DNA manipulation, PCR, and nucleoti

DNA manipulation, PCR, and nucleotide sequencing. Because most ESBL
genes were shown to be plasmid mediated, plasmid DNA was extracted and
purified using the Nucleospin Plasmid kit (Macherey-Nagel, Du¨ren, Germany).
PCR amplification of bla genes, including blaTEM, blaSHV, blaCTX-M, blaVEB,
blaOXA, blaPER, and blaGES, was performed with Taq DNA polymerase (Invitrogen,
Carlsbad, CA) using primers listed in Table 1. PCR detection of blaOXA was
focused on the blaOXA-2 and blaOXA-10 groups, whose derivatives have shown
ESBL characteristics. The PCRs were conducted in a GeneAmp PCR system
9600 (Perkin-Elmer, Norwalk, CT) under the conditions specified in the reference
sources (Table 1). Detection of IS elements in the upstream region of
blaCTX-M was performed for all isolates carrying blaCTX-M by PCR using primers
and conditions described previously (20, 34). All PCR amplicons were verified by
gel electrophoresis on a 2.0% (wt/vol) SeaKem LE agarose gel (FMC Bio
Products, Rockland, ME). The gels were stained with ethidium bromide (0.5 g/ml).
Purifications of PCR amplicons were carried out by using a Nucleospin Extract
II kit (Macherey-Nagel). PCR products of bla genes and IS elements were
subjected to bidirectional nucleotide sequencing using PCR primers to determine
their molecular types. DNA sequences were analyzed with the 3100 Genetic
Analyzer (Applied Biosystems, Foster City, CA) according to the manufacturer’s
recommendations.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

จัดการดีเอ็นเอ PCR และลำดับของนิวคลีโอไทด์ เพราะ ESBL ส่วนใหญ่ยีนที่ถูกแสดงเป็น plasmid mediated ถูกสกัด plasmid DNA และบริสุทธิ์ใช้ชุด Nucleospin Plasmid (Macherey Nagel, Du¨ren เยอรมนี)ขยาย PCR ของยีน bla รวม blaTEM, blaSHV, blaCTX M, blaVEBทำกับ Taq DNA พอลิเมอเรส (Invitrogen, blaOXA, blaPER และ blaGESคาร์ลส CA) ใช้ไพรเมอร์แสดงในตารางที่ 1 ตรวจ PCR blaOXA ถูกblaOXA-2 และ blaOXA 10 กลุ่ม มีแสดงตราสารอนุพันธ์มุ่งเน้นESBL ลักษณะ PCRs ได้ดำเนินการในระบบ GeneAmp PCR9600 (เอลเมอเพอร์ Norwalk, CT) ภายใต้เงื่อนไขที่ระบุในการอ้างอิงแหล่ง (ตารางที่ 1) ตรวจสอบองค์ประกอบ IS ในภูมิภาคขั้นต้นน้ำblaCTX M ทำการแยกทั้งหมดแบก blaCTX M โดย PCR ที่ใช้ไพรเมอร์และเงื่อนไขที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (20, 34) Amplicons PCR ทั้งหมดถูกตรวจสอบโดยเจ electrophoresis ใน 2.0% (wt/vol) เจ agarose เลอ SeaKem (FMC Bioผลิตภัณฑ์ Rockland, ME) เจมีสีกับโบรไมด์ ethidium (0.5 g/ml)Purifications PCR amplicons ได้ดำเนินการโดยแยก Nucleospinชุด II (Macherey-Nagel) ผลิตภัณฑ์ PCR ยีน bla และองค์ประกอบของ ISการจัดลำดับนิวคลีโอไทด์สองทิศทางโดยใช้ไพรเมอร์ PCR เพื่อตรวจสอบชนิดของโมเลกุล มีวิเคราะห์ลำดับดีเอ็นเอกับพันธุ 3100วิเคราะห์ (Biosystems ใช้ ฟอสเตอร์ซิตี้ CA) ตามของผู้ผลิตคำแนะนำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

การจัดการดีเอ็นเอ PCR และลำดับเบส เพราะส่วนใหญ่ ESBL
ยีนที่มีการแสดงที่จะเป็นสื่อกลางพลาสมิดดีเอ็นเอพลาสมิดถูกสกัดและ
ทำให้บริสุทธิ์โดยใช้ Nucleospin ชุดพลาสมิด (Macherey-แจคกี้ Duren, เยอรมนี).
ขยาย PCR ของยีน bla รวมทั้ง blaTEM, blaSHV โดย, blaCTX-M blaVEB ,
blaOXA, blaPER และ blaGES ได้รับการดำเนินการกับโพลิเมอร์ Taq DNA (Invitrogen,
Carlsbad, CA) โดยใช้ไพรเมอร์ที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 การตรวจสอบของ PCR blaOXA ได้รับการ
มุ่งเน้นไปที่ blaOXA-2 และกลุ่ม blaOXA-10 ซึ่งสัญญาซื้อขายล่วงหน้าได้แสดงให้เห็น
ESBL ลักษณะ PCRs ได้ดำเนินการในระบบ PCR GeneAmp
9600 (เพอร์กินเอลเมอวอล์ค, CT) ภายใต้เงื่อนไขที่ระบุไว้ในการอ้างอิง
แหล่งที่มา (ตารางที่ 1) การตรวจสอบขององค์ประกอบในภูมิภาคเหนือ
blaCTX-M ได้ดำเนินการทั้งหมดแยกแบก blaCTX-M โดยวิธี PCR โดยใช้ไพรเมอร์
และเงื่อนไขที่อธิบายไว้ก่อนหน้า (20, 34) ทั้งหมด amplicons PCR ถูกตรวจสอบโดย
ข่าวคราวเกี่ยวกับ 2.0% (น้ำหนัก / ปริมาตร) SeaKem LE agarose เจล (เอฟเอ็มไบโอ
โปรดักส์ร็อกแลนด์, ME) เจลที่ถูกย้อมด้วย ethidium bromide (0.5? g / ml).
บริสุทธิ์ของ amplicons PCR ได้ดำเนินการโดยใช้สารสกัดจาก Nucleospin
สองชุด (Macherey-แจคกี้) ผลิตภัณฑ์ PCR ของยีน bla และเป็นองค์ประกอบที่ถูก
ยัดเยียดให้ลำดับเบสแบบสองทิศทางโดยใช้ไพรเมอร์ PCR เพื่อตรวจสอบ
ชนิดโมเลกุลของพวกเขา ดีเอ็นเอถูกนำมาวิเคราะห์ด้วย 3100 ทางพันธุกรรม
วิเคราะห์ (Applied Biosystems, ฟอสเตอร์ซิตี, แคลิฟอร์เนีย) ตามที่ผู้ผลิต
ให้คำแนะนำ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

การจัดการ , เทคนิคดีเอ็นเอและลำดับนิวคลีโอไทด์ . เพราะ esbl
ส่วนใหญ่เป็นพลาสมิดดีเอ็นเอผ่านพลาสมิดดีเอ็นเอบริสุทธิ์โดยใช้พลาสมิดและ
nucleospin Kit ( macherey เนเกิล ดูตั้งเรน , เยอรมนี ) .
PCR แบบบลายีน รวมทั้ง blatem blashv blactx-m blaveb , , , ,
blaoxa blaper , และ blages ถูกดำเนินการกับดีเอ็นเอพอลิเมอเรสทัค ( Invitrogen
, คาร์ลสแบดCA ) โดยใช้ไพรเมอร์ที่ระบุไว้ในตารางที่ 1 PCR ตรวจหา blaoxa คือ
เน้นกลุ่ม blaoxa-2 และ blaoxa-10 ที่มีอนุพันธ์ได้แสดงลักษณะ esbl
. การ pcrs ทำการทดลองในระบบ PCR geneamp
9600 ( เพอร์กินเอลเมอร์ Norwalk , CT ) ภายใต้เงื่อนไขที่ระบุไว้ในแหล่งอ้างอิง
( ตารางที่ 1 ) การตรวจสอบขององค์ประกอบในพื้นที่ต้นน้ำของ
blactx-m แสดงทุกสายพันธุ์โดยวิธี PCR โดยใช้ primers แบก blactx-m
และเงื่อนไขที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( 20 , 34 ) amplicons PCR ทั้งหมดถูกตรวจสอบโดย
เจลบน 2.0 เปอร์เซ็นต์ ( น้ำหนัก / ปริมาตร ) seakem เลอเจล ( FMC ชีวภาพ
ผลิตภัณฑ์รอก ฉัน ) เจลใช้ย้อมทิเดียมโบรไมด์ ( 0.5  g / ml ) .
purifications เชื้อ amplicons ทดลองโดยใช้สารสกัดจาก nucleospin
2 ชุด ( macherey นาเกล ) โดยผลิตภัณฑ์ของ BLA ยีนและองค์ประกอบ
ภายใต้ทิศทางการศึกษาลำดับนิวคลีโอไทด์โดยใช้ PCR ไพรเมอร์เพื่อตรวจสอบ
ของโมเลกุลชนิด ลำดับดีเอ็นเอวิเคราะห์ด้วยเครื่องวิเคราะห์ทางพันธุกรรม
3100 ( Applied Biosystems ฟอสเตอร์ ซิตี้ , แคลิฟอร์เนีย ) ตามข้อเสนอแนะของ
ผู้ผลิต