2.5. Western-blot analysis2.6. Prod

2.5. Western-blot analysis
2.6. Production of monoclonal antibody against sheep α-TTP
In order to prepare immunogens, two kinds of recombinant partial fragments of sheep α-TTP were artificially synthesized (MBL, Japan). N1 consisted of amino acid (aa) residues 1–16 and N2 consisted of a residues 266–282 (GenBank accession No: HQ268507). N1 and N2 were used as immunogens after purification via HPLC and monoclonal antibodies were produced against them according to similar procedures previously described by He et al. (2013).Briefly, the peptides were conjugated with keyhole limpet hemocyanin (KLH), emulsified in Freund's adjuvant (Sigma, USA) and the conjugates were injected intraperitoneally to 5 eight-week-old female BLAB/c mice. After completion of the immunization schedule, mice with higher titers of specific antibodies were selected and hybridomas were produced by fusion of spleen cells with SP2/0 cell line. The culture supernatants of hybridoma clones were screened by ELISA and Western-blot and the positive clones were then subcloned by limiting dilution. In the end, the monoclonal antibody produced by the final clones was purified and confirmed by different assays including ELISA, Western-blot and immunohistochemistry. It was then stored at−20 °C and expanded for further study.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.5. เวสเทิร์นคืนในตาวิเคราะห์
2.6 ผลิตแอนติบอดี monoclonal กับแกะα-TTP
เพื่อเตรียม immunogens สองชนิด recombinant ชิ้นส่วนบางส่วนของแกะα-TTP เหือดถูกสังเคราะห์ (MBL ญี่ปุ่น) N1 ประกอบด้วยกรดอะมิโน (aa) ตกค้าง 1-16 และประกอบด้วย N2 282-266 ที่ตกค้าง (GenBank ทะเบียนไม่มี: HQ268507) N1 และ N2 ใช้เป็น immunogens หลังจากฟอกผ่าน HPLC และแอนตี้ monoclonal ผลิตกับพวกเขาตามขั้นตอนคล้ายกันโดยเขา et al. (2013) ที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้สั้น ๆ เปปไทด์ได้กลวงกับรูกุญแจหอยหมวกเจ๊ก hemocyanin (KLH), emulsified ในประเมินของ Freund (ซิก สหรัฐอเมริกา) และ conjugates ถูกฉีด intraperitoneally ไป 5 อายุ 8 สัปดาห์เพศหญิง BLAB/c หนู หลังจากเสร็จสิ้นการกำหนดการรับวัคซีน เลือกหนู ด้วย titers สูงของแอนตี้เฉพาะ และผลิต โดยหลอมเซลล์ม้ามกับรายการ SP2/0 เซลล์ hybridomas Supernatants วัฒนธรรมของโคลน hybridoma ที่ฉาย โดย ELISA และเวสเทิร์นคืนในตา และโคลนบวกแล้วได้ subcloned จำกัดเจือจาง ในสุด แอนติบอดี monoclonal ผลิต โดยโคลนสุดท้ายที่บริสุทธิ์ และยืนยัน โดยต่าง assays ได้แก่ ELISA ตะวันตกคืนในตาและ immunohistochemistry มันถูก แล้วเก็บ at−20 ° C และขยายการศึกษาเพิ่มเติม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.5 การวิเคราะห์ตะวันตก blot
2.6 การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีกับแกะα-TTP
เพื่อที่จะเตรียมความพร้อมให้ immunogens สองชนิดของชิ้นส่วนบางส่วนผสมของแกะα-TTP ถูกสังเคราะห์เทียม (MBL, ญี่ปุ่น) N1 ประกอบด้วยกรดอะมิโน (AA) ส่วนที่เหลือ 1-16 และ N2 ประกอบด้วยสารตกค้าง 266-282 (GenBank ภาคยานุวัติไม่มี: HQ268507) N1 และ N2 ถูกนำมาใช้เป็น immunogens หลังจากที่ผ่านการทำให้บริสุทธิ์ HPLC และโคลนอลแอนติบอดีที่ผลิตกับพวกเขาเป็นไปตามขั้นตอนที่คล้ายกันอธิบายไว้ก่อนหน้านี้โดยเขาและคณะ (2013) .Briefly เปปไทด์ที่ได้รับการผันกับหอย hemocyanin รูกุญแจ (KLH) emulsified ใน Freund ของแบบเสริม (Sigma, USA) และ conjugates ฉีดท้องเพื่อ BLAB หญิง / คหนู 5 แปดสัปดาห์เก่า หลังจากเสร็จสิ้นตารางการฉีดวัคซีนหนูกับ titers ที่สูงขึ้นของแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงได้รับการคัดเลือกและไฮบริที่ผลิตโดยฟิวชั่นของเซลล์ม้ามกับสาย SP2 / 0 เซลล์ supernatants วัฒนธรรมของโคลนไฮบริถูกคัดกรองโดยวิธี ELISA และตะวันตก-blot และโคลนบวก subcloned แล้วโดยการ จำกัด การลดสัดส่วน ในท้ายที่สุดแอนติบอดีที่ผลิตโดยโคลนสุดท้ายบริสุทธิ์และได้รับการยืนยันโดยการตรวจที่แตกต่างกันรวมทั้งวิธี ELISA, ตะวันตก blot และ immunohistochemistry แล้วมันถูกเก็บไว้ที่ 20 องศาเซลเซียสและการขยายตัวสำหรับการศึกษาต่อ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.5 Western blot การวิเคราะห์
2.6 การผลิตโมโนโคลนอลแอนติบอดีต่อแอลฟาแกะ TTP
เพื่อเตรียมทดลอง สองชนิดของยีนบางส่วนของชิ้นส่วนαแกะ - TTP ถูกเทียมสังเคราะห์ ( mbl , ญี่ปุ่น ) N1 ประกอบด้วยกรดอะมิโน ( AA ) ตกค้าง 1 – 16 และ 2 ประกอบด้วยสารตกค้าง 266 – 282 ( ขนาดหนังสือ : hq268507 )N1 และ N2 ที่ใช้ทดลองบำบัดน้ำเสียและหลังจากผ่านและโมโนโคลนอลแอนติบอดีที่คล้ายกันกับพวกเขาตามขั้นตอนอธิบายไว้ก่อนหน้า โดยเขาและคณะ ( 2013 ) สั้น ๆ , เปปไทด์เป็น conjugated กับ Keyhole จังหวัดเอโรฮีโมไซยานิน ( klh ) ที่มีใน Freund เป็นผู้ช่วย ( ซิกม่าสหรัฐอเมริกา ) และการฉีดสารประกอบที่พบ 5 แปดสัปดาห์เก่าหญิงๆ / C หนู หลังจากเสร็จจากการตารางเวลา หนูกับที่สูงของแอนติบอดีที่เฉพาะเจาะจงโดยคัดเลือก และสาธารณสุขถูกผลิตโดยการรวมตัวของเซลล์ม้ามกับ SP2 / 0 เซลล์ไลน์วัฒนธรรม supernatants โคลนจากเซลล์โดยวิธี ELISA และ blot ตะวันตกและโคลนของบวกแล้วโดยการเจือจาง ในที่สุด , โมโนโคลนอลแอนติบอดีที่ผลิตจากโคลนสุดท้ายบริสุทธิ์และยืนยันโดยวิธีที่แตกต่างกันรวมทั้ง Elisa , blot ตะวันตกและหลอด . มันถูกเก็บไว้ที่− 20 ° C และขยายเพื่อการศึกษา .