รูปที่ 9 การดูดกลืนแสงตามกฎของแลมเบิร์ต (lambert's law)
5.2.2 กฎของเบียร์ (Beer's law) กฎของเบียร์ (ค.ศ.1852)กล่าวว่า แสงที่ถูกดูดกลืนเป็นสัดส่วนโดยตรงกับความเข้มข้นของสารในของเหลวซึ่งเมื่อคำนวณเช่นเดียวกับกฎของแลมเบิร์ต จะได้สมการ
It = I0 x 10-kc -----------------------(2)
เมื่อรวมกฎทั้งสองเข้าด้วยกัน (Beer-Lambert's law) โดยการบวกสมการที่ (1) และสมการที่ (2) จะได้สมการใหม่ดังนี้
It = I0 x 10-εct -----------------------(3)
แต่แสงส่องผ่าน (transmittance, T) มีค่าเท่ากับ It/I0และแสงที่ถูกดูดกลืน (absorbance, A หรือ optical density, OD) มีค่าเท่ากับ log (I0/It) ดังนั้น
A = εct -----------------------(4)
หรือ A= -log T -----------------------(5)
ε = molar absorptivity สารแต่ละชนิดมีค่า ε คงที่ในแต่ละช่วงคลื่น
มีหน่วยเป็น mole-1cm-1
c = ความเข้มข้นของสารในหน่วย mole/L
t = ความหนาของสารละลายในหน่วย ซม.
5.3 ส่วนประกอบของเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์ (spectrophotometer components)
ส่วนประกอบหลักของเครื่องยูวี-วิสิเบิล สเปกโทรโฟโตมิเตอร์ มีอยู่ 5 ส่วนด้วยกัน
ดังนี้คือ 1. แหล่งกำเนิดแสง (light source)
2. ส่วนเลือกความยาวคลื่น (wavelength selector)
3. ภาชนะใส่สาร (cell หรือ cuvette)
4. ตัวตรวจจับสัญญาณ (detector)
5. ส่วนบันทึกและแปรผลสัญญาณ (recorder and processor )
โดยมีการจัดเรียงส่วนประกอบทั้งหมด ดังรูป
รูปที่ 10 แผนภาพเครื่องยูวี-วิสิเบิล สเปกโทรโฟโตมิเตอร์อย่างง่าย
5.3.1 แหล่งกำเนิดแสง (light source)
แหล่งกำเนิดแสงในเครื่องสเปกโทรโฟโตมิเตอร์จะต้องให้รังสีในช่วงความยาวคลื่นที่ต้องการอย่างต่อเนื่องและคงที่ตลอดเวลา รวมทั้งมีความเข้มแสงที่มากพอด้วยสำหรับความยาวคลื่นในช่วงอัลตราไวโอเลตจะใช้หลอดดิวเทอเรียม
(deuterium lamp) เป็นแหล่งกำเนิดแสง ซึ่งให้แสงในช่วง 185-375 nm
หลักการคือทำให้อะตอมดิวเทอเรียมที่อยู่ในสภาวะเร้าคายพลังงานออกมา
ส่วนหลอดทังสเตน (tungsten filament lamp) จะให้ความยาวคลื่นครอบคลุมช่วงแสงที่มองเห็นได้ คือตั้งแต่ 320-2500 nm หลักการจะคล้ายกับหลอดไฟทังสเตนธรรมดาคือ ให้กระแสไฟฟ้าผ่านเข้าไปจนกระทั่งลวดทังสเตนร้อนและ
เปล่งรังสีออกมาโดยปกติจะเปิดเครื่องทิ้งไว้ก่อนใช้งานประมาณ 30 นาที เพื่อให้แน่ใจว่าหลอดดิวเทอเรียมหรือหลอดทังสเตนให้แสงที่มีความเข้มสม่ำเสมอ
รูปที่ 11 หลอดดิวเทอเรียม (ซ้าย) และหลอดทังสเตน (ขวา)
5.3.2 ส่วนเลือกความยาวคลื่น (wavelength selector)
เป็นส่วนที่ใช้แยกความยาวคลื่นที่ออกมาจากแหล่งกำเนิดแสง ซึ่งเป็นแสง
ที่มีหลายๆ ความยาวคลื่น (polychromatic wavelength) ให้เป็นแถบแสงในช่วงแคบๆ หรือ เป็นความยาวคลื่นเดี่ยว (monochromatic wavelength) เครื่องมือสมัยก่อนจะใช้ปริซึมหรือ ฟิลเตอร์สำหรับแยกความยาวคลื่น แต่ปัจจุบันเปลี่ยนมาใช้โมโนโครเมเตอร์ (monochromater) แบบเกรตติ้ง (grating) สะท้อนแสงซึ่งมีลักษณะเป็นร่องเล็กๆ ขนานกันจำนวนมาก แสงจากแหล่งกำเนิดแสงจะตกกระทบลงบนผิวหน้าของร่อง แล้วสะท้อนออกมาที่มุมต่างๆ เฉพาะความยาวคลื่นที่เราเลือกเท่านั้นจึงจะผ่าน ช่องแสงออก (exit slit) ไปสู่สารตัวอย่าง