We hypothesized that the thermal st

We hypothesized that the thermal stability of Moloney murine leukaemia virus reverse transcriptase (MMLV RT) will increase with increases in its ability to bind with a template–primer (T/P). To test this hypothesis, we introduced positive charges into MMLV RT by site-directed mutagensis at positions that have been implicated in the interaction with T/P. Thirty-six variants were constructed in which one of the twelve residues (Glu69, Gln84, Asp108, Asp114, Glu117, Glu123, Asp124, Glu286, Glu302, Trp313, Leu435, and Asn454) was replaced with Lys, Arg, or Ala, and these were expressed in Escherichia coli. In about half of these 36 variants, thermal inactivation at 50 °C was reduced in the presence of the T/P, which suggested that this strategy was effective at stabilizing MMLV RT. We next combined three of the 36 mutations, Glu286 → Ala, Glu302 → Lys, and Leu435 → Arg, and the mutation, Asp524 → Ala, which is known to abolish the RNase H activity and increase the stability. Temperatures of 54 and 56 °C reduced the initial reverse transcription activity by 50% over a 10-min incubation in the triple variant E286R/E302K/L435R and quadruple variant E286R/E302K/L435R/D524A, respectively. These temperatures were higher than that observed for WT (45 °C). The highest temperature at which the triple and quadruple variants exhibited cDNA synthesis activity was 60 °C, which was again higher than for WT (54 °C). Thus, highly stable MMLV RT variants were generated by this mutation strategy.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

เราตั้งสมมติฐานว่าที่มั่นคงความร้อนของ Moloney murine leukaemia ไวรัสกลับ transcriptase (MMLV RT) จะเพิ่มกับเพิ่มความสามารถในการผูกกับตัวแม่ – พื้น (T/P) การทดสอบสมมติฐานนี้ เราแนะนำบวกค่าธรรมเนียมเป็น MMLV RT โดยตรงเว็บไซต์ mutagensis ที่ตำแหน่งที่มีการเกี่ยวข้องในการโต้ตอบกับ T/P. สามสิบ - หกตัวแปรถูกสร้างซึ่งตกสิบสอง (Glu69, Gln84, Asp108, Asp114, Glu117, Glu123, Asp124, Glu286, Glu302, Trp313, Leu435 และ Asn454) อย่างใดอย่างหนึ่งถูกแทนที่ ด้วย Lys อาร์กิวเมนต์ของค่า หรืออลา และเหล่านี้ถูกแสดงใน Escherichia coli ประมาณครึ่งหนึ่งของตัวแปรเหล่านี้ 36 ยกเลิกการเรียกความร้อนที่ 50 ° C ลดลงในต่อหน้าของ T/P ซึ่งแนะนำว่า กลยุทธ์นี้คือประสิทธิภาพที่ stabilizing MMLV RT. เราถัดไปรวมสามกลายพันธุ์ 36, Glu286 →อลา Glu302 → Lys และ Leu435 →อาร์กิวเมนต์ของค่า และกลาย พันธุ์ Asp524 →อลา ซึ่งเป็นที่รู้จักเพื่อยุบกิจกรรม RNase H และเพิ่มความมั่นคง อุณหภูมิของ 54 และ 56 ° C ลดลงกิจกรรมการ transcription เริ่มกลับ 50% ผ่าน 10 นาทีฟักตัวในสามตัวแปร E286R/E302K/L435R และตัวแปรควอด E286R/E302K/L435R/D524A ตามลำดับ อุณหภูมิเหล่านี้สูงกว่าที่พบใน WT (45 ° C) ได้ อุณหภูมิสูงสุดที่ตัวแปรสาม และควอดจัดแสดงกิจกรรมการสังเคราะห์ cDNA 60 ° C ซึ่งเป็นอีกสูงกว่าสำหรับ WT (54 ° C) ดัง มีสร้างตัวแปร MMLV RT มีเสถียรภาพสูง โดยกลยุทธ์นี้กลายพันธุ์

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

เราตั้งสมมติฐานว่าเสถียรภาพทางความร้อนของเชื้อไวรัสโรคมะเร็งเม็ดเลือดขาวโมโลนีย์หมา transcriptase ย้อนกลับ (MMLV RT) จะเพิ่มขึ้นด้วยการเพิ่มขึ้นของความสามารถในการผูกกับแม่แบบไพรเมอร์ (T / P) เพื่อทดสอบสมมติฐานนี้เราแนะนำประจุบวกเข้าไปใน MMLV RT โดย mutagensis เว็บไซต์กำกับที่ตำแหน่งที่ได้รับการที่เกี่ยวข้องในการมีปฏิสัมพันธ์กับ T / P สายพันธุ์สามสิบหกถูกสร้างขึ้นในที่หนึ่งในสิบสองตกค้าง (Glu69, Gln84, Asp108, Asp114, Glu117, Glu123, Asp124, Glu286, Glu302, Trp313, Leu435 และ Asn454) ถูกแทนที่ด้วยลิซหาเรื่องหรือ Ala และ เหล่านี้ถูกแสดงในเชื้อ Escherichia coli ในประมาณครึ่งหนึ่งของเหล่านี้ 36 สายพันธุ์, พลังความร้อนที่ 50 องศาเซลเซียสลดลงในการปรากฏตัวของ T / P ซึ่งชี้ให้เห็นว่ากลยุทธ์นี้มีประสิทธิภาพในการรักษาเสถียรภาพ MMLV RT ต่อไปเรามารวมกันที่สามของการกลายพันธุ์ 36, Glu286 → Ala, Glu302 →ลิซและ Leu435 → Arg และการกลายพันธุ์, Asp524 → Ala ซึ่งเป็นที่รู้จักกันที่จะยกเลิกกิจกรรม RNase H และเพิ่มความมั่นคง อุณหภูมิ 54 และ 56 องศาเซลเซียสลดลงกิจกรรมการถอดรหัสย้อนกลับเริ่มต้นจาก 50% ในช่วงการบ่ม 10 นาทีในตัวแปรสาม E286R / E302K / L435R และตัวแปรที่สี่ E286R / E302K / L435R / D524A ตามลำดับ อุณหภูมิเหล่านี้สูงกว่าที่พบสำหรับ WT (45 ° C) อุณหภูมิสูงสุดที่สายพันธุ์ที่สามและสี่การจัดแสดงกิจกรรมการสังเคราะห์ยีนเป็น 60 องศาเซลเซียสซึ่งเป็นอีกครั้งสูงกว่า WT (54 ° C) ดังนั้น MMLV มีความเสถียรสูงสายพันธุ์ RT ที่ถูกสร้างขึ้นโดยกลยุทธ์การกลายพันธุ์นี้

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

เราตั้งสมมุติฐานว่า เสถียรภาพทางความร้อนของเมอโลนีย์ ~ ลูคีเมียไวรัส reverse transcriptase ( mmlv RT ) จะเพิ่มขึ้นด้วยการเพิ่มของความสามารถในการผูกกับแม่แบบและไพรเมอร์ ( T / P ) เพื่อทดสอบสมมุติฐานนี้ เราแนะนำบวกค่าบริการใน mmlv RT โดยเว็บไซต์ mutagensis กำกับที่ตำแหน่งที่ถูกพาดพิงในการปฏิสัมพันธ์กับ T / Pสามสิบหกตัวแปรที่ผู้วิจัยได้สร้างขึ้น ซึ่งหนึ่งในสิบสองตกค้าง ( glu69 gln84 asp108 asp114 , , , , glu117 glu123 asp124 glu286 , , , , trp313 glu302 , , leu435 และ asn454 ) ถูกแทนที่ด้วย . , ไม่ดี หรือ เอ๋ และเหล่านี้ได้ถูกแสดงใน Escherichia coli ในประมาณครึ่งหนึ่งของเหล่านี้ 36 สายพันธุ์ ความร้อนทำให้อุณหภูมิ 50 องศา C ลดลงต่อหน้า T / Pซึ่งชี้ให้เห็นว่ากลยุทธ์นี้มีประสิทธิภาพที่คงที่ mmlv RT . เราต่อไปรวมสามของการกลายพันธุ์ที่ 36 , glu286 → keyboard - key - name ala , glu302 → keyboard - key - name . และ leu435 → keyboard - key - name arg และการกลายพันธุ์ , asp524 → keyboard - key - name ALA ซึ่งเป็นที่รู้จักที่จะยกเลิกกิจกรรมเลส H และเพิ่มความมั่นคง54 และ 56 องศา C อุณหภูมิลดเริ่มต้นย้อนกลับถอดความกิจกรรม 50% กว่า 10 นาทีบ่มในตัวแปรสามตัวแปร l435r e286r / e302k / และสี่ e286r / e302k / l435r / d524a ตามลำดับ อุณหภูมิเหล่านี้สูงกว่าที่สังเกตสำหรับ WT ( 45 ° C ) อุณหภูมิสูงสุดที่แปรสามและสี่มีกิจกรรมการสังเคราะห์ cDNA 60 ° Cซึ่งเป็นอีกครั้งที่ที่สูงกว่า WT ( 54 ° C ) ดังนั้น จึงมีเสถียรภาพสูง mmlv RT ตัวแปรถูกสร้างขึ้นโดยกลยุทธ์นี้กลายพันธุ์