DNA extraction, amplification, and

DNA extraction, amplification, and sequencing
Pycnidia and perithecia were carefully dissected under the
stereo-microscope and prepared for DNA extraction. The
fungal material was always taken from a single area of the
thallus and transferred to a 1.5 ml tube. Similarly, a small
part of each culture, both from the original inocula and the
mature isolates, was taken and transferred to a 1.5 ml tube.
The material was first frozen and then pulverized with metal
beads using a TissueLyserII (Retsch). The DNA was extracted
according to the protocol of Cubero et al. (1999). The phylogenetic
relationships of the Lichenodiplis and Muellerella samples
and the cultured strains were studied with sequences of the
nuclear large and partial nuclear small ribosomal subunits
(28S and 18S) and the mitochondrial small ribosomal subunit
(16S). The loci were amplified using both already published
and newly designed primers (Table 2). The new primers
were designed using sequences obtained from the first sequenced
Lichenodiplis and Muellerella isolates (L1858, L1860
and L1992, L1993, L1994; Table 1). The nuclear 28S fragment
was obtained in two pieces using primers SR6R (http://
www.botany.duke.edu/fungi/mycolab) and LR5 for the first
part, and LR3R, and LR7 (Vilgalys & Hester 1990) for the second
part (http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)
and the new Mu_ITS1008f and Mu_LR729r. The
region ITS was amplified only in three samples and is therefore
not included in the phylogenetic analysis. The nuclear
18S locus was amplified using the primers nuSSU0072,
nuSSU0852 (Gargas & Taylor 1992) or NS1 (White et al.
1990), and the new Mu_ns2f and Mu_ns3r (Table 2). The mitochondrial
16S locus was amplified using the primers mtSSU1
and mtSSU3r (Zoller et al. 1999) or MSU7 (Zhou & Stanosz
2001), and the new Mu_mtSSU27f and Mu_mtSSU651r
(Table 2). The PCR amplifications carried out with the newly
designed primers were performed using the proofreading
Phusion polymerase (BioLabs) under the following conditions:
an initial denaturation step at 98 C for 5 min, followed
by 35 cycles of denaturation at 98 C, annealing at 57 C, both
for 30 s, a 1 min elongation step at 72 C. The final elongation
step was 7 min at 72 C. The PCR conditions applied for the
previous published primers were: an initial denaturation
step at 95 C for 5 min, 35 cycles of denaturation at 95 C
for 1 min, annealing at 54 C for 1 min and elongation at
72 C for 2 min; the final elongation step was at 72 C for
7 min. Both complementary strands were always sequenced
and sequencing was run by Microsynth (Vienna, Austria).
The sequences were assembled and edited in BioEdit (Hall
1999).
Table 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

สกัดดีเอ็นเอ ขยาย และจัดลำดับPycnidia และ perithecia ได้รอบคอบ dissected ภายใต้การ- กล้องจุลทรรศน์สเตอริโอ และเตรียมไว้สำหรับสกัดดีเอ็นเอ ที่วัสดุเชื้อรามักจะได้มาจากพื้นที่หนึ่งของการthallus และโอนย้ายไปหลอด 1.5 ml ในทำนองเดียวกัน เล็กเป็นส่วนหนึ่งของวัฒนธรรมแต่ละ ทั้งจาก inocula เดิมและผู้ใหญ่แยก ถูกดำเนินการ และโอนย้ายไปหลอด 1.5 mlวัสดุก่อน แช่แข็งแล้ว คลุกกับโลหะลูกปัดที่ใช้ TissueLyserII (Retsch) ดีเอ็นเอถูกแยกตาม protocol ของ Cubero et al. (1999) การ phylogeneticความสัมพันธ์ของตัวอย่าง Lichenodiplis และ Muellerellaและมีศึกษาสายพันธุ์อ่าง มีลำดับของการนิวเคลียร์ขนาดใหญ่ และบางส่วนนิวเคลียร์ขนาดเล็ก ribosomal subunits(28S และ 18S) และย่อย ribosomal เล็ก mitochondrial(16S) . loci ถูกขยายโดยใช้ทั้งการเผยแพร่แล้วและไพรเมอร์ที่ออกแบบใหม่ (ตารางที่ 2) ไพรเมอร์ใหม่ถูกออกแบบโดยใช้ลำดับที่ได้รับจากวันแรกตามลำดับLichenodiplis และ Muellerella แยก (L1858, L1860และ L1992, L1993, L1994 ตาราง 1) ส่วนนิวเคลียร์ 28Sได้รับในสองชิ้นที่ใช้ไพรเมอร์ SR6R (ของ http://การ www.botany.duke.edu/fungi/mycolab) และ LR5 สำหรับครั้งแรกส่วน หนึ่ง และ LR3R และ LR7 (Vilgalys & Hester 1990) สำหรับสองส่วน (ส่วน http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm)และใหม่ Mu_ITS1008f และ Mu_LR729rภูมิภาคของถูกขยายในตัวอย่างที่ 3 เท่านั้น จึงไม่รวมอยู่ในการวิเคราะห์ phylogenetic การนิวเคลียร์โลกัสโพล 18S ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ nuSSU0072nuSSU0852 (Gargas & Taylor 1992) หรือ NS1 (ขาว et al1990), และใหม่ Mu_ns2f และ Mu_ns3r (ตารางที่ 2) การ mitochondrialโลกัสโพล 16S ถูกขยายโดยใช้ mtSSU1 ไพรเมอร์และ mtSSU3r (Zoller et al. 1999) หรือ MSU7 (โจวและ Stanosz2001), และใหม่ Mu_mtSSU27f และ Mu_mtSSU651r(ตารางที่ 2) Amplifications PCR ที่ดำเนินการด้วยตัวใหม่ไพรเมอร์ที่ออกแบบได้ดำเนินการโดยใช้การตรวจทานPhusion พอลิเมอเรส (BioLabs) ภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้:มีขั้นตอน denaturation เริ่มที่ C 98 สำหรับ 5 นาที ตามโดยรอบ 35 ของ denaturation ที่ 98 C การอบเหนียวที่ 57 C ทั้งสองสำหรับ 30 s ขั้นตอน elongation 1 นาทีที่ 72 C. Elongation ขั้นสุดท้ายขั้นตอน 7 นาทีที่ 72 C. เงื่อนไข PCR ที่ใช้สำหรับการมีไพรเมอร์ที่เผยแพร่ก่อนหน้านี้: denaturation เป็นต้นขั้นตอนที่ 95 C 5 นาที สำหรับรอบ 35 ของ denaturation ที่ 95 Cใน 1 นาที การอบเหนียวที่ 54 C 1 นาทีและ elongation ที่ซี 72 สำหรับ 2 นาที เป็นขั้นตอนสุดท้าย elongation ที่ 72 C สำหรับ7 นาที ทั้งสอง strands เสริมถูกเรียงลำดับเสมอและจัดลำดับถูกเรียกใช้ โดย Microsynth (เวียนนา ออสเตรีย)ลำดับที่ถูกรวบรวม และแก้ไขใน BioEdit (ฮอลล์1999)ตารางที่ 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การสกัดดีเอ็นเอขยายและลำดับ
Pycnidia และ perithecia
ถูกชำแหละอย่างรอบคอบภายใต้สเตอริโอกล้องจุลทรรศน์และเตรียมพร้อมสำหรับการสกัดดีเอ็นเอ
วัสดุเชื้อรามักจะถูกนำมาจากพื้นที่ที่เดียวของ
thallus และโอนไปยังหลอด 1.5 มล. ในทำนองเดียวกันที่มีขนาดเล็กเป็นส่วนหนึ่งของแต่ละวัฒนธรรมทั้งจาก inocula เดิมและไอโซเลทผู้ใหญ่ถูกนำตัวและโอนไปยังหลอด1.5 มล. วัสดุที่เป็นครั้งแรกที่แช่แข็งและบดแล้วด้วยโลหะลูกปัดใช้ TissueLyserII (Retsch) ดีเอ็นเอถูกสกัดตามโปรโตคอลของ Cubero et al, (1999) สายวิวัฒนาการความสัมพันธ์ของ Lichenodiplis และตัวอย่าง Muellerella และสายพันธุ์ที่เพาะเลี้ยงได้ศึกษากับลำดับของนิวเคลียร์ขนาดใหญ่และบางส่วนหน่วยย่อยของไรโบโซมขนาดเล็กนิวเคลียร์(28S และ 18S) และโซมอล subunit ยลขนาดเล็ก(16S) ตำแหน่งที่ถูกขยายโดยใช้ทั้งการเผยแพร่แล้วและไพรเมอร์ที่ออกแบบใหม่ (ตารางที่ 2) ไพรเมอร์ใหม่ได้รับการออกแบบโดยใช้ลำดับที่ได้รับจากครั้งแรกติดใจLichenodiplis และแยก Muellerella (L1858, L1860 และ L1992, L1993, L1994; ตารางที่ 1) นิวเคลียร์ 28S ชิ้นส่วนที่ได้รับในสองชิ้นโดยใช้ไพรเมอร์SR6R (http: // www.botany.duke.edu/fungi/mycolab) และ LR5 เป็นครั้งแรกส่วนหนึ่งและLR3R และ LR7 (Vilgalys และเฮสเตอร์ 1990) เป็นครั้งที่สองส่วนหนึ่ง (http://www.biology.duke.edu/fungi/mycolab/primers.htm) และ Mu_ITS1008f ใหม่และ Mu_LR729r ภูมิภาค ITS ถูกขยายเฉพาะในสามตัวอย่างและดังนั้นจึงไม่ได้รวมอยู่ในการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการ นิวเคลียร์18S สถานที่ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ nuSSU0072, nuSSU0852 (Gargas และเทย์เลอร์ 1992) หรือ NS1 (สีขาว et al. 1990) และ Mu_ns2f ใหม่และ Mu_ns3r (ตารางที่ 2) ยลสถานที่ 16S ถูกขยายโดยใช้ไพรเมอร์ mtSSU1 และ mtSSU3r (Zoller et al. 1999) หรือ MSU7 (โจว & Stanosz 2001) และ Mu_mtSSU27f ใหม่และ Mu_mtSSU651r (ตารางที่ 2) PCR เครื่องขยายเสียงดำเนินการกับใหม่ไพรเมอร์ได้รับการออกแบบได้รับการดำเนินการโดยใช้การพิสูจน์อักษรโพลิเมอร์Phusion (BioLabs) ภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้เป็นขั้นตอนที่สูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นที่98 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาทีตาม35 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 98 C, การอบที่ 57 องศาเซลเซียส ทั้งสำหรับ30 วินาทีที่มีขั้นตอนการยืดตัว 1 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสการยืดตัวสุดท้ายขั้นตอนที่7 นาทีที่ 72 องศาเซลเซียสสภาพ PCR ใช้สำหรับไพรเมอร์ก่อนหน้านี้ได้รับการตีพิมพ์: การสูญเสียสภาพธรรมชาติเริ่มต้นขั้นตอนที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, 35 รอบ ของ denaturation ที่ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา1 นาที, การอบที่ 54 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและการยืดตัวที่72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที; ขั้นตอนสุดท้ายคือการยืดตัวที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา7 นาที ทั้งสองเส้นเสริมมีลำดับขั้นตอนเสมอและลำดับดำเนินการโดย Microsynth (กรุงเวียนนาประเทศออสเตรีย). ลำดับถูกประกอบและแก้ไขใน BioEdit (ฮอลล์1999). ตารางที่ 2

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การสกัด DNA amplification , และลำดับ
พิกนิเดียเพอริทีเซียถูกชำแหละและรอบคอบ ภายใต้กล้องสเตอริโอและเตรียม
สำหรับการสกัดดีเอ็นเอ
วัสดุรามักจะมาจากพื้นที่เดียวของ
แทลลัสและโอนไปยังหลอด 1.5 ml . ในทำนองเดียวกัน ส่วนเล็กน้อย
ของแต่ละวัฒนธรรม ทั้งจาก inocula เดิมและ
ผู้ใหญ่สามารถถูกโอนไปยัง 1หลอด 5 ml .
วัสดุก่อนแช่แข็งแล้วกระแทกกับโลหะ
ลูกปัดที่ใช้ tissuelyserii ( retsch ) ดีเอ็นเอที่สกัด
ตามโปรโตคอลของ cubero et al . ( 1999 ) ความสัมพันธ์ phylogenetic
ของ lichenodiplis muellerella และตัวอย่าง
และสายพันธุ์เพาะเลี้ยงปริมาณลำดับ
นิวเคลียร์ขนาดใหญ่และบางส่วนนิวเคลียร์ไรโบโซมหน่วยย่อยขนาดเล็ก
( 28s ( 18s คุณ mitochondrial . ribosomal subunit
( ไคฟง ) . มีสถานะเป็นทั้งเบสและการตีพิมพ์แล้ว
ไพรเมอร์ที่ออกแบบใหม่ ( ตารางที่ 2 )
ไพรเมอร์ใหม่ถูกออกแบบมาโดยใช้ลำดับได้ จากก่อนนี้
lichenodiplis muellerella และสายพันธุ์ ( l1858 l1860
, l1992 l1993 l1994 , และ , ตารางที่ 1 ) ส่วน
28s นิวเคลียร์was obtained in two pieces primers sr6r ( http : / /
www.botany . คลิฟฟ์ . : / fungi / mycolab ) ( lr5 for the ,
ลง ( lr3r , ( lr7 ( vilgalys & hester 1990 ) for ลง second
( http : / / www.biology . คลิฟฟ์ . : / fungi / mycolab / primers . htm )
( the mu_its1008f ผล ( mu_lr729r . the
region its was ครั้งหนึ่งเลย in samples ( อาจารย์
not included in อยู่ phylogenetic .นิวเคลียร์ของตน คือ การพบ

nussu0072 ไพรเมอร์ , nussu0852 ( กากาส&เทย์เลอร์ 1992 ) หรือ 1 ( ขาว et al .
1990 ) และใหม่ mu_ns2f และ mu_ns3r ( ตารางที่ 2 ) สถานที่การใช้กำลังขยายการใช้ไพรเมอร์

และ mtssu1 mtssu3r ( ซอลเลอร์ et al . 1999 ) หรือ msu7 ( โจว& stanosz
2001 ) และ mu_mtssu27f ใหม่และ mu_mtssu651r
( ตารางที่ 2 )the pcr amplifications สปายแวร์จะฉันตรง
designed primers สำหรับ performed the ศัลยกรรมความงาม
phusion polymerase ( biolabs ) under the conditions following :
ขาล c ความสิ้นหวัง , เกม 1.65 ตรงนี้เกิน followed
by 35 cycles เกม 1.65 ความสิ้นหวังของ c , annealing at 57 c , เจ็ด
, บอกกับ min การขั้นตอนที่ 72 C . ขั้นตอนสุดท้ายคือการยืดตัว
7 นาทีที่ 72 Cเงื่อนไขเพื่อประยุกต์สำหรับ
ก่อนหน้านี้เผยแพร่โดย : เริ่มต้น (
ขั้นตอน 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที 3 รอบ ( 95 C
1 นาทีที่ 54 C อบนาน 1 นาที และการแพร่
72 C 2 นาที ; ขั้นตอนการยืดตัวสุดท้ายอยู่ที่ 72 C
7 นาที ทั้งแบบเส้นนี้เสมอ และถูกเรียกใช้โดย microsynth ลำดับ

( เวียนนา , ออสเตรีย )ลำดับถูกประกอบและแก้ไขใน bioedit ( หอ

ตาราง 2 1999 )