Four samples from different farms a

Four samples from different farms and municipalities in the
Belém area were selected to perform cloning and sequencing. The
fragments amplified by RT-PCR were cloned using the Invitrogen
TOPO TA Cloning Kit, according to the manufacturer’s protocol.
Approximately 5 L of the plasmid preparations containing the
inserted amplicons were used to transform competent E. coli DH5
cells by heat shock, and the transformed cells were plated on
Luria-Bertani medium (LB) plates containing ampicillin
(100 g/mL) plus IPTG (0.1 mM) and X-Gal (20 g/mL). The
recombinant colonies were identified based on the white color of
the colonies and then transferred to liquid LB medium containing
ampicillin (100 g/mL) and incubated at 37
◦
C for 12 h at 250 rpm.
The presence of recombinant colonies containing the target fragment was confirmed by PCR using the primers RD6F and RD6R.
These PCR products were purified for nucleotide sequencing using
the QIAquick@
PCR Purification Kit, following the protocol provided
by the manufacturer.
The nucleotide sequences were determined by sequencing with
the Big Dye Terminator Kit (Applied Biosystems) using the same
primers as those used for RT-PCR. Sequencing was conducted on
an ABI PRISM 3100 automatic sequencer (Applied Biosystems).

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่าง 4 จากฟาร์มต่าง ๆ และเทศบาลในการตั้ง Belém ถูกเลือกทำการโคลนและการลำดับ การชิ้นส่วนที่ถูกขยาย โดย RT-PCR ถูกโคลนโดยใช้การ Invitrogenภูมิประเทศได้ TA Cloning ชุด ตามโพรโทคอลผู้ผลิตประมาณ 5 ลิตรของที่ plasmid ที่ประกอบด้วยการเตรียมการใช้แทรก amplicons เพื่อแปลงอำนาจ E. coli DH5เซลล์ โดยการช็อกความร้อน และรับการเปลี่ยนแปลงเซลล์ถูกชุบบนมีโกคอแผ่นปานกลาง Luria-Bertani (ปอนด์)(กรัม/มิลลิลิตร) IPTG (0.1 mM) และ X-Gal (20 g/mL) การอิงจากสีขาวของอาณานิคม recombinant ถูกระบุอาณานิคม และการ โอนย้ายการเหลว LB ขนาดกลางที่ประกอบด้วยโกคอ (100 กรัม/มิลลิลิตร) และรับการกกน.◦C เป็นเวลา 12 ชม.ที่ 250 rpmการปรากฏตัวของ recombinant อาณานิคมที่ประกอบด้วยส่วนเป้าหมายได้รับการยืนยัน โดย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์ RD6F และ RD6Rผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์สำหรับการใช้ลำดับของนิวคลีโอไทด์QIAquick @ชุดฟอก PCR โพรโทคอลมีดังต่อไปนี้โดยผู้ผลิตลำดับนิวคลีโอไทด์ที่ถูกกำหนด โดยลำดับด้วยใหญ่ย้อมเทอร์มิเนเตอร์ชุด (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ) ใช้เหมือนกันไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ RT-PCR ลำดับวิธีการใช้การ ABI ปริซึม 3100 อัตโนมัติซีเควนเซอร์ (ใช้ศาสตร์เชิงชีวภาพ)

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

สี่ตัวอย่างจากฟาร์มที่แตกต่างกันและเทศบาลใน
พื้นที่Belémได้รับการคัดเลือกในการดำเนินการโคลนและการเรียงลำดับ
เศษขยายโดย RT-PCR ถูกโคลนใช้ Invitrogen
TOPO TA โคลนชุดตามโปรโตคอลของผู้ผลิต.
ประมาณ 5? L ของการเตรียมพลาสมิดที่มี
แอมพลิคอนแทรกถูกนำมาใช้ในการแปลงอำนาจ E. coli DH5?
เซลล์โดยช็อตความร้อน และเซลล์เปลี่ยนที่ถูกชุบบน
กลาง Luria-Bertani (ปอนด์) แผ่นที่มี ampicillin
(100 g / ml) บวก IPTG (0.1 มิลลิเมตร) และ X-Gal (20? g / ml)
อาณานิคม recombinant ถูกระบุขึ้นอยู่กับสีขาวของ
อาณานิคมแล้วโอนไปยังของเหลว LB ขนาดกลางที่มี
ampicillin (100 g / ml) และบ่มที่ 37
◦
C เป็นเวลา 12 ชั่วโมงที่ 250 รอบต่อนาที.
การปรากฏตัวของอาณานิคม recombinant ที่มีเป้าหมาย ชิ้นส่วนได้รับการยืนยันโดยวิธี PCR โดยใช้ RD6F ไพรเมอร์และ RD6R.
ผลิตภัณฑ์พีซีอาร์เหล่านี้ถูกทำให้บริสุทธิ์สำหรับลำดับเบสที่ใช้
QIAquick @
Kit บริสุทธิ์ PCR ตามโปรโตคอลที่ให้ไว้
โดยผู้ผลิต.
ลำดับเบสที่ได้รับการพิจารณาโดยลำดับด้วย
ชุดบิ๊กย้อม Terminator ( Applied Biosystems) โดยใช้เดียวกัน
ไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับ RT-PCR การเรียงลำดับได้ดำเนินการใน
ABI PRISM 3100 ซีเควนอัตโนมัติ (Applied Biosystems)

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สี่ตัวอย่างจากฟาร์มที่แตกต่างกัน และเทศบาลในM éเบลถูกเลือกเพื่อแสดงพื้นที่การดำเนินงานการผลิต ที่ชิ้นส่วนขยายโดย RT-PCR ทำการโคลนใช้ Invitrogenสถานที่ทาโคลนชุด ตามขั้นตอนของผู้ผลิตประมาณ 5 ลิตร ในการเตรียมบรรจุพลาสมิดแทรก amplicons ใช้ E . coli DH5 แปลงความสามารถเซลล์โดยช็อกความร้อนและเปลี่ยนเซลล์มีการชุบในลุเรียแบร์ตานิขนาดกลาง ( ปอนด์ ) แผ่นที่มีแอมพิซิลลิน( 100 กรัม / มิลลิลิตร ) และโปรตีน ( 0.1 มิลลิเมตร ) และ x-gal ( 20 กรัม / มิลลิลิตร ) ที่รีคอมบิแนนท์อาณานิคมถูกระบุตามสีขาวสีอาณานิคมและจากนั้นโอนไปยังของเหลวที่มีปริมาณปานกลางแอมพิซิลิน ( 100 กรัม / มิลลิลิตร ) และบ่มที่ 37◦องศาเซลเซียส เป็นเวลา 12 ชั่วโมง ที่ 250 รอบต่อนาทีการปรากฏตัวของอาณานิคมของยีนที่มีส่วนเป้าหมายได้รับการยืนยันโดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์และ rd6f rd6r .ผลิตภัณฑ์ PCR นี้บริสุทธิ์สำหรับลำดับนิวคลีโอไทด์โดยใช้การ qiaquick @ชุดบำบัดน้ำเสีย ตรวจตามขั้นตอนให้โดยผู้ผลิตยีนที่ถูกกำหนดโดยลำดับลำดับกับใหญ่สี Terminator Kit ( Applied Biosystems ) ใช้เหมือนไพรเมอร์ที่ใช้นี้ ดำเนินการในลำดับเป็นซีเควน ABI ปริซึม 3100 อัตโนมัติ ( Applied Biosystems )