4. Discussion and perspectivesThe p

4. Discussion and perspectives
The presented results show that our spectrophotometer allows
high-quality steady-state ¯uorescence emission spectra to be
readily collected from protein crystals in diverse conditions.
Adding the ¯uorescence option to our absorption microspectrophotometer
was relatively straightforward, since it
required only a modi®cation of the geometry of the setup and
the purchase of suitable excitation lasers and synchronization
electronics.
Test spectra from ¯uorescein collected in one shot and in a
few milliseconds show high accuracy and reproducibility. We
conclude from Fig. 2 that relative changes in ¯uorescence
intensity can be measured with an optimum accuracy of 3%,
whereas shifts in peak emission wavelength can be measured
with an accuracy better than 0.1 nm (see legend to Fig. 2b).
The accuracy of intensity measurements could be improved by
enclosing the apparatus in a chamber so as to minimize
turbulences around the sample. However, shifts in peak
wavelength are expected to be of more interest, being more
reproducible when the sample is changed since they are to a
large extent insensitive to the amount of probed material.
Crystals that are optically too dense to record absorption
spectra of any use are still amenable to ¯uorescence spectroscopy,
as demonstrated in the case of PYP (Fig. 3). Emission
spectra from the weakly ¯uorescent chromophore of PYP,
although they mainly probe the crystal surface and may be
distorted by inner ®ltering effects, are of outstanding signal to
noise ratio, and reveal several features that could be useful for
detailed studies on this system. Although a precise interpretation
of these spectra is beyond the scope of this paper,
they appear consistent with results obtained by Hoff et al.
(1992), who described the low-temperature ¯uorescence of
PYP in solution of 67% (vol./vol.) glycerol. Although in¯uence
of e.g. the glycerol content or the crystallization medium
should be taken into account, ¯uorescence could be used to
perform a comparative study of PYP in solution and in the
crystalline form. Although PYP rapidly enters its photocycle
upon blue light absorption, it seems likely that, at the used
temperatures and under our conditions of illumination
[compare with Genick et al. (1998) who used much longer light
exposure], the spectra of Fig. 3 mostly originate from PYP in
its ground-state conformation. However, the build-up of
intermediate states along the PYP photocycle could potentially
be followed by ¯uorescence under conditions of actinic
illumination. Our results open the way to similar studies on
crystals of other light-sensitive proteins. For example, bacteriorhodopsin
was also demonstrated to be ¯uorescent at low
temperature (Gillbro & Kriebel, 1979; Gillbro et al., 1977;
Gillbro & SundstroÈ m, 1983).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

4. สนทนาและมุมมองผลการนำเสนอแสดงว่า สเปคของเราช่วยให้คุณภาพสูงเสถียร ¯uorescence ปล่อยสเปกตรัมจะพร้อมรวบรวมจากผลึกโปรตีนในสภาพที่มีความหลากหลายเพิ่มตัวเลือก ¯uorescence microspectrophotometer การดูดซึมของเราได้ค่อนข้างตรงไปตรงมา ตั้งแต่นั้นจำเป็นเพียง modi ® รกของเรขาคณิตของการตั้งค่า และซื้อเลเซอร์กระตุ้นเหมาะและซิงโครไนส์อิเทดสอบสเปกตรัมจาก ¯uorescein ที่รวบรวม ในหนึ่งครั้ง และในการไม่กี่มิลลิวินาทีแสดงความแม่นยำสูงและแสดง เราสรุปจาก 2 รูป ¯uorescence การเปลี่ยนแปลงสามารถวัดความเข้มข้น 3% แม่นยำสูงสุดในขณะที่สามารถวัดได้ในช่วงความยาวคลื่นปล่อยมีความถูกต้องดีกว่า 0.1 นาโนเมตร (ดูตำนานการรูป 2b)ความถูกต้องของการวัดความเข้มสามารถปรับปรุงโดยปิดล้อมเครื่องในห้องเพื่อลดปัจจัยรอบ ๆ ตัวอย่าง อย่างไรก็ตาม เลื่อนสูงความยาวคลื่นคาดว่าจะน่าสนใจมากขึ้น การเพิ่มเติมเมื่อตัวอย่างมีการเปลี่ยนแปลงเนื่องจากมีการจำลองแบบปริมาณของวัสดุที่พิสูจน์ถึงระดับใหญ่ผลึกที่หนาแน่นเกินไปเพื่อบันทึกการดูดซึมโดยสเปกตรัมของการใช้จะยังคงคล้อยตามการสเปกโทรสโก ¯uorescenceแสดงให้เห็นในกรณีของ PYP (3 รูป) ปล่อยสเปกตรัมจาก chromophore อ่อน ¯uorescent ของ PYPแม้ว่าพวกเขาส่วนใหญ่หัวกระจกคริสตัล และอาจบิดเบือน โดยภายใน® ltering ผล เป็นสัญญาณที่โดดเด่นในการอัตราเสียงรบกวน และเปิดเผยคุณลักษณะหลายอย่างที่อาจเป็นประโยชน์สำหรับศึกษารายละเอียดในระบบนี้ แม้ว่าการตีความแม่นยำของสเปกตรัมเหล่านี้อยู่นอกขอบเขตของกระดาษปรากฏสอดคล้องกับผลลัพธ์ได้โดย Hoff et al(1992), ¯uorescence อุณหภูมิต่ำของอธิบายที่PYP ในโซลูชันของกลีเซอรอล 67% (ปีที่ฉบับฉบับ) แม้ว่า in¯uenceเช่นกลีเซอรอลเนื้อหาหรือสื่อที่ตกผลึกจะต้องดำเนินการเข้าบัญชี ¯uorescence สามารถนำไปใช้ทำการศึกษาเปรียบเทียบของ PYP ในโซลูชัน และในการฟอร์มผลึก แม้ว่า PYP ป้อนของ photocycle อย่างรวดเร็วเมื่อการดูดซึมแสงสีฟ้า ดูเหมือนว่าแนวโน้มที่ เวลาที่ใช้อุณหภูมิและภาย ใต้เงื่อนไขของการส่องสว่างของเรา[เปรียบเทียบกับ Genick et al. (1998) ที่ใช้แสงอีกต่อไปแสง มุม 3 รูปส่วนใหญ่มาจาก PYP ในโครงสร้างของดินรัฐ อย่างไรก็ตาม การสะสมของอเมริกากลางพร้อม PYP photocycle อาจจะตาม ด้วย ¯uorescence ภายใต้เงื่อนไขของการเกิดส่องสว่าง ผลของเราเปิดทางการศึกษาที่คล้ายกันบนผลึกของโปรตีนไวแสงอื่น ๆ ตัวอย่างเช่น bacteriorhodopsinยังแสดงให้เห็นจะ ¯uorescent ที่ต่ำอุณหภูมิ (Gillbro & Kriebel, 1979 Gillbro et al. 1977Gillbro & SundstroÈ ม 1983)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

4. อธิบายและมุมมองที่
ผลนำเสนอแสดงให้เห็นว่า spectrophotometer ของเราจะช่วยให้
มีคุณภาพสูงมั่นคงของรัฐ¯uorescenceการปล่อยสเปกตรัมที่จะ
เก็บรวบรวมได้อย่างง่ายดายจากผลึกโปรตีนในสภาพที่มีความหลากหลาย.
เพิ่มตัวเลือก¯uorescenceเพื่อ microspectrophotometer การดูดซึมของเรา
ค่อนข้างตรงไปตรงมาเพราะมัน
จำเป็น เพียงmodi®cationของเรขาคณิตของการติดตั้งและ
การซื้อของเลเซอร์กระตุ้นและการประสานที่เหมาะสม
อิเล็กทรอนิกส์.
ทดสอบสเปกตรัมจาก¯uoresceinเก็บรวบรวมไว้ในหนึ่งยิงและใน
ไม่กี่มิลลิวินาทีแสดงความแม่นยำสูงและการทำสำเนา เรา
สรุปได้จากรูป 2 ว่าการเปลี่ยนแปลงเมื่อเทียบกับใน¯uorescence
เข้มสามารถวัดได้ด้วยความถูกต้องเหมาะสมของ 3%
ในขณะที่การเปลี่ยนแปลงในการปล่อยความยาวคลื่นสูงสุดที่สามารถวัดได้
ด้วยความถูกต้องดีกว่า 0.1 นาโนเมตร (ดูตำนานรูป Fig. 2B).
ความถูกต้องของการวัดความเข้มที่จะทำได้ จะดีขึ้นโดย
การปิดล้อมอุปกรณ์ในห้องเพื่อที่จะลด
ความปั่นป่วนรอบตัวอย่าง อย่างไรก็ตามการเปลี่ยนแปลงในจุดสูงสุด
ความยาวคลื่นที่คาดว่าจะได้รับความสนใจมากขึ้นเป็นมากขึ้น
ทำซ้ำได้เมื่อกลุ่มตัวอย่างที่มีการเปลี่ยนแปลงตั้งแต่พวกเขาเป็นไป
ในระดับใหญ่รู้สึกถึงปริมาณของวัสดุตรวจสอบได้.
คริสตัลที่มีสายตาที่หนาแน่นเกินไปที่จะบันทึกการดูดซึม
สเปกตรัมของการใช้งานใด ๆ ยังคงคล้อยตาม¯uorescenceสเปกโทรสโก,
แสดงให้เห็นว่าในกรณีของ PYP (รูปที่. 3) การปล่อย
สเปกตรัมจาก chromophore ¯uorescentอ่อนของ PYP,
แม้ว่าพวกเขาส่วนใหญ่ตรวจสอบพื้นผิวผลึกและอาจถูก
บิดเบือนโดยผลกระทบ®lteringภายในมีสัญญาณที่โดดเด่นเพื่อ
เสียงอัตราส่วนและเปิดเผยคุณสมบัติหลายประการที่อาจจะมีประโยชน์สำหรับ
การศึกษารายละเอียดเกี่ยวกับระบบนี้ . แม้ว่าการตีความแม่นยำ
ของสเปกตรัมเหล่านี้อยู่นอกเหนือขอบเขตของบทความนี้
พวกเขาจะปรากฏสอดคล้องกับผลที่ได้รับจากฮอฟฟ์ et al.
(1992) ที่อธิบาย¯uorescenceอุณหภูมิต่ำของ
PYP ในการแก้ปัญหา 67% (vol./vol .) กลีเซอรอล แม้ว่าin¯uence
ของเนื้อหาเช่นกลีเซอรอลหรือขนาดกลางตกผลึก
ควรจะนำเข้าบัญชี¯uorescenceสามารถใช้ในการ
ดำเนินการศึกษาเปรียบเทียบ PYP ในการแก้ปัญหาและใน
รูปแบบผลึก แม้ว่า PYP อย่างรวดเร็วเข้าสู่ photocycle ของมัน
เมื่อดูดซึมแสงสีฟ้ามันดูเหมือนว่าที่ใช้
อุณหภูมิและภายใต้เงื่อนไขของการส่องสว่างของเรา
[เปรียบเทียบกับ Genick et al, (1998) ที่ใช้มากอีกต่อไปแสง
แสง], สเปกตรัมของมะเดื่อ 3 ส่วนใหญ่มาจาก PYP ใน
ของโครงสร้างพื้นรัฐ อย่างไรก็ตามการสร้างขึ้นของ
รัฐระดับกลางตาม photocycle PYP อาจ
จะตามมาด้วย¯uorescenceภายใต้เงื่อนไขของ actinic
ส่องสว่าง ผลของเราเปิดทางให้กับการศึกษาที่คล้ายกันใน
ผลึกของโปรตีนที่ไวต่อแสงอื่น ๆ ยกตัวอย่างเช่น bacteriorhodopsin
ก็ยังแสดงให้เห็นว่า¯uorescentต่ำ
อุณหภูมิ (Gillbro & KRIEBEL 1979; Gillbro et al, 1977;.
Gillbro & SundstroÈ M, 1983)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

4 . การอภิปรายและมุมมองนำเสนอผลการศึกษาพบว่าเครื่องของเราช่วยให้ที่มีคุณภาพสูงภายใต้การเป็น¯ uorescence สเปกตรัมพร้อมรวบรวมผลึกโปรตีนในเงื่อนไขที่หลากหลายเพิ่ม¯ uorescence ตัวเลือก microspectrophotometer การดูดซึมของเรามันค่อนข้างตรงไปตรงมา เนื่องจากมันต้องการเพียง Modi ®ไอออนบวกของเรขาคณิตของการติดตั้งและการกระตุ้นที่เหมาะสมและการเลเซอร์อิเล็กทรอนิกส์การทดสอบนี้มาจาก¯ uorescein เก็บในหนึ่งยิงและในไม่กี่มิลลิวินาที ให้ความแม่นยำสูง และคาร์บอน เราสรุปจากรูปที่ 2 ว่า การเปลี่ยนแปลงใน¯ uorescence สัมพัทธ์ความรุนแรงที่สามารถวัดที่มีความถูกต้องสูงสุด 3 %ส่วนการเปลี่ยนความยาวคลื่นสูงสุดที่สามารถวัดได้มีความถูกต้องมากกว่า 0.1 nm ( ดูตำนานรูปที่ 2B )ความถูกต้องของการวัดความเข้มอาจปรับปรุงโดยรวมเครื่องมือในห้องเพื่อลดturbulences รอบๆตัวอย่าง อย่างไรก็ตาม การเปลี่ยนแปลงในสูงสุดความยาวคลื่นที่คาดว่าจะเป็นที่สนใจมากขึ้น มีมากขึ้นซึ่งเมื่อตัวอย่างมีการเปลี่ยนแปลงตั้งแต่พวกเขาจะเป็นขอบเขตขนาดใหญ่ตรวจสอบตายด้านกับปริมาณของวัสดุที่ผลึกที่ด้านข้างทึบเกินไปบันทึกการดูดซึมสเปกตรัมของใด ๆที่ใช้ยังซูฮกให้¯ uorescence สเปกโทรสโคปีดังเช่นกรณีของพิพ ( รูปที่ 3 ) ปล่อยแสงจาก¯ uorescent ที่มีสีของพิพล้มทับ ,แม้ว่าพวกเขาส่วนใหญ่ตรวจสอบพื้นผิวของผลึกและอาจจะการบิดเบือนโดยภายใน® ltering ผล , เป็นสัญญาณที่โดดเด่นอัตราส่วนระหว่างเสียง และแสดงคุณสมบัติหลายประการที่อาจเป็นประโยชน์สำหรับศึกษารายละเอียดของระบบนี้ แม้ว่าการตีความที่ชัดเจนSpectra เหล่านี้อยู่นอกเหนือขอบเขตของบทความนี้ ,พวกเขาปรากฏสอดคล้องกับผลโดยฮอฟ et al .( 1992 ) ที่อธิบาย¯ uorescence อุณหภูมิของพิพในสารละลาย 67% ( Vol / Vol ) กลีเซอรอล . แม้ว่าใน¯ uenceเช่น กลีเซอรอล เนื้อหาหรือผลึกขนาดกลางควรพิจารณา¯ uorescence สามารถใช้แสดงการเปรียบเทียบพิพในสารละลายในรูปแบบผลึก แม้ว่าพิพอย่างรวดเร็วเข้าสู่ photocycle ของมันเมื่อดูดซับแสงสีฟ้า , ดูเหมือนว่าโอกาสที่ใช้อุณหภูมิและภายใต้เงื่อนไขของรัศมี[ เปรียบเทียบกับ genick et al . ( 1998 ) ที่ใช้แสงมากอีกต่อไปแสง ] , สเปกตรัมของรูปที่ 3 ส่วนใหญ่มาจากพิพในสถานะพื้นของโครงสร้าง อย่างไรก็ตาม การสะสมของสหรัฐอเมริกากลางตามพิพ photocycle อาจตามมาด้วย¯ uorescence ภายใต้เงื่อนไขของ actinicรัศมี ผลการศึกษาที่คล้ายกันในเปิดทางlight-sensitive ผลึกของโปรตีนอื่น ๆ ตัวอย่างเช่น แบคเทอริโอโรโดปซินยังแสดงให้¯ uorescent ที่ต่ำอุณหภูมิ ( gillbro & ครีเบิล , 1979 ; gillbro et al . , 1977 ;gillbro & sundstro È M , 1983 )