viouslydescribed (He and Sanford, 2

viously
described (He and Sanford, 2002). The medium was sterilized
by autoclaving following dispensing into sealed glass
containers. The vitamin solution was added from sterile anaerobic
stock solutions after autoclaving.2.1. Cellulosic substrates
To ensure consistency in the testing of cellulose fermentation,
only commercially available cellulosic substrates from the same
delivery were used in this study. Two powdered cellulosic substrates,
Avicel and Solka Floc, were tested in this study. Avicel
PH-101 was purchased from Sigma–Aldrich Co., St. Louis, Missouri.
Solka Floc 200 was acquired from International Fiber Corporation,
North Tonawanda, New York.
2.2. Microorganisms
Clostridium thermocellum (ATCC 35609) and Thermoanaerobacter
pseudethanolicus strain 39E (ATCC 33323) were obtained from the
American Type Culture Collection (Manassas, Virginia). Thermoanaerobacter
sp. strain X514 was originally isolated from the deep
subsurface in the Piceance Basin, Colorado (Roh et al., 2002) and is
maintained in our laboratory culture collection. Strain X514 has
been deposited at the American Type Culture Collection (ATCC
BAA-938). C. thermocellum is cellulolytic (McBee, 1954); but strains
X514 and 39E are non-cellulolytic and strictly fermentative (Roh
et al., 2002; Zeikus et al., 1980).
2.3. Medium formulation and preparation
A defined anaerobic medium was used throughout this study
according to a previously described formula (He et al., 2009). The
medium contained the following (per liter): 10.0 g NaCl, 0.5 g
MgCl26H2O, 0.2 g KH2PO4, 0.3 g NH4Cl, 0.3 g KCl, 0.015 g
CaCl22H2O, 1 mL trace element solution, 1 mL selenium-tungsten
solution, 10 mL vitamin solution, 2.52 g NaHCO3, and 0.05 mg resazurin.
The trace element solution contained the following (per liter):
1.5 g FeCl24H2O, 0.19 g CoCl26H2O, 0.1 g MnCl24H2O, 70 mg
ZnCl2, 6 mg H3BO3, 36mg Na2MoO42H2O, 24 mg NiCl26H2O, and
2 mg CuCl22H2O. The selenium-tungsten solution contained
6mg Na2SeO35H2O per liter, 8 mg Na2WO42H2O per liter, and
0.54 g of NaOH per liter. The vitamin solution contained the following
(per liter): 20 mg biotin, 20 mg folic acid, 100 mg pyridoxine
hydrochloride, 50 mg riboflavin, 50 mg thiamine, 50 mg
nicotinic acid, 50 mg pantothenic acid, 1 mg vitamin B12, 50mg
p-aminobenzoic acid, and 50 mg thioctic acid.
The pH of the medium was adjusted to 7.2 ± 0.1 by purging with
an oxygen-free nitrogen/CO2 gas mix. Anaerobic condition of the
medium was maintained by the addition of sulfide (0.048 g
Na2S9H2O) and cysteine (0.031 g L-cysteine) as reductants as previously
described (He and Sanford, 2002). The medium was sterilized
by autoclaving following dispensing into sealed glass
containers. The vitamin solution was added from sterile anaerobic
stock solutions after autoclaving.
2.4. Growth conditions
Stock cultures of all bacterial strains were stored in 15% glycerol
at 80 C. Inocula were obtained by sub-culturing aliquots of the
frozen stocks in 60-mL serum bottles with 30 ml of boiled degassed
medium closed with butyl rubber stoppers and aluminum
seals. Cultures were incubated in the dark at 60 C without constant
agitation. For routine cultivation, 1% (w/v) of cellobiose (for
the cellulolytic culture C. thermocellum) or glucose (for the noncellulolytic
39E and X514) was added as the only fermentation
substrate in defined medium. Active cultures were maintained by
transferring a 1% inoculum to fresh medium after fermentation
was completed and growth had stopped. Strict anaerobic techniques
were used throughout all experimental manipulations.
Sterile syringes and needles, used for substrate addition and
sampling, were flushed with N2 prior to use.
2.5. Cellulose fermentation
Cellulose fermentation experiments were initiated by a 1% (v/v)
inoculum of log-phase cultures (OD600  0.5) grown on cellobiose
or glucose. Mono-cultures were inoculated with C. thermocellum
only, referred to as CT mono-cultures. Co-cultures were inoculated
with strain X514 or 39E in addition to C. thermocellum, referred to
as CT-X514 or CT-39E co-cultures, respectively. In fermentation
experiments to determine the role of non-cellulolytic Thermoanaerobacter
strains in cellulose fermentation, co-cultures were
established stepwise by first initiating mono-cultures of C. thermocellum
followed by the addition of strain 39E or X514 when soluble
sugar had accumulated. When needed, yeast extract 0.6% (w/v)
was added to the defined medium during medium preparation.
In fermentation experiments where exogenous vitamin B12 was
added to the defined medium, an alternative vitamin solution
was made by omitting vitamin B12 from the formula and used for
the preparation of the defined medium. Subsequently, varying
amounts of vitamin B12 was added before inoculation. All fermentation
experiments were performed in triplicates.
2.6. Analytical procedures
To monitor the production of fermentation end products,
samples (1 mL) from the culture broth were taken periodically
via de

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

viouslyอธิบายและชา 2002) สื่อถูกผ่านการฆ่าเชื้อโดย autoclaving ต่อจ่ายลงในแก้วที่ปิดสนิทคอนเทนเนอร์ โซลูชั่นวิตามินถูกเพิ่มจากหมันไม่ใช้ออกซิเจนโซลูชั่นหุ้นหลัง autoclaving.2.1 พื้นผิวครั้งในการทดสอบของเอนไซม์เซลลูโลสเฉพาะในเชิงครั้งพื้นผิวจากเหมือนกันจัดส่งที่ใช้ในการศึกษานี้ พื้นผิวการไลต์ผงสองAvicel และ Solka Floc ได้รับการทดสอบในการศึกษานี้ AvicelPH-101 ซื้อจาก บริษัทซิกม่า-Aldrich, St. Louis, MissouriSolka Floc 200 มาจาก บริษัทนานาชาติไฟเบอร์Tonawanda เหนือ นิวยอร์ก2.2. จุลินทรีย์เชื้อ clostridium thermocellum (ATCC 35609) และ Thermoanaerobacterpseudethanolicus สายพันธุ์ 39E (ATCC 33323) ได้รับมาจากการชุดวัฒนธรรมอเมริกันชนิด (มานาสซาส เวอร์จิเนีย) Thermoanaerobacterสายพันธุ์เอสพี X 514 ถูกที่แต่เดิมแยกจากลึกใต้ผิวดินใน Piceance ลุ่ม โคโลราโด (Roh et al. 2002) และรักษาไว้ในคอลเล็คชั่นวัฒนธรรมห้องปฏิบัติการ มีสายพันธุ์ X 514รับฝากไว้ที่อเมริกันประเภทวัฒนธรรมชุด (ATCCBAA-938) C. thermocellum เป็น cellulolytic (McBee, 1954) ; แต่สายพันธุ์X 514 และ 39E จะหมักอย่างเคร่งครัด และไม่ใช่ cellulolytic ทวิet al. 2002 Zeikus et al. 1980)2.3. กลางกำหนดและเตรียมใช้ตัวกลางที่ใช้กำหนดตลอดการศึกษานี้ตามการสูตรอธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (เขา et al. 2009) การกลางอยู่ต่อไปนี้ (ต่อลิตร): 10.0 g NaCl, 0.5 กรัมMgCl2 6H2O, KH2PO4 0.2 g, 0.3 g NH4Cl, 0.3 กรัม KCl, 0.015 กรัมCaCl2 2H2O โซลูชันจุลธาตุ 1 mL, 1 mL ซีลีเนียมทังสเตนแก้ปัญหา แก้ไขปัญหาวิตามิน 10 มล. 2.52 g NaHCO3 และ resazurin 0.05 มิลลิกรัมการแก้ไของค์ประกอบติดตามอยู่ (ต่อลิตร) ต่อไปนี้:1.5 g FeCl2 4H2O, 6H2O CoCl2 0.19 g, 0.1 g MnCl2 4H2O, 70 มิลลิกรัมZnCl2, H3BO3 6 มิลลิกรัม 2H2O Na2MoO4 36 มิลลิกรัม 24 มิลลิกรัม NiCl2 6H2O และ2 มิลลิกรัม CuCl2 2H2O โซลูชันทังสเตนซีลีเนียมที่มีอยู่6 มิลลิกรัม Na2SeO3 5H2O ต่อลิตร 8 มิลลิกรัม Na2WO4 2H2O ต่อลิตร และ0.54 g ของ NaOH ต่อลิตร โซลูชั่นวิตามินมีอยู่ต่อไปนี้(ต่อลิตร): โบโอติน 20 มก. กรดโฟลิก 20 มิลลิกรัม ไพริดอกซิ 100 มก.ไฮโดรคลอไรด์ 50 มิลลิกรัม riboflavin ไทอะ 50 มิลลิกรัม 50 มิลลิกรัมกรด nicotinic, 1 มก.วิตามินบี 12 กรดแพนโทธีนิค 50 มิลลิกรัม 50 มิลลิกรัมกรด p-aminobenzoic และกรด thioctic 50 มิลลิกรัมค่า pH ของการปรับปรุงการ 7.2 ± 0.1 โดยล้างด้วยการปราศจากออกซิเจน ไนโตรเจน/CO2 ก๊าซผสมนี้ ใช้เงื่อนไขของการกลางกรุงนอกของซัลไฟด์ (0.048 กรัมNa2S 9H2O) และไส้ (0.031 g L-cysteine) เป็น reductants เป็นก่อนหน้านี้อธิบายและชา 2002) สื่อถูกผ่านการฆ่าเชื้อโดย autoclaving ต่อจ่ายลงในแก้วที่ปิดสนิทคอนเทนเนอร์ โซลูชั่นวิตามินถูกเพิ่มจากหมันไม่ใช้ออกซิเจนโซลูชั่นหุ้นหลัง autoclaving2.4 การเงื่อนไขเจริญเติบโตสินค้าวัฒนธรรมของทุกสายพันธุ์เชื้อแบคทีเรียถูกเก็บไว้ในกลีเซอรอล 15%ที่ 80 C. Inocula รับ โดยย่อย culturing aliquots ของการแช่แข็งหุ้นในเซรั่ม 60 มล.ขวด มี 30 มล.ต้ม degassedปิด ด้วยจุกยางบิวทิลและอลูมิเนียมกลางซี ได้รับการกกวัฒนธรรมในมืดที่ 60 C ไม่คงปั่นป่วน สำหรับการเพาะปลูกเป็นประจำ 1% (w/v) ของ cellobiose (สำหรับthermocellum วัฒนธรรม cellulolytic C.) หรือกลูโคส (สำหรับการ noncellulolytic39E และ X 514) ถูกเพิ่มเป็นการหมักเท่านั้นพื้นผิวในกลางกำหนด จัดการงานวัฒนธรรมโดยโอน inoculum 1% ปานกลางสดหลังจากการหมักเสร็จ และหยุดการเจริญเติบโต เทคนิคการใช้อย่างเข้มงวดใช้การควบคุมการทดลองทั้งหมดกระบอกฉีดยาและเข็ม ใช้สำหรับเพิ่มพื้นผิว และการสุ่มตัวอย่าง ได้ล้าง ด้วย N2 ก่อนการใช้2.5. เซลลูโลสหมักการทดลองหมักเซลลูโลสถูกเริ่มต้น 1% (v/v)inoculum ของขั้นตอนการบันทึกวัฒนธรรม (OD600 0.5) ปลูก cellobioseหรือกลูโคส โมโนวัฒนธรรมได้ inoculated กับ C. thermocellumเท่านั้น เรียกว่าโมโน CT-วัฒนธรรม วัฒนธรรมร่วมได้ inoculatedสายพันธุ์ X 514 หรือ 39E นอกจาก C. thermocellum อ้างถึงเป็น CT - X 514 หรือ CT-39E ร่วมวัฒนธรรม ตามลำดับ ในการหมักทดลองเพื่อกำหนดบทบาทของ Thermoanaerobacter ไม่ใช่ cellulolyticสายพันธุ์ในหมักเซลลูโลส วัฒนธรรมร่วมได้ก่อตั้งขึ้น โดยแรกเริ่มต้นโมโนวัฒนธรรมของ C. thermocellum stepwiseตาม ด้วยการเพิ่มของสายพันธุ์ 39E หรือ 514 X เมื่อละลายน้ำมีสะสมน้ำตาล เมื่อจำเป็น ยีสต์สกัด 0.6% (w/v)ถูกเพิ่มปานกลางกำหนดระหว่างการเตรียมปานกลางในการทดลองหมักซึ่งเป็นวิตามินบี 12 ภายนอกเพิ่มสื่อที่กำหนด โซลูชั่นทางเลือกวิตามินทำ โดยไม่ใส่วิตามินบี 12 จากสูตร และใช้สำหรับการเตรียมสื่อกำหนดไว้ แตกต่างกันในเวลาต่อมาปริมาณของวิตามินบี 12 ถูกเพิ่มก่อน inoculation หมักทั้งหมดการทดลองดำเนินการใน triplicates2.6 การวิเคราะห์ขั้นตอนการตรวจสอบการผลิตหมักสิ้นสุดผลิตภัณฑ์ตัวอย่าง (1 mL) จากซุปวัฒนธรรมที่ถ่ายเป็นระยะ ๆทางเด

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

viously
อธิบาย (เขาและฟอร์ด, 2002) สื่อที่ได้รับการฆ่าเชื้อ
โดยการนึ่งฆ่าเชื้อต่อไปจ่ายลงในแก้วปิดผนึก
ตู้คอนเทนเนอร์ ทางออกที่ถูกเพิ่มวิตามินจาก anaerobic หมัน
โซลูชั่นหุ้นหลังจาก autoclaving.2.1 พื้นผิวเซลลูโลส
เพื่อให้สอดคล้องในการทดสอบของการหมักเซลลูโลส
เพียงใช้ได้ในเชิงพาณิชย์พื้นผิวจากเซลลูโลสเดียวกัน
การจัดส่งถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้ สองพื้นผิวเซลลูโลสผง
Avicel? และ Solka Floc ?, ได้รับการทดสอบในการศึกษานี้ Avicel
PH-101 ซื้อมาจาก Sigma-Aldrich Co. , เซนต์หลุยส์.
Solka Floc 200 ได้มาจากนานาชาติไฟเบอร์คอร์ปอเรชั่น
นอร์ทดา, New York.
2.2 จุลินทรีย์
Clostridium thermocellum (ATCC 35609) และ Thermoanaerobacter
ความเครียด pseudethanolicus 39E (ATCC 33323) ที่ได้รับจาก
ชาวอเมริกันประเภทวัฒนธรรมสะสม (ซาสเวอร์จิเนีย) Thermoanaerobacter
SP ความเครียด X514 ถูกแยกออกมาจากลึก
ใต้ผิวดินในลุ่มน้ำ Piceance โคโลราโด (ต้า et al., 2002) และมีการ
เก็บรักษาไว้ในคอลเลกชันวัฒนธรรมห้องปฏิบัติการของเรา สายพันธุ์ X514 ได้
รับการฝากที่ประเภทอเมริกันเก็บวัฒนธรรม (ATCC
BAA-938) ซี thermocellum เป็นเซลลูโลส (McBee, 1954); แต่สายพันธุ์
X514 และ 39E จะไม่สลายเซลลูโลสและหมักอย่างเคร่งครัด (ต้า
, et al., 2002;. Zeikus, et al, 1980).
2.3 การกำหนดขนาดกลางและการเตรียมการ
ที่กำหนดไว้กลางแบบไม่ใช้ออกซิเจนได้ถูกใช้ในการศึกษาครั้งนี้ตลอด
ไปตามสูตรที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (เขา et al., 2009)
กลางมีดังต่อไปนี้ (ต่อลิตร): 10.0 กรัมโซเดียมคลอไรด์, 0.5 G
? MgCl2 6H2O 0.2 กรัม KH2PO4 0.3 กรัม NH4Cl 0.3 กรัมโพแทสเซียมคลอไรด์, 0.015 กรัม
? CaCl2 2H2O, 1 มิลลิลิตรวิธีการแก้ธาตุ 1 มิลลิลิตรซีลีเนียมทังสเตน
วิธีการแก้ปัญหา . 10 การแก้ปัญหามลวิตามิน 2.52 กรัม NaHCO3 และ 0.05 มิลลิกรัม resazurin
การแก้ปัญหาธาตุมีดังต่อไปนี้ (ต่อลิตร):
1.5 กรัม FeCl2 4H2O 0.19 กรัม COCl2 6H2O, 0.1 กรัม MnCl2 4H2O 70 มิลลิกรัม?
ZnCl2, 6 มิลลิกรัม H3BO3, 36mg Na2MoO4? 2H2O 24 มิลลิกรัม NiCl2? 6H2O และ
2 มิลลิกรัม CuCl2? 2H2O วิธีการแก้ปัญหาซีลีเนียมทังสเตนมี
6mg Na2SeO3? 5H2O ต่อลิตร, 8 มิลลิกรัม Na2WO4? 2H2O ต่อลิตรและ
0.54 กรัมต่อลิตร NaOH วิธีการแก้ปัญหาวิตามินมีดังต่อไปนี้
(ต่อลิตร): 20 mg ไบโอติน 20 มก. กรดโฟลิค 100 มิลลิกรัมไพริดอกซิ
ไฮโดรคลอไร 50 มก riboflavin 50 วิตามินบีมก. 50 มก.
กรด nicotinic 50 มิลลิกรัมกรด pantothenic 1 มิลลิกรัมวิตามินบี 12, 50mg
P กรด -aminobenzoic และ 50 มิลลิกรัมกรด thioctic.
ค่า pH ของกลางที่ถูกปรับ 7.2 ± 0.1 โดยการล้างด้วย
การผสมก๊าซ / CO2 ไนโตรเจนที่ปราศจากออกซิเจน สภาวะไร้อากาศของ
กลางถูกเก็บรักษาไว้โดยนอกเหนือจากซัลไฟด์ (0.048 กรัม
Na2S? 9H2O) และ cysteine ​​(0.031 กรัม L-cysteine) เป็น reductants ไว้ก่อนหน้านี้
อธิบาย (เขาและฟอร์ด, 2002) สื่อที่ได้รับการฆ่าเชื้อ
โดยการนึ่งฆ่าเชื้อต่อไปจ่ายลงในแก้วปิดผนึก
ตู้คอนเทนเนอร์ ทางออกที่ถูกเพิ่มวิตามินจาก anaerobic หมัน
โซลูชั่นหุ้นหลังจาก autoclaving.
2.4 สภาวะการเจริญเติบโต
Stock วัฒนธรรมของแบคทีเรียทั้งหมดถูกเก็บไว้ใน 15% กลีเซอรอล
ที่? 80? C Inocula ได้จากการย่อย aliquots เลี้ยงของ
หุ้นแช่แข็งในขวดเซรั่ม 60 มลกับ 30 มิลลิลิตร degassed ต้ม
กลางปิดด้วยจุกยางบิวทิลและอลูมิเนียม
แมวน้ำ วัฒนธรรมที่ถูกบ่มในที่มืดที่ 60 องศาเซลเซียสโดยไม่ต้องคง
ปั่นป่วน สำหรับการเพาะปลูกประจำ, 1% (w / v) cellobiose (สำหรับ
วัฒนธรรมเซลลูซี thermocellum) หรือกลูโคส (สำหรับ noncellulolytic
39E และ X514) ถูกบันทึกว่าเป็นเพียงการหมัก
สารตั้งต้นในสื่อที่กำหนดไว้ วัฒนธรรมที่ใช้งานได้รับการดูแลโดย
โอนเชื้อ 1% ถึงกลางสดหลังจากหมัก
เสร็จสมบูรณ์และการเจริญเติบโตได้หยุด เทคนิคการใช้ออกซิเจนอย่างเข้มงวด
ถูกนำมาใช้ตลอดทั้งกิจวัตรการทดลองทั้งหมด.
เข็มฉีดยาสะอาดและเข็มที่ใช้สำหรับการเพิ่มพื้นผิวและ
การสุ่มตัวอย่างถูกล้างด้วย N2 ก่อนที่จะใช้.
2.5 เซลลูโลสหมัก
เซลลูโลสทดลองหมักถูกริเริ่มโดย 1% (v / v)
หัวเชื้อของวัฒนธรรมเข้าสู่ระบบเฟส (OD600? 0.5) ที่ปลูกใน cellobiose
หรือกลูโคส โมโนวัฒนธรรมถูกเชื้อกับซี thermocellum
เท่านั้นเรียกว่า CT โมโนวัฒนธรรม ร่วมวัฒนธรรมถูกเชื้อ
กับ X514 ความเครียดหรือ 39E นอกเหนือไปจากซี thermocellum เรียกว่า
เป็น CT-X514 หรือ CT-39E ร่วมวัฒนธรรมตามลำดับ ในการหมัก
การทดลองในการกำหนดบทบาทของที่ไม่ใช่เซลลูโลส Thermoanaerobacter
สายพันธุ์ในการหมักเซลลูโลสร่วมวัฒนธรรมได้รับการ
จัดตั้งขึ้นเป็นครั้งแรกโดยขั้นตอนการเริ่มต้นโมโนวัฒนธรรมของซี thermocellum
ตามด้วยนอกเหนือจากความเครียดหรือ 39E X514 เมื่อละลายน้ำ
น้ำตาลได้สะสม เมื่อมีความจำเป็นยีสต์สกัด 0.6% (w / v)
ถูกบันทึกอยู่ในสื่อที่กำหนดไว้ในระหว่างการเตรียมสื่อ.
ในการทดลองหมักที่วิตามินบี 12 จากภายนอกได้รับการ
เพิ่มขนาดกลางที่กำหนดไว้เป็นโซลูชั่นวิตามินทางเลือกที่
ถูกสร้างขึ้นมาโดยเลี่ยงวิตามินบี 12 จากสูตรและ ใช้สำหรับการ
เตรียมความพร้อมของกลางที่กำหนดไว้ที่ ต่อมาที่แตกต่างกัน
ปริมาณของวิตามินบี 12 ถูกเพิ่มเข้ามาก่อนที่จะฉีดวัคซีน ทั้งหมดหมัก
ทดลองดำเนินการใน triplicates.
2.6 การวิเคราะห์
ในการตรวจสอบการผลิตของผลิตภัณฑ์ที่สิ้นสุดการหมัก
ตัวอย่าง (1 มิลลิลิตร) จากน้ำซุปวัฒนธรรมถูกนำมาเป็นระยะ
ผ่าน