Leydig Cell Quantification, Isolati

Leydig Cell Quantification, Isolation and Culture
Leydig cells were isolated by a combination of Percoll and BSA density gradient centrifugations, as previously described [21]. Briefly, the testes were decapsulated and digested in a dissociation buffer (M-199 medium with 2.2 g/l HEPES, 1.0 g/l BSA, 2.2 g/l sodium bicarbonate) containing collagenase I (0.5 g/l) at 34°C with slow shaking (90 cycles/min, 30 minutes). To separate the interstitial cells from the seminiferous tubules, digested testes were mixed with M199 containing 10% BSA so the final concentration of BSA reached 1%. The mixed solution containing digested cells and tissue was incubated for 1 minute to separate single cells and small cell clusters from large seminiferous tubules. The supernatant was transferred into 15 ml centrifuge tubes (Sarstedt Inc, Newton, NC; #62.554.002), and the cells were pelleted by centrifugation (250 x g, 5 min). The pellet was resuspended in 5 ml of Percoll separation solution (55% Percoll in Hank’s Balance salts solution with 1.5 mM HEPES and 0.025% BSA) and transferred to an Oakridge centrifuge tubes (#05-563-2C). After adding 30 ml Percoll separation solution to the tube and mixing, the tube was centrifuged (27,000 x g, 60 min) at 4 C to generate a continuous density gradient. A fraction containing Leydig cells (about 10 ml) was collected from the gradient layer that was heavier than 1.068 g/ml density. The Leydig cell fraction was transferred into a 50 ml centrifuge tube, diluted with DMEM/F12 medium and pelleted by centrifugation (250 x g, 5 min). The pellet was then dissolved in 1 ml DMEM/F12 medium and layered on top of a BSA separation gradient formed in a 15-ml tube (containing 3 ml each of, top to bottom, 2.5%, 5%, 10% BSA in DMEM/F12 medium). The tube was centrifuged at 4 C (50 x g, 10 min). The pellet was suspended and washed in 5 ml DMEM/F12 medium and centrifuged (250 x g, 5 min). The final cell pellet was resuspended in 0.5 ml M-199 culture medium and counted. The final purity of the Leydig cells, determined by staining the cells for 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) activity, was consistently about 90% [20].

Freshly isolated Leydig cells were suspended in M-199 culture media (0.1% BSA), plated in 96-well culture plates (about 104 cells/well), and incubated for 2h at 34°C with steroidogenesis effectors bovine LH (0.5 ng/ml and 10 ng/ml), dbcAMP (1 mM), 22-hydroxycholesterol (25 μM), or pregnenolone (25 μM). After incubation, cells plus medium were frozen on dry ice and then stored at −80°C for testosterone assay by RIA.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

นับเซลล์ Leydig แยก และวัฒนธรรมLeydig cells were isolated by a combination of Percoll and BSA density gradient centrifugations, as previously described [21]. Briefly, the testes were decapsulated and digested in a dissociation buffer (M-199 medium with 2.2 g/l HEPES, 1.0 g/l BSA, 2.2 g/l sodium bicarbonate) containing collagenase I (0.5 g/l) at 34°C with slow shaking (90 cycles/min, 30 minutes). To separate the interstitial cells from the seminiferous tubules, digested testes were mixed with M199 containing 10% BSA so the final concentration of BSA reached 1%. The mixed solution containing digested cells and tissue was incubated for 1 minute to separate single cells and small cell clusters from large seminiferous tubules. The supernatant was transferred into 15 ml centrifuge tubes (Sarstedt Inc, Newton, NC; #62.554.002), and the cells were pelleted by centrifugation (250 x g, 5 min). The pellet was resuspended in 5 ml of Percoll separation solution (55% Percoll in Hank’s Balance salts solution with 1.5 mM HEPES and 0.025% BSA) and transferred to an Oakridge centrifuge tubes (#05-563-2C). After adding 30 ml Percoll separation solution to the tube and mixing, the tube was centrifuged (27,000 x g, 60 min) at 4 C to generate a continuous density gradient. A fraction containing Leydig cells (about 10 ml) was collected from the gradient layer that was heavier than 1.068 g/ml density. The Leydig cell fraction was transferred into a 50 ml centrifuge tube, diluted with DMEM/F12 medium and pelleted by centrifugation (250 x g, 5 min). The pellet was then dissolved in 1 ml DMEM/F12 medium and layered on top of a BSA separation gradient formed in a 15-ml tube (containing 3 ml each of, top to bottom, 2.5%, 5%, 10% BSA in DMEM/F12 medium). The tube was centrifuged at 4 C (50 x g, 10 min). The pellet was suspended and washed in 5 ml DMEM/F12 medium and centrifuged (250 x g, 5 min). The final cell pellet was resuspended in 0.5 ml M-199 culture medium and counted. The final purity of the Leydig cells, determined by staining the cells for 3β-hydroxysteroid dehydrogenase (3β-HSD) activity, was consistently about 90% [20].Freshly isolated Leydig cells were suspended in M-199 culture media (0.1% BSA), plated in 96-well culture plates (about 104 cells/well), and incubated for 2h at 34°C with steroidogenesis effectors bovine LH (0.5 ng/ml and 10 ng/ml), dbcAMP (1 mM), 22-hydroxycholesterol (25 μM), or pregnenolone (25 μM). After incubation, cells plus medium were frozen on dry ice and then stored at −80°C for testosterone assay by RIA.

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Leydig ปริมาณเซลล์แยกและเพาะเลี้ยง
เซลล์ Leydig ที่แยกได้จากการรวมกันของบีเอสเอและ Percoll centrifugations ไล่ระดับความหนาแน่นตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [21] สั้น ๆ , อัณฑะถูกฟอกเปลือกทำการและย่อยแยกออกจากกันในบัฟเฟอร์ (กลาง M-199 กับ 2.2 g / l HEPES 1.0 g / l BSA 2.2 g / l โซเดียมไบคาร์บอเนต) ที่มีคอลลาฉัน (0.5 g / l) ที่ 34 ° C กับสั่นช้า (90 รอบ / นาที, 30 นาที) ที่จะแยกเซลล์สิ่งของจากหลอดสร้างอสุจิ, อัณฑะย่อยถูกผสมกับบีเอสเอ M199 ที่มี 10% ดังนั้นความเข้มข้นสุดท้ายของบีเอสเอถึง 1% วิธีการแก้ปัญหาที่มีการผสมเซลล์ย่อยและเนื้อเยื่อที่ถูกบ่มเป็นเวลา 1 นาทีในการแยกเซลล์เดียวและกลุ่มเซลล์เล็ก ๆ จากหลอดสร้างอสุจิที่มีขนาดใหญ่ ใสถูกย้ายเป็น 15 มล. หลอดหมุนเหวี่ยง (ซาร์สเต็ดท์ Inc, นิวตัน, NC; # 62.554.002) และเซลล์ที่ถูกเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยง (250 XG 5 นาที) เม็ดถูก resuspended ใน 5 มล. ของการแก้ปัญหาการแยก Percoll (55% Percoll ในยอดแฮงค์โซลูชั่นเกลือกับ 1.5 มิลลิ HEPES และ 0.025% BSA) และโอนไปยังหลอด centrifuge โอกริดจ์ (# 05-563-2C) หลังจากเพิ่ม 30 มล Percoll วิธีการแก้ปัญหาที่จะแยกหลอดและผสมหลอดถูกหมุนเหวี่ยง (27,000 XG 60 นาที) ที่ 4 C ในการสร้างความหนาแน่นของการไล่ระดับสีอย่างต่อเนื่อง ส่วนที่มีเซลล์ Leydig (ประมาณ 10 มล.) ที่ถูกเก็บรวบรวมจากชั้นไล่ระดับสีที่หนักกว่า 1.068 g / ml ความหนาแน่น ส่วนเซลล์ Leydig ถูกย้ายลงในหลอด centrifuge 50 มล. เจือจางกับสื่อ DMEM / F12 และเม็ดโดยการหมุนเหวี่ยง (250 XG 5 นาที) เม็ดก็เลือนหายไปแล้วใน 1 มิลลิลิตร DMEM / F12 กลางและชั้นบนของบีเอสเอลาดแยกที่เกิดขึ้นในหลอด 15 มล. (ที่มี 3 มล. แต่ละบนลงล่าง, 2.5%, 5%, 10% บีเอสเอใน DMEM กลาง / F12) หลอดถูกหมุนเหวี่ยงที่ 4 C (50 XG 10 นาที) เม็ดถูกระงับและล้างใน 5 มล. DMEM / F12 ขนาดกลางและหมุนเหวี่ยง (250 XG 5 นาที) ตะกอนเซลล์สุดท้ายที่ถูก resuspended ใน 0.5 มล. M-199 สื่อวัฒนธรรมและการนับ ความบริสุทธิ์สุดท้ายของเซลล์ Leydig กำหนดโดยการย้อมสีเซลล์สำหรับ dehydrogenase 3β-hydroxysteroid (HSD-3β) กิจกรรมเป็นอย่างต่อเนื่องประมาณ 90% [20]. สดแยกเซลล์ Leydig ถูกระงับในสื่อวัฒนธรรม M-199 (0.1% บีเอสเอ ) ในแผ่นชุบวัฒนธรรม 96 หลุม (ประมาณ 104 เซลล์ / ดี) และบ่มเป็นเวลา 2 ชั่วโมง 34 ° C มีเอฟเฟค steroidogenesis วัว LH (0.5 ng / ml และ 10 ng / ml) dbcAMP (1 มิลลิเมตร) 22- hydroxycholesterol (25 ไมครอน) หรือ Pregnenolone (25 ไมครอน) หลังจากการบ่มเซลล์บวกกลางถูกแช่แข็งบนน้ำแข็งแห้งและเก็บไว้ที่ -80 องศาเซลเซียสทดสอบฮอร์โมนเพศชายโดย RIA

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ปริมาณเซลล์ลัยดิก แยกเซลล์ลัยดิกวัฒนธรรม
ถูกแยกโดยการรวมกันของ percoll BSA ความหนาแน่นและการ centrifugations ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ [ 21 ] สั้น ๆ , ตัว decapsulated และย่อยในการบัฟเฟอร์ ( m-199 กลางกับ 2.2 กรัม / ลิตรฮีเปส , 1.0 กรัม / ลิตร ( 2.2 g / L โซเดียมไบคาร์บอเนตผสมคอลลาเจน ( 05 g / L ) ที่ 34 องศา C ช้าสั่น ( 90 รอบ / นาที และ 30 นาที ) การแยกเซลล์ interstitial จากท่ออัณฑะผสมกับแป้งตัวเปรียบเทียบที่ 10% ( ดังนั้นความเข้มข้นสุดท้ายหากถึง 100 เปอร์เซ็นต์ ผสมสารละลายที่มีย่อยเซลล์และเนื้อเยื่อถูกบ่มเป็นเวลา 1 นาที เพื่อแยกเซลล์และกลุ่มเซลล์เล็ก ๆจากท่ออัณฑะขนาดใหญ่และน่าน ถูกโอนเข้า 15 ml หลอดปั่นเหวี่ยง ( Sarstedt Inc , นิวตัน , NC ; # 62.554.002 ) และเซลล์มีเม็ดโดยการเหวี่ยงแยก ( 250 x G , 5 นาที ) เม็ดเป็น resuspended 5 มิลลิลิตรของสารละลายแยก percoll ( 55% percoll ในแฮงก์สมดุลสารละลายที่มีเกลือ 1.5 มม. และฮีเปส 0.025% BSA ) และย้ายไป Oakridge ขายขาด ( # 05-563-2c )หลังเติม 30 ml percoll แยกแก้ปัญหาท่อและการผสม , ท่อไฟฟ้า ( 27 , 000 x g , 60 นาที ) ที่อุณหภูมิ 4 องศาเซลเซียส เพื่อสร้างการไล่ระดับความหนาแน่น อย่างต่อเนื่อง เศษส่วนที่มี cells ( 10 ml ) เก็บรวบรวมข้อมูลจากการไล่ระดับสีเลเยอร์ที่หนักกว่า 1.068 กรัม / มิลลิลิตรความหนาแน่น ที่เซลล์ลัยดิกเศษส่วนถูกถ่ายโอนลงใน 50 ml centrifuge หลอดเจือจางด้วย dmem / F12 กลางและเม็ดโดยการเหวี่ยงแยก ( 250 x G , 5 นาที ) เม็ดแล้วละลายใน dmem / F12 ขนาดกลาง และชั้นบนของ BSA แยกลาดเกิดขึ้นใน 15 หลอด 1 มิลลิลิตร ( มล. บรรจุ 3 ml แต่ละด้านบนกับด้านล่าง , 2.5% , 5% , 10% ใน dmem / F12 ( ขนาดกลาง ) หลอดเป็นระดับที่ 4 C ( 50 x G 10 นาที )เม็ด ถูกพักงาน และล้างใน 5 ml dmem / F12 ปานกลางและระดับ ( 250 x G , 5 นาที ) เม็ดเซลล์สุดท้ายใน resuspended 0.5 ml m-199 วัฒนธรรมสื่อและนับ ความบริสุทธิ์สุดท้ายของเซลล์ลัยดิก กำหนดโดยการย้อมเซลล์ 3 hydroxysteroid บีตา - ดีไฮโดรจีเนส ( 3 บีตา - HSD ) กิจกรรมต่อเนื่องเป็นประมาณ 90%

[ 20 ]แยกสด cells ถูกระงับในอาหารเลี้ยงเชื้อ m-199 ( 0.1 % BSA ) ชุบ 96 ดีวัฒนธรรมแผ่น ( ประมาณ 104 เซลล์ / ดี ) โดยสำหรับ 2H ที่ 34 องศา C steroidogenesis อีกครั้งหนึ่งและ LH ( 0.5 ng / ml และ 10 ng / ml ) dbcamp ( 1 เดือน 22 hydroxycholesterol ( ) 25 μ M ) หรือเพรกนีโนโลน ( 25 μ M ) หลังจากระยะเวลาเซลล์ที่ถูกแช่แข็งในน้ำแข็งบวกปานกลาง แห้งแล้วเก็บไว้ที่ 80 ° C ( −ฮอร์โมนเทสโทสเตอโรนโดยวิธี .