบ่มที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 2 ชั่วโมงโดยการรักษาเคลือบของวัฒนธรรมวัสดุเรือได้ดำเนินการ ระงับเซลล์เดียวได้รับการจัดทำขึ้นจากกลุ่มก้อน s ในวันที่ 21 จาก 15 จุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอยโดยวิธีการอธิบายในตัวอย่างที่ 4 เซลล์แขวนลอยเมล็ดในอาหารที่ปราศจากซีรัม (200 ไมโครลิตร) ซึ่งเป็น 1: 1 ผสม DMEM / F-12 อาหารและ Neurobasal อาหารเพิ่มด้วย 10% KSR 1/2 N2 เสริม 1/2 B27 เสริม 20 ไมครอน Y27632 ที่ 2x105 เซลล์ต่อกัน 20 อาหาร (1 มล. ) มีองค์ประกอบเดียวกันยังถูกบันทึกอยู่ในที่ต่ำกว่าอย่างดีและการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะได้รับการดำเนินการที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 5% C02 •การยึดติดและการสร้างเยื่อบุผิวของเซลล์ถูกตั้งข้อสังเกตในวันที่ 5 จากการเพาะไปยังห้อง Boyden . ในวัฒนธรรม วัสดุเคลือบด้วยเรือ Synthemax ™ (รูปที่. 25 6B) เซลล์เพาะเลี้ยงได้มาจากกลุ่มก้อน s ยึดติดในลักษณะเช่นเดียวกับในวัสดุเรือวัฒนธรรมเคลือบด้วย Matrigel ซึ่งเป็นเมมเบรนชั้นฐานเตรียม (รูปที่ 6A) และเม็ดสีที่จอประสาทตาเยื่อบุผิวเหมือนรูปแบบโดยที่เซลล์จะปฏิบัติตามอย่างใกล้ชิดกับแต่ละอื่น ๆ พบว่า 30 [0078] ตัวอย่างที่ 7: การผลิตตัวอย่างของเซลล์เยื่อบุผิวเม็ดสีที่จอประสาทตาโดยใช้การเหนี่ยวนำพีพี s (เซลล์ IPS) เซลล์ iPS บรรทัดมนุษย์ 201B7 (ข้อมูลจากศูนย์ RIKEN Bioresource หรือ iPS Academia Japan Inc. ) ได้รับการปลูกฝัง 35 ตามวิธีการที่อธิบายไว้ใน ~ Ueno, M. , et al PNAS 2006 103 (25), 9554-9559 "และ ~ วาตานาเบะเค et al. ชัยนาทไบโอเทค 2007, 25, 68L-686u. ในฐานะที่เป็นอาหารที่เป็นอาหารได้โดยการเพิ่ม 20% KSR (Knockout ™สิ่งทดแทนซีรัม ; Invitrogen) 0.1 มิลลิ 2- เมอร์แคปโตเอธา นอล 2 มล.: v1 L-glutamine, LX กรดอะมิโนที่ไม่จำเป็น, s 5 ng / ml bFGF เพื่อ DMEM / F12 อาหาร (ซิกม่า) เป็น ใช้. เซลล์ iPS เพาะเลี้ยงจะแยกย้ายกันไปเข้าสู่เซลล์เดียวโดยใช้ TrypLE เอ็กซ์เพรส (Invitrogen) ระงับใน 100 ไมโครลิตรของอาหารที่ปราศจากซีรัมที่ 1.2xl04 เซลล์ต่อหนึ่งเดียวที่ไม่ใช่เซลล์กาว 96 แผ่นรวมทั้งวัฒนธรรม (แผ่นลูกกลม Sumilon ซูมิโตโม BAKELITE Co. , Ltd. 10) เพื่อให้การสร้างอย่างรวดเร็วของกลุ่มก้อนและอยู่ภายใต้การเพาะเลี้ยงแบบลอยที่ 37 ° C, 5% C02 •ในฐานะที่เป็นอาหารที่ปราศจากซีรัมดังนั้นเป็นอาหารที่ปราศจากซี รัมได้โดยการเพิ่ม 10% KSR 450 ไมครอน 1 monothioglycerol, LX กำหนดเคมีไลปิดสมาธิ 20 ไมครอน Y27632 ไป 1: 1. ส่วนผสมของ F-12 อาหารและ IMDM อาหารคือ 15 นำมาใช้ในวันที่ 3 จากจุดเริ่มต้นของ การเพาะเลี้ยงแบบลอย, BMP4 จะมีการเพิ่มความเข้มข้นที่สุดท้ายของ 1.5 นาโนเมตรและการเพาะเลี้ยงแบบลอยเป็นอย่างต่อเนื่อง จำนวนครึ่งหนึ่งของวัฒนธรรมอาหารในดีมีการแลกเปลี่ยนทุก 3 วันกับการดังกล่าวข้างต้นไม่ได้อาหารเสริมด้วยสารที่ออกฤทธิ์ต่อ BMP 20 วิถีการส่งสัญญาณ ในวันที่ 18 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอยที่กลุ่มก้อน s จะถูกโอนไปเซรุ่ม•อาหารฟรีซึ่งเป็น DMEM / F-12 อาหารที่มี 3 ไมครอน CHIR99021 และเสริมด้วยอาหารเสริม N2 LX และเพาะเลี้ยงจนถึงวัน 21 จากจุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอย ในวันที่ 21 จาก 25 จุดเริ่มต้นของการเพาะเลี้ยงแบบลอยที่กลุ่มก้อน s จะหยุดชะงักโดยการฉีดและถอดการแก้ปัญหาโดย micropipette และเซลล์ที่เกิดขึ้นอาจมีการการเพาะเลี้ยงแบบยึดเกาะในอาหารที่ปราศจากซี รัมซึ่งเป็น DMEM / F-12 อาหารที่มี 3 ไมครอน CHIR99021 (สารที่ออกฤทธิ์ต่อวิถีสัญญาณ Wnt) และ 30 เพิ่มด้วยอาหารเสริม N2 LX ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส, 5% C02 •ในวันที่ 27 จากจุดเริ่มต้นของ การเพาะเลี้ยงแบบลอยแบบมือถือเป็นที่สังเกตภายใต้กล้องจุลทรรศน์และการแสดงออกของเม็ดสีที่จอประสาทตาเครื่องหมายเยื่อบุผิว