EXAMPLESThe standard molecular biol

EXAMPLES
The standard molecular biology techniques described by J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) were used in the experiments.


Example 1 HRM analysis of IBV
A total of 56 samples from different farms and locations were submitted to Vet Food
Agro Diagnostics (M) Sdn. Bhd. for routine IBV diagnosis in 2011. The organ samples received ranged from lungs, kidney, caecal tonsils, trachea and pooled organs. These samples were
suspected to harbor the IB virus and were sent for detection of the specified virus and
confirmation. All these samples were homogenized and tested by รีเวิร์ส transcriptase PCR and real time PCR in this study.
Nucleic acid extraction was carried out using Trizol LS reagent (Invitrogen, USA) according to the standard manufacturer's protocol.
Multiplex รีเวิร์ส Transcriptase (RT) PCR for the detection of Mass and 793/B
A multiplex, based on Si gene sequences, from a previously described วิธี
(Cavanagh et al., Avian Pathology, 28:593-605, 1999) was employed for the detection and
differentiation of two types of IBV: 793/B and Massachusetts. The oligoนิวคลีโอไทด์ (primer)
sequences were as follow: XCE2-a: CTCTATAAACACCCTTACA (SEQ ID NO:1); XCE2-b: CACTGGTAATTTTTCAGATGG (SEQ ID NO:2) (RT PCR step); XCE3-:
CAGATTGCTTACAACCACC (SEQ ID NO:3); BCE1+: AGTAGTTTTGTGTATAAACCA (SEQ ID NO:4); DCE1+: ATACAATTATATCAAACCAGC (SEQ ID NO:5); MCE1+:



AATACTACTTTTACGTTACAC (SEQ ID NO:6) (Nested step) (Adzhar et al., Avian
Pathology, 25:817-836, 1996; Cavanagh et al., Avian Pathology, 28:593-605,1999). The reaction conditions were รีเวิร์ส Transciptase step at 45°C เป็นเวลา 1 hour, 72°C เป็นเวลา 10 minutes, followed by ขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้น at 94°C เป็นเวลา 5 minutes. The amplification steps were 94°C เป็นเวลา 1 minute, 50°C เป็นเวลา 1.5 minutes, 72°C เป็นเวลา 2 minutes repeated for 30 times, followed by final extension at 72°C เป็นเวลา 2 minutes. The nested step was carried out with the following conditions: Initial
Denaturation at 94°C เป็นเวลา 5 minutes, Amplification at 94°C เป็นเวลา 1 minute, 50°C เป็นเวลา 1.5 minutes and 72°C เป็นเวลา 2 minutes for a total of 30 times, followed by final extension at 72°C เป็นเวลา 10
minutes and hold at 4°C.
One-Step RT-qPCR for the detection of IB-QX
Real time PCR was carried out with a reaction volume of 104 of SensiFAST SYBR green master mix, 0.84 of 20 pmol ฟอร์เวิร์ด primer (CTTATGCAGTAGTCAA) (SEQ ID
NO:29) and รีเวิร์ส primer (CACGTGGAATCATGCCTGTTAT) (SEQ ID NO:30) , 0.41 of รีเวิร์ส transcriptase enzyme, 0.44 of RNAse inhibitor, 4uL of template and 3.41 of ddH20. The real time PCR reactions were carried out in a LightCycler 480 real time PCR instrument (Roche, Germany). The reaction conditions were รีเวิร์ส Transciptase step at 45°C เป็นเวลา 10 นาที followed by ขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้น at 94°C เป็นเวลา 2 minutes. The amplification steps were 94°C เป็นเวลา 5 วินาที, 50°C เป็นเวลา 10 วินาที and elongation at 72°C เป็นเวลา 5 วินาที. The melting curve analysis profile were 95°C เป็นเวลา 3 sec, 58°C เป็นเวลา 1 นาที and 95°C continuous, followed by cooling at 45°C เป็นเวลา 30 วินาที.
HRM assay to differentiate IBN-C90 and I0-()X
The assay was established by using the same primer pair as described above (SEQ ID
NO:29 and SEQ ID NO:30) that amplify the hyper-variable region of the S1 gene of IB. The
assay consisted of of the highly saturated fluorescent dye (EvaGreen), 12.5u1 master mix
(Sensimix, Bioline), 2p1 of 25mM MgC12, 0.50 of the primer pair, template and PCR grade
water. The samples were loaded into the 384-well microwell plate and subjected to PCR
amplification in a real time PCR machine (LightCycler 480, Roche). The thermal cycling
reactions consisted of an initial denaturation (3 sec at 95°C). The amplification consisted of
denaturation (1 นาทีที่ 95°C), annealing (1 นาทีที่ 48°C) and extension (1 นาทีที่ 72°C). The PCR was immediately followed by วีวีing curve analysis. The differentiations of the samples were achieved by using the known positive controls and in comparison with their melting profiles.
Validation
Sensitivity of the RT real time PCR
All concentrations of reference materials were measured by a UV Spectrophotometer.
Concentrations were standardized to 10pg/ul. An end-point dilution (ten-fold serial dilution) was used until the assay could no longer detect the target organism (no detection signals).
Specificity
The specificity of the test was conducted by testing the protocol against 5 other organisms (IBV 793/B, IBV Mass, IBD, NDV, CAV, Reovirus).
Sequencing
Samples for sequencing (direct sequencing) were sent to a commercial sequencing
facility. PCR clean up and gel purification was done based on manufacturer's protocol (Analytik Jena, Germany). Results obtained were analyzed by BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) for confirmation of the reference material.
Results
Fifteen out of the fifty-six (26.8%) samples tested were positive for 793/B สายพันธุ์, nine out of fifty-six (16%) were positive for Massachusetts สายพันธุ์; thirty-two out of fifty-six (57%) were positive for QX-like สายพันธุ์; eighteen out of the fifty-six cases (32%) which were previously
reported as negative for IB were found to be positive for IB-QX when re-tested.
Validation of the real time PCR assay for the specific detection of IB-QX
Sensitivity
รูป 2 illustrates the sensitivity of the assay with an initial concentration of 10 ng/pL. Based on the threshold derived at 18.48 at the final dilution level, it is estimated that the test is highly sensitive and may be able to detect the virus at concentrations as low as 100ag.
Amplification Curve — IB-QX (Specificity)
The specificity of the assay was tested with other closely related organisms such as IB-
Massachusetts, IB-793/B, NDV, IBV and Avian PneumoVirus (APV). รูป 3 illustrates the amplification curves derived from the specificity assay.
Melting peak (Tm) - IB-QX (Specificity)
The specificity of the assay was tested with other closely related organisms such as IB-
Massachusetts, IB-793/B, NDV, IBV and APV. รูป 4 illustrates the melting peak derived from the specificity assay.
Confirmation by Sequencing Analysis
The PCR product representing S1 gene of IB-QX สายพันธุ์ was sequenced and the sequence is shown in รูป 5 (SEQ ID NO:7). The sequence was used to BLAST against GenBank
database (NCBI). The screen shot of the BLAST results and tabulated นิวคลีโอไทด์ sequence
scores as determined by the BLAST analysis are shown in รูป 5. The BLAST analysis
confirms that the melting peaks and bands obtained from the PCR analysis is IB-QX.
Comparison of the previously reported nepropathogenic IB (MH5365/95) with sequences in Genbank was done and the screen shot of the BLAST results and tabulated นิวคลีโอไทด์
sequence scores as determined by the BLAST analysis are shown in รูป 6. The BLAST
analysis confirms that the nephropathogenic สายพันธุ์ isolated in 1995 is closely related to recent IB สายพันธุ์ found in Thailand. รูป 7 shows the ความเหมือนกันของลำดับ matrix of the 7 closely related sequences to the previously isolated IB case in Malaysia (MH5365/95 and v9/04).
รูป 8 illustrates the HRM analysis to compare IB-QX, IBnC90, Mass and 793/B.
รูป 9 depicts the HRM analysis to compare/detect IB-QX and IBnC90.
IB-QX was successfully detected from the retained archived samples. 26.8% samples tested were positive for the รูปแปรผัน สายพันธุ์ - 793/B สายพันธุ์, 16% were positive for the classic IB -
Massachusetts; while 57% tested were positive for the new QX-like สายพันธุ์ that has been
circulating since 2004. 18 out of the 56 cases (32%) which were previously reported as negative for IB were found to be positive for IB-QX when re-tested. Due to lack of controls and lack of detection วิธี for the QX สายพันธุ์, some of the 2011 IB cases were falsely reported as negative. Springing from there, a วิธี was successfully modified from a previously published paper to accurately detect IB-QX (H. J. Geerligs et al., Avian Pathology, 40(1):93-102, 2011). The
changes were made to modify the วิธี from 3 hours conventional PCR to a 54 minutes real time PCR assay that could detect nucleic acid as little as 100ag/pl. However, although the
วิธี is highly sensitive and specific, it is foreseen that the new QX detection assay has its limitations as it would not be able to detect other สายพันธุ์ that may be present in poultry
specimens, not be able to detect several different types of IB สายพันธุ์ simultaneously






As the results show, a วีวี assay (HRM) that employs gene scanning
software is able to distinguish single นิวคลีโอไทด์ differences based on the hyper variable region of the Si gene to concurrently detect 4 สายพันธุ์ (793/B, Mass, QX and IBnC90) as shown in รูป 8. The possibility of conducting the assay to compare two สายพันธุ์ (QX and IBnC90) is also shown in รูป 9.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างเทคนิคมาตรฐานอณูชีววิทยาอธิบายโดย J. Sambrook et al. (โคลน: คู่มือปฏิบัติการ A รุ่น 2 เย็นสปริงท่าปฏิบัติ ท่าเย็นฤดูใบไม้ผลิ นิวยอร์ก 1989) ใช้ในการทดลองตัวอย่างที่ 1 HRM วิเคราะห์ IBVจำนวน 56 ตัวอย่างจากฟาร์มต่าง ๆ และสถานส่งมาที่อาหารเรื่องน่ารู้เกษตรการวินิจฉัย (M) Sdn. bhd.ในการวินิจฉัย IBV ประจำปี 2554 ตัวอย่างอวัยวะรับแสก ๆ จากปอด ไต ทอนซิล caecal หลอดลม และอวัยวะรวม ตัวอย่างเหล่านี้ได้ สงสัยว่า harbor ไวรัส IB และส่งตรวจระบุไวรัส และ ยืนยัน ตัวอย่างเหล่านี้ทั้งหมด homogenized เป็นกลุ่ม และทดสอบ โดยรีเวิร์ส transcriptase PCR และเวลาจริง PCR ในการศึกษานี้ทำการสกัดกรดนิวคลีอิกออกใช้ Trizol LS รีเอเจนต์ (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ตามมาตรฐานของบริษัทผู้ผลิตโพรโทคอลรีเวิร์ส multiplex PCR Transcriptase (RT) ตรวจมวลและ 793/Bล็กแบบ ตามลำดับยีนซี จากวิธีการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Al. et Cavanagh นกพยาธิ 28:593-605, 1999) ถูกว่าจ้างในการตรวจพบ และสร้างความแตกต่างของสองชนิด IBV: 793/B และแมสซาชูเซตส์ Oligoนิวคลีโอไทด์ (รองพื้น)ลำดับได้ดังต่อไปนี้: a: XCE2 CTCTATAAACACCCTTACA (ลำดับ ID ไม่: 1); XCE2-b: CACTGGTAATTTTTCAGATGG (ลำดับ ID ไม่: 2) (RT PCR ขั้น); XCE3-: CAGATTGCTTACAACCACC (ลำดับรหัสไม่มี: 3); BCE1 +: AGTAGTTTTGTGTATAAACCA (ลำดับรหัส NO: 4); DCE1 +: ATACAATTATATCAAACCAGC (ลำดับรหัส NO: 5); MCE1 +:AATACTACTTTTACGTTACAC (ลำดับ ID ไม่: 6) (Nested ขั้น) (Adzhar et al., Avianพยาธิวิทยา 25:817-836, 1996 Al. ร้อยเอ็ด Cavanagh นกพยาธิ 28:593-605,1999) เงื่อนไขปฏิกิริยาได้รีเวิร์ส Transciptase ขั้นที่ 45° C เป็นเวลานาที เป็นเวลา 72° C 10 นาที ตาม ด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่เป็นเวลา 94° C 5 นาที ขั้นตอนการขยายได้ 94° C เป็นเวลา 1 นาที 50° C เป็นเวลา 1.5 นาที เป็นเวลา 72 องศาเซลเซียส 2 นาทีทำซ้ำสำหรับ 30 ครั้ง ตาม ด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่เป็นเวลา 72° C 2 นาที ขั้นตอนซ้อนกันถูกดำเนินการ ด้วยเงื่อนไขต่อไปนี้: เริ่มต้น Denaturation ที่เป็นเวลา 94° C 5 นาที ขยายที่ 94° C เป็นเวลา 1 นาที 50° C เป็นเวลา 1.5 นาที และเป็นเวลา 72 องศาเซลเซียส 2 นาทีจำนวน 30 ครั้ง ตาม ด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่เป็นเวลา 72° C 10 นาทีและพักไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสขั้นตอนเดียว RT qPCR ตรวจ IB QXReal time PCR ถูกดำเนินการ ด้วยปฏิกิริยา 104 SYBR SensiFAST สีเขียวหลักผสม 0.84 พื้นฟอร์เวิร์ด pmol 20 (CTTATGCAGTAGTCAA) (รหัสลำดับ NO:29) และรองพื้นรีเวิร์ส (CACGTGGAATCATGCCTGTTAT) (ลำดับ ID ไม่: 30), 0.41 ของเอ็นไซม์ transcriptase รีเวิร์ส 0.44 RNAse ผล 3.41 ของ ddH20 และ 4uL ของแม่ ปฏิกิริยา PCR เวลาจริงถูกดำเนินในเครื่อง LightCycler 480 เวลาจริง PCR มือ (Roche เยอรมนี) เงื่อนไขปฏิกิริยาขั้นตอน Transciptase รีเวิร์สที่ 45° C เป็นเวลา 10 นาทีตาม ด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่ 94° C เป็นเวลา 2 นาทีได้ ขั้นตอนการขยายถูกวินาทีเป็นเวลา 5 94° C, 50° C เป็นเวลา 10 วินาที และ elongation ที่ 72° C เป็นเวลา 5 วินาที การละลายเส้นโค้งโพรไฟล์วิเคราะห์ได้ 95° C เป็นเวลา sec 3, 58 ° C เป็นเวลา 1 นาทีและ 95° C ต่อเนื่อง ตาม ด้วยการทำความเย็นที่ 45° C เป็นเวลา 30 วินาทีHRM วิเคราะห์เพื่อแยกแยะ()อิบ-C90 และ I0 Xวิเคราะห์การก่อตั้งขึ้นโดยคู่พื้นเดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น (รหัสลำดับNO: 29 และลำดับ ID ไม่: 30) ที่ขยายเขตไฮเปอร์ตัวแปรของยีน S1 ของ IB.ทดสอบประกอบด้วยของการอิ่มตัวสูงฟลูออเรสย้อม (EvaGreen), 12.5u1 ส่วนผสมหลัก(Sensimix นำ), 1 p 2 25 มม. MgC12, 0.50 รองพื้นคู่ แม่แบบ และเกรด PCRน้ำ ตัวอย่างถูกโหลดลงในจาน microwell 384-ดี และอยู่ภายใต้การ PCRขยายในเครื่อง PCR เวลาจริง (LightCycler 480 โร) ความร้อนปั่นจักรยานปฏิกิริยาประกอบด้วย denaturation เป็นต้น (3 วินาทีที่ 95° C) ขยายที่ประกอบด้วยdenaturation (1 นาทีที่ 95° C), การอบเหนียว (1 นาทีที่ 48° C) และส่วนขยาย (1 นาทีที่ 72° C) PCR ถูกทันทีตาม ด้วยการวิเคราะห์เส้นโค้ง วีวีing Differentiations ตัวอย่างที่สำเร็จ โดยใช้ตัวควบคุมบวกรู้จัก และเมื่อเปรียบเทียบ กับค่าการละลายการตรวจสอบระดับความสำคัญของเวลาจริงของ RT PCRความเข้มข้นทั้งหมดของเอกสารอ้างอิงถูกวัด โดยเครื่องทดสอบกรดด่างมี UVความเข้มข้นได้มาตรฐานการ 10pg/ul การเลือกเจือจาง (เจือจางประจำ ten-fold) ถูกใช้จนกว่าการทดสอบไม่สามารถตรวจพบสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย (ไม่ตรวจจับสัญญาณ)SpecificitySpecificity ของการทดสอบที่ดำเนิน โดยทดสอบโพรโทคอลกับ 5 อื่น ๆ สิ่งมีชีวิต (IBV 793/B มวล IBV, IBD, NDV, CAV, Reovirus)จัดลำดับตัวอย่างสำหรับลำดับเบส (จัดลำดับโดยตรง) ถูกส่งไปยังลำดับเชิงพาณิชย์สิ่งอำนวยความสะดวก PCR ล้าง และฟอกเจทำตามของผู้ผลิตโพรโทคอล (Jena Analytik เยอรมนี) ผลลัพธ์ที่ได้ถูกวิเคราะห์ โดยระเบิด (พื้นฐานเฉพาะตำแหน่งค้นหาเครื่องมือ) สำหรับวัสดุอ้างอิงรับรองผลลัพธ์Fifteen จากตัวอย่าง (26.8%) เอ็ดที่ทดสอบได้ค่าบวกสำหรับ 793/B สายพันธุ์ เก้าจากสิบหก (16%) ได้ค่าบวกสำหรับแมสซาชูเซตส์สายพันธุ์ สามสิบสองจากห้าสิบหก (57%) ได้ค่าบวกสำหรับ QX เหมือนสายพันธุ์ เอททีนจากกรณีเอ็ด (32%) ซึ่งก่อนหน้านี้ รายงานเป็นค่าลบสำหรับ IB พบต้องเป็นค่าบวกสำหรับ IB QX เมื่อทดสอบอีกครั้งตรวจสอบทดสอบ PCR เรียลไทม์ตรวจเฉพาะของ IB QXความไวรูปที่ 2 แสดงความไวของการทดสอบ มีความเข้มข้นที่เริ่มต้นของ 10 ng pL. ขึ้นอยู่กับขีดจำกัดที่ได้รับที่ระดับเจือจางสุดท้าย 18.48 มันคือประมาณว่า การทดสอบมีความไวสูง และสามารถตรวจหาไวรัสที่ความเข้มข้นต่ำสุดที่ 100agขยายโค้ง — IB-QX (Specificity)ทดสอบกับสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเช่น IB - specificity ของการทดสอบรัฐแมสซาชูเซตส์ IB-793/B, NDV, IBV และนก PneumoVirus (APV) รูปที่ 3 แสดงเส้นโค้งขยายมาวิเคราะห์ specificityการละลายสูงสุด (Tm) - IB-QX (Specificity) ทดสอบกับสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเช่น IB - specificity ของการทดสอบรัฐแมสซาชูเซตส์ IB-793/B, NDV, IBV และ APV รูป 4 แสดงจุดสูงสุดที่ละลายมาจากวิเคราะห์ specificityยืนยัน โดยการวิเคราะห์ลำดับเบสผลิตภัณฑ์ PCR S1 ยีนของ IB QX สายพันธุ์แทนเรียงลำดับ และลำดับที่จะแสดงในรูปที่ 5 (ลำดับ ID ไม่: 7) ลำดับการใช้ระเบิดกับ GenBank ฐานข้อมูล (NCBI) หน้าจอผลการระเบิดและสนับสนุนนิวคลีโอไทด์ลำดับ คะแนนวิเคราะห์ระเบิดจะแสดงในรูปที่ 5 วิเคราะห์ระเบิด ยืนยันยอดและวงที่ได้รับจากการวิเคราะห์ของ PCR ละลายว่า IB QX ทำการเปรียบเทียบรายงานก่อนหน้านี้ nepropathogenic IB (MH5365/95) มีลำดับใน Genbank และยิงระเบิดผลหน้าจอ และสนับสนุนนิวคลีโอไทด์ คะแนนลำดับวิเคราะห์ระเบิดจะแสดงในรูป 6 การระเบิด วิเคราะห์ยืนยันว่า สายพันธุ์ nephropathogenic ที่แยกต่างหากในปี 1995 มีสัมพันธ์ใกล้ชิดกับสายพันธุ์ IB ล่าสุดที่พบในประเทศไทย รูป 7 แสดงเมตริกซ์ความเหมือนกันของลำดับลำดับที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิด 7 กับกรณีก่อนหน้านี้แยก IB ในมาเลเซีย (MH5365/95 และ v9/04) รูป 8 แสดงการวิเคราะห์ HRM เปรียบเทียบ IB QX, IBnC90 มวล และ 793/b รูปที่ 9 แสดงให้เห็นการวิเคราะห์ HRM การเปรียบ เทียบ/IB QX และ IBnC90 IB QX สำเร็จพบจากตัวอย่างที่เก็บสะสม 26.8% ตัวอย่างที่ทดสอบได้ค่าบวกสำหรับสายพันธุ์รูปแปรผัน - 793/B สายพันธุ์ 16% ได้ค่าบวกสำหรับ IB คลาสสิค-รัฐแมสซาชูเซตส์ ขณะที่ 57% ทดสอบค่าบวกสำหรับสายพันธุ์ QX เหมือนใหม่ที่ได้รับ หมุนเวียนตั้งแต่ปี 2004 18 จากกรณี 56 (32%) ซึ่งก่อนหน้านี้ถูกรายงานว่า เป็นค่าลบสำหรับ IB พบต้องเป็นค่าบวกสำหรับ IB QX เมื่อทดสอบอีกครั้ง ขาดการควบคุมและขาดการตรวจสอบวิธีการ QX สายพันธุ์ บางกรณี IB 2011 ถูกแอบรายงานเป็นค่าลบ เกิดจาก วิธีการประสบความสำเร็จล่าสุดจากกระดาษเผยแพร่ก่อนหน้านี้ต้องตรวจ IB QX (H. J. Geerligs et al. นกพยาธิ 40 (1): 93-102, 2011) ที่ เปลี่ยนแปลงได้ทำการปรับเปลี่ยนวิธีจาก PCR แบบเดิมนาที 54 เวลาจริง PCR assay ที่สามารถตรวจพบกรดนิวคลีอิก 3 ชั่วโมงเพียงเล็กน้อยที่ 100ag/pl อย่างไรก็ตาม แม้ว่าการ วิธีเฉพาะเจาะจง และมีความสำคัญสูง มันเป็น foreseen ตรวจวิเคราะห์ใหม่ของ QX ว่า มีข้อจำกัดที่เป็นจะไม่สามารถตรวจพบสายพันธุ์อื่น ๆ ที่อาจมีอยู่ในสัตว์ปีก ไว้เป็นตัวอย่าง ไม่สามารถตรวจพบ IB สายพันธุ์หลายชนิดพร้อมกันเป็นแสดงผล วิเคราะห์วีวี (HRM) ที่มียีนสแกนซอฟต์แวร์จะสามารถแยกแยะความแตกต่างนิวคลีโอไทด์เดียวตามภูมิภาคแปรไฮเปอร์ของยีนศรีสืบพร้อม 4 สายพันธุ์ (793/B มวล QX และ IBnC90) ดังแสดงในรูปที่ 8 ยังมีแสดงความเป็นไปได้ของการดำเนินการวิเคราะห์เพื่อเปรียบเทียบสองสายพันธุ์ (QX และ IBnC90) ในรูปที่ 9

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ตัวอย่าง
เทคนิคทางอณูชีววิทยามาตรฐานการอธิบายโดยเจ Sambrook et al, (โมเลกุลโคลน: คู่มือการใช้งานในห้องปฏิบัติการ, ฉบับที่ 2, Cold Spring Harbor ห้องปฏิบัติการ Cold Spring Harbor, นิวยอร์ก, 1989) ถูกนำมาใช้ในการทดลอง. ตัวอย่างการวิเคราะห์การบริหารทรัพยากรมนุษย์ 1 ของหลอดลมอักเสบติดต่อทั้งหมด 56 ตัวอย่างจากฟาร์มที่แตกต่างกันและสถานที่ถูกส่งไป อาหารสัตวแพทย์เกษตรวินิจฉัย (M) Sdn Bhd. ประจำวินิจฉัยหลอดลมอักเสบติดต่อในปี 2011 ตัวอย่างอวัยวะที่ได้รับตั้งแต่ปอด, ไต, ต่อมทอนซิล caecal หลอดลมและอวัยวะสำรอง ตัวอย่างเหล่านี้ถูกสงสัยว่าท่าเรือไวรัส IB และถูกส่งสำหรับการตรวจหาไวรัสที่ระบุและยืนยัน ทั้งหมดตัวอย่างเหล่านี้ปั่นและทดสอบโดยรีเวิร์ส PCR transcriptase และเวลา PCR จริงในการศึกษาครั้งนี้. นิวคลีอิกสกัดกรดได้รับการดำเนินการโดยใช้น้ำยา Trizol LS (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ตามโปรโตคอลผลิตมาตรฐาน. มัลติรีเวิร์ส Transcriptase (RT) PCR ในการตรวจหามวลและ 793 / B ทวีคูณขึ้นอยู่กับศรีลำดับยีนจากวิธีอธิบายไว้ก่อนหน้า(หนา, et al, นกพยาธิวิทยา 28:. 593-605, 1999) ถูกจ้างสำหรับการตรวจสอบและความแตกต่างของทั้งสองประเภทของหลอดลมอักเสบติดต่อ: 793 / B และแมสซาชูเซต Oligo นิวคลีโอไทด์ (ไพรเมอร์) ลำดับได้ดังนี้ XCE2-: CTCTATAAACACCCTTACA (SEQ ID NO: 1); XCE2-b: CACTGGTAATTTTTCAGATGG (SEQ ID NO: 2) ​​(RT ขั้นตอนวิธี PCR); XCE3-: CAGATTGCTTACAACCACC (SEQ ID NO: 3) BCE1 + AGTAGTTTTGTGTATAAACCA (SEQ ID NO: 4) DCE1 + ATACAATTATATCAAACCAGC (SEQ ID NO: 5) MCE1 + AATACTACTTTTACGTTACAC (SEQ ID NO: 6) (ขั้นตอนที่ซ้อนกัน) (Adzhar, et al, นก. พยาธิวิทยา 25:. 817-836 1996817-836 1996; et al, หนา, นกพยาธิวิทยา 28: 593-605,1999) เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยามีรีเวิร์ส Transciptase ขั้นตอนที่ 45 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 ชั่วโมง 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตามด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที ขั้นตอนการขยายเป็น 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1.5 นาที 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีทำซ้ำ 30 ครั้งตามด้วยนามสกุลสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที ขั้นตอนที่ซ้อนกันได้รับการดำเนินการที่มีเงื่อนไขดังต่อไปนี้: เริ่มต้นdenaturation ที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, ขยายที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาที 50 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1.5 นาทีและ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาทีรวม 30 ครั้งตามด้วยนามสกุลสุดท้ายที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีและถือที่ 4 ° C. ขั้นตอนเดียว RT-qPCR สำหรับการตรวจสอบของ IB-QX PCR เรียลไทม์ได้รับการดำเนินการที่มีปริมาณการเกิดปฏิกิริยาของ 104 SensiFAST SYBR ผสมต้นแบบสีเขียว 0.84 20 pmol ฟอร์เวิร์ดไพรเมอร์ (CTTATGCAGTAGTCAA) (SEQ ID NO: 29) และรีเวิร์สไพรเมอร์ (CACGTGGAATCATGCCTGTTAT) (SEQ ID NO: 30) 0.41 ของรีเวิร์สเอนไซม์ transcriptase 0.44 ของ RNase ยับยั้ง, 4UL ของแม่แบบและ 3.41 ของ ddH20 เวลาปฏิกิริยา PCR จริงได้ดำเนินการใน LightCycler 480 เวลาที่ใช้ในการ PCR จริง (Roche, เยอรมนี) เงื่อนไขการเกิดปฏิกิริยามีรีเวิร์ส Transciptase ขั้นตอนที่ 45 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 10 นาทีตามด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 2 นาที ขั้นตอนการขยายเป็น 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาที, 50 ° C เป็นเวลา 10 วินาทีและการยืดตัวที่ 72 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 วินาที รายละเอียดการวิเคราะห์โค้งละลายได้ 95 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 3 วินาที 58 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 1 นาทีและ 95 องศาเซลเซียสต่อเนื่องตามด้วยการระบายความร้อนที่ 45 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 วินาที. ทดสอบการบริหารทรัพยากรมนุษย์ที่แตกต่าง IBN-C90 และ I0- ( ) X ทดสอบก่อตั้งขึ้นโดยใช้คู่ไพรเมอร์เช่นเดียวกับที่กล่าวไว้ข้างต้น (SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 30) ที่ขยายพื้นที่มากเกินไปตัวแปรของยีน S1 ของ IB ทดสอบประกอบด้วยของความอิ่มตัวสูงสีย้อมเรืองแสง (EvaGreen) 12.5u1 ผสมต้นแบบ(Sensimix, Bioline) 2p1 ของ MgC12 25mm, 0.50 ของคู่ไพรเมอร์, แม่แบบและเกรด PCR น้ำ ตัวอย่างที่ถูกโหลดลงในแผ่น microwell 384 ดีและเป็นไป PCR ขยายในเวลาที่เครื่อง PCR จริง (LightCycler 480, Roche) ความร้อนปฏิกิริยาประกอบด้วย denaturation ครั้งแรก (3 วินาทีที่ 95 ° C) ขยายประกอบด้วยdenaturation (1 นาทีที่ 95 ° C) การหลอม (1 นาทีที่ 48 ° C) และการขยาย (1 นาทีที่ 72 ° C) PCR ตามมาทันทีโดยไอเอ็นจีวีวีวิเคราะห์เส้นโค้ง ความแตกต่างหลากหลายของกลุ่มตัวอย่างที่ประสบความสำเร็จโดยใช้การควบคุมที่รู้จักกันในเชิงบวกและในการเปรียบเทียบกับรูปแบบการละลายของพวกเขา. ตรวจสอบความไวของ PCR RT เวลาจริงความเข้มข้นทั้งหมดของวัสดุอ้างอิงถูกวัดโดย Spectrophotometer UV. ความเข้มข้นที่ได้รับมาตรฐานเพื่อ 10pg / ul เจือจางจุดสิ้นสุด (สิบเท่าเจือจางอนุกรม) ถูกนำมาใช้จนการทดสอบไม่สามารถตรวจสอบสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย (ไม่มีสัญญาณการตรวจสอบ). ความจำเพาะความจำเพาะของการทดสอบได้ดำเนินการโดยการทดสอบกับโปรโตคอล 5 มีชีวิตอื่น ๆ (หลอดลมอักเสบติดต่อ 793 / B, หลอดลมอักเสบติดต่อมวล IBD, NDV, CAV, Reovirus). ลำดับตัวอย่างสำหรับลำดับ (ลำดับโดยตรง) ถูกส่งไปยังลำดับการค้าสิ่งอำนวยความสะดวก PCR ทำความสะอาดและการทำให้บริสุทธิ์เจลที่ได้กระทำขึ้นอยู่กับโปรโตคอลของผู้ผลิต (Analytik เจเยอรมนี) ผลที่ได้มาวิเคราะห์โดยระเบิด (Basic ท้องถิ่นจัดเครื่องมือค้นหา) สำหรับการยืนยันของวัสดุอ้างอิง. ผลสิบห้าจากห้าสิบหก (26.8%) ตัวอย่างการทดสอบเป็นบวกสำหรับ 793 / B สายพันธุ์, เก้าออกจากห้าสิบหก ( 16%) เป็นบวกสำหรับแมสซาชูเซตสายพันธุ์; สามสิบสองจากห้าสิบหก (57%) เป็นบวกสำหรับ QX เหมือนสายพันธุ์; สิบแปดจากกรณีที่ห้าสิบหก (32%) ซึ่งก่อนหน้านี้ได้รับรายงานว่าเป็นเชิงลบสำหรับ IB พบว่าในเชิงบวกสำหรับ IB-QX เมื่อทดสอบอีกครั้ง. ตรวจสอบเวลาการทดสอบ PCR ที่แท้จริงสำหรับการตรวจสอบที่เฉพาะเจาะจงของ IB-QX ความไวแสงรูปที่ 2 แสดงให้เห็นถึงความไวของการทดสอบที่มีความเข้มข้นเริ่มต้น 10 ng / PL ขึ้นอยู่กับเกณฑ์ที่ได้มาอยู่ที่ระดับ 18.48 เจือจางสุดท้ายมันเป็นที่คาดว่าการทดสอบเป็นอย่างสูงที่มีความสำคัญและอาจจะไม่สามารถที่จะตรวจสอบไวรัสที่ระดับความเข้มข้นที่ต่ำเป็น 100ag. ขยาย Curve - IB-QX (จำเพาะ) ความจำเพาะของ การทดสอบได้รับการทดสอบกับคนอื่น ๆ มีชีวิตที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเช่น IB- แมสซาชูเซต IB-793 / B NDV, หลอดลมอักเสบติดต่อและนก PneumoVirus (APV) รูปที่ 3 แสดงให้เห็นถึงการขยายเส้นโค้งที่ได้จากการทดสอบความจำเพาะ. สูงสุดจุดหลอมเหลว (TM) - IB-QX (จำเพาะ) ความจำเพาะของการทดสอบได้รับการทดสอบกับสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ ที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดเช่น IB- แมสซาชูเซต IB-793 / B NDV, และหลอดลมอักเสบติดต่อ APV รูปที่ 4 แสดงให้เห็นถึงยอดเขาละลายที่ได้มาจากการทดสอบความจำเพาะ. ยืนยันโดยลำดับการวิเคราะห์ผลิตภัณฑ์ PCR เป็นตัวแทนของยีน S1 ของ IB-QX สายพันธุ์ได้รับการจัดลำดับและลำดับที่แสดงในรูปที่ 5 (SEQ ID NO: 7) ลำดับที่ถูกใช้ในการระเบิด GenBank กับฐานข้อมูล (NCBI) ภาพหน้าจอของผลการระเบิดและ tabulated นิวคลีโอไทด์ลำดับคะแนนตามที่กำหนดโดยการวิเคราะห์ระเบิดจะแสดงในรูป 5. การวิเคราะห์ระเบิดยืนยันว่ายอดเขาละลายและวงดนตรีที่ได้รับจากการวิเคราะห์ PCR เป็น IB-QX. เปรียบเทียบ ของรายงานก่อนหน้านี้ IB nepropathogenic (MH5365 / 95) โดยมีลำดับใน Genbank ได้ทำและภาพหน้าจอของผลการระเบิดและ tabulated นิวคลีโอไทด์ลำดับคะแนนตามที่กำหนดโดยการวิเคราะห์ระเบิดจะแสดงในรูป 6. ระเบิดวิเคราะห์ ยืนยันว่า nephropathogenic สายพันธุ์ที่แยกได้ในปี 1995 เป็นเรื่องที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับที่ผ่านมา IB สายพันธุ์ที่พบในประเทศไทย รูปที่ 7 แสดงความเหมือนกันของลำดับเมทริกซ์ของ 7 ลำดับที่เกี่ยวข้องอย่างใกล้ชิดกับกรณี IB แยกก่อนหน้านี้ในประเทศมาเลเซีย (MH5365 / 95 และ v9 / 04). รูปที่ 8 แสดงให้เห็นถึงการวิเคราะห์การบริหารทรัพยากรมนุษย์เพื่อเปรียบเทียบ IB-QX, IBnC90, Mass และ 793 / B. รูปที่ 9 แสดงให้เห็นถึงการวิเคราะห์การบริหารทรัพยากรมนุษย์เพื่อเปรียบเทียบ / ตรวจสอบ IB-QX และ IBnC90. IB-QX พบประสบความสำเร็จจากตัวอย่างที่เก็บสะสม 26.8% ตัวอย่างการทดสอบเป็นบวกสำหรับรูปแปรผันสายพันธุ์ - 793 / B สายพันธุ์ 16% เป็นบวกสำหรับ IB คลาสสิก - แมสซาชูเซต; ในขณะที่ 57% ผ่านการทดสอบเป็นบวกสำหรับใหม่ QX เหมือนสายพันธุ์ที่ได้รับการหมุนเวียนตั้งแต่ปี 2004 ที่ 18 จาก 56 ราย (32%) ซึ่งมีรายงานก่อนหน้านี้เป็นเชิงลบสำหรับ IB พบว่าในเชิงบวกสำหรับ IB-QX เมื่ออีกครั้ง ผ่านการทดสอบ เนื่องจากการขาดการควบคุมและการขาดการตรวจสอบวิธีการ QX สายพันธุ์บางส่วนของ IB 2011 กรณีได้รับรายงานเท็จเป็นเชิงลบ ผุดจากที่นั่นวิธีประสบความสำเร็จในการปรับเปลี่ยนจากบทความที่ตีพิมพ์ก่อนหน้านี้ที่จะต้องตรวจสอบ IB-QX (HJ Geerligs, et al, นกพยาธิวิทยา 40 (1):. 93-102 2011) การเปลี่ยนแปลงที่ทำในการปรับเปลี่ยนวิธีจาก 3 ชั่วโมง PCR ธรรมดาที่จะเรียลไทม์ 54 นาที PCR ทดสอบที่สามารถตรวจจับกรดนิวคลีอิกเป็นเพียง 100ag / พี อย่างไรก็ตามแม้ว่าวิธีอ่อนไหวและเฉพาะเจาะจงก็จะเล็งเห็นว่าการทดสอบการตรวจสอบ QX ใหม่มีข้อ จำกัด ของมันจะไม่สามารถที่จะตรวจสอบสายพันธุ์อื่น ๆ ที่อาจจะอยู่ในสัตว์ปีกตัวอย่างไม่สามารถที่จะตรวจสอบหลายประเภท ของ IB สายพันธุ์พร้อมกันในฐานะที่เป็นผลการแสดงการทดสอบวีวี (HRM) ที่มีพนักงานสแกนยีนซอฟแวร์สามารถที่จะแยกแยะความแตกต่างเดียวนิวคลีโอไทด์ที่แตกต่างกันขึ้นอยู่กับภูมิภาคตัวแปรมากเกินไปของยีนศรีพร้อมที่จะตรวจสอบ 4 สายพันธุ์ (793 / B มวล QX และ IBnC90) ดังแสดงในรูปที่ 8 เป็นไปได้ของการดำเนินการทดสอบการเปรียบเทียบสองสายพันธุ์ (QX และ IBnC90) นอกจากนี้ยังมีการแสดงในรูปที่ 9

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่าง
มาตรฐานอณูชีววิทยาเทคนิคที่อธิบายไว้โดย sambrook et al . ( การโคลน : คู่มือปฏิบัติการ 2 ฉบับฤดูใบไม้ผลิเย็นท่าเรือห้องปฏิบัติการ เจ้าท่าหนาวฤดูใบไม้ผลินิวยอร์ก , 1989 ) ถูกใช้ในการทดลอง


ตัวอย่าง 1 . การวิเคราะห์ IBV
รวมเป็น 56 คน จากฟาร์มที่แตกต่างกันและสถานที่ที่ถูกส่งไปยังสัตวแพทย์เกษตรอาหาร
( M ) Sdn . Bhd . การวินิจฉัยสำหรับการวินิจฉัย IBV รูทีนใน 2011 อวัยวะอย่างที่ได้รับระหว่างปอด ไต caecal ต่อมทอนซิล ขยายหลอดลม และ pooled อวัยวะ ตัวอย่างเหล่านี้ถูก
สงสัยว่าท่าเรือ IB ไวรัสและถูกส่งไปตรวจหาไวรัสที่ระบุและ
ยืนยัน ตัวอย่างเหล่านี้เป็นโฮโม และทดสอบ โดยรีเวิร์ส transcriptase PCR แบบเรียลไทม์พีซีอาร์ในการศึกษา .
การสกัดกรดนิวคลีอิกพบว่าใช้ trizol LS Reagent ( Invitrogen , USA ) ตามขั้นตอนมาตรฐานของผู้ผลิต .
เพี้ยงรีเวิร์ส transcriptase ( RT ) PCR เพื่อตรวจหามวลและ 793 / b
multiplex ตามจังหวัด ยีน ลำดับ จากที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้วิธี
( แคเวินแน็ก et al . , นกวิทยา 28:593-605 , 1999 ) เป็นเครื่องมือในการตรวจหาและ
ความแตกต่างของทั้งสองประเภทของ IBV : 793 / B และแมสซาชูเซต ( ไพรเมอร์ ) และ โอลิโกนิวคลีโอไทด์
ลำดับดังนี้ xce2-a : ctctataaacacccttaca ( seq id : 1 ) ; xce2-b : cactggtaatttttcagatgg ( seq id : 2 ) ( RT PCR ขั้นตอน ) xce3 - :
cagattgcttacaaccacc ( seq id : 3 ) ; bce1 : agtagttttgtgtataaacca ( seq id ไม่ dce1 : 4 ) : atacaattatatcaaaccagc ( seq id : 5 ) mce1 :



;aatactacttttacgttacac ( seq id : 6 ) ( อยู่ขั้นตอน ) ( adzhar et al . , นก
พยาธิวิทยา 25:817-836 , 1996 ; แคเวินแน็ก et al . , นกพยาธิวิทยา 28:593-6051999 ) เงื่อนไขปฏิกิริยาเป็นรีเวิร์ส transciptase ขั้นตอนที่ 45 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง 72 ° C เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่ 94 ° C เป็นเวลา 5 นาทีขั้นตอนการเพิ่มปริมาณเท่ากับ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 50 ° C เป็นเวลา 1.5 นาที 72 ° C เป็นเวลา 2 นาที ซ้ำ 30 ครั้ง ตามด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 2 นาที ที่ซ้อนกันขั้นตอนดำเนินการกับเงื่อนไขต่อไปนี้ : เริ่มต้นที่ 94 ° C (
เป็นเวลา 5 นาทีที่ 94 ° C ( เป็นเวลา 1 นาที50 ° C เป็นเวลา 1.5 นาที 72 ° C เป็นเวลา 2 นาที รวม 30 ครั้ง ตามด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 10
นาทีค้างไว้ที่ 4 องศา qpcr RT
ขั้นตอนการตรวจหา ib-qx
เวลาจริงสามารถดำเนินการกับปฏิกิริยา ปริมาณ 104 ของ sensifast SYBR สีเขียวต้นแบบผสม 0.84 ไพรเมอร์ฟอร์เวิร์ด 20 pmol ( cttatgcagtagtcaa ) ( seq id
:29 ) และรีเวิร์สรองพื้น ( cacgtggaatcatgcctgttat ) ( seq id : 30 ) 0.41 ของรีเวิร์ส transcriptase เอนไซม์ , 0.44 ของเลสซึ่ง 4ul ของแม่แบบและ 3.41 ของ ddh20 . เวลาจริงปฏิกิริยา PCR พบว่าใน lightcycler 480 เวลาจริง ) เครื่องดนตรี ( โรช , เยอรมัน )เงื่อนไขปฏิกิริยาเป็นรีเวิร์ส transciptase ขั้นตอนที่ 45 ° C เป็นเวลา 10 นาทีตามขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่ 94 ° C เป็นเวลา 2 นาที ขั้นตอนการเพิ่มปริมาณเท่ากับ 94 ° C เป็นเวลา 5 วินาที 50 ° C เป็นเวลา 10 วินาที 72 ° C และการแพร่เป็นเวลา 5 วินาที .ละลายโค้งการวิเคราะห์โปรไฟล์เป็น 95 องศา C เป็นเวลา 3 วินาที , 58 องศา C เป็นเวลา 1 นาที 95 องศา C และต่อเนื่อง ตามด้วย 45 ° C เป็นเวลาเย็น 30 วินาที .
. วิเคราะห์แยกแยะและ ibn-c90 . - ( x
( ก่อตั้งขึ้นโดยใช้คู่ไพรเมอร์ ( seq เดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ID
: 29 : 30 หมายเลข seq ) ที่ขยาย hyper ตัวแปรเขตของ S1 ยีน .
วิเคราะห์จำนวนของไขมันอิ่มตัวสูง หลอดสี ( evagreen ) 12.5u1 Master Mix
( sensimix bioline , ) , 2p1 25mm mgc12 0.50 ของไพรเมอร์คู่ แม่แบบและน้ำเกรด
PCR จำนวนโหลดลงเครื่องก็ microwell จาน และต้องตรวจแบบ PCR
ในเวลาจริงที่เครื่อง ( lightcycler 480 , โรช )
จักรยานความร้อนปฏิกิริยาประกอบด้วย ( เริ่มต้น ( 3 วินาทีที่ 95 องศา C ) การเพิ่มปริมาณประกอบด้วย
( ( 1 นาทีที่ 95 องศา C ) อบ ( 1 นาทีที่ 48 องศา C ) และนามสกุล ( 1 นาทีที่ 72 ° C ) pcr ได้ทันทีตามด้วยวีวีไอเอ็นจีกราฟการวิเคราะห์การ differentiations ของกลุ่มตัวอย่าง โดยการใช้จักบวกการควบคุมและในการเปรียบเทียบกับละลาย

โปรไฟล์ การตรวจสอบความไวของ RT PCR
เวลาจริงที่เข้มข้นของวัสดุอ้างอิงถูกวัดโดย UV Spectrophotometer .
ความเข้มข้นมาตรฐาน 10pg / ULความหมาย : การเจือจาง ( สิบพับอุทิศถวาย ) คือใช้จนกว่าการทดสอบไม่สามารถตรวจจับสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย ( ไม่มีสัญญาณตรวจจับ )

ต่อความจำเพาะของการทดสอบดำเนินการโดยการทดสอบโปรโตคอลกับสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ 5 ( IBV 793 / B IBV มวล , IBD ndv CAV รีโอไวรัส
, , ) ตัวอย่างการเรียงลำดับ
( จัดลำดับโดยตรง ) ถูกส่งไปเป็นลำดับ
พาณิชย์สิ่งอำนวยความสะดวกวิธีทำความสะอาดและเจลฟอกเสร็จตามขั้นตอนของผู้ผลิต ( ANALYTIK JENA , เยอรมัน ) รับวิเคราะห์ผลด้วยระเบิด ( เครื่องมือค้นหาการปรับพื้นฐานท้องถิ่น ) สำหรับการยืนยันของวัสดุอ้างอิง ผล

15 จาก 56 ( 26.8 % ) ตัวอย่างทดสอบบวกสำหรับสายพันธุ์ 793 / B ,เก้าจาก 56 ( 16% ) เป็นบวกสำหรับแมสซาชูเซตสายพันธุ์ ; 32 จาก 56 ( 57% ) เป็นบวกสำหรับ qx เหมือนสายพันธุ์ ; 18 จาก 56 ราย ( ร้อยละ 32 ) ซึ่งก่อนหน้านี้
รายงานเชิงลบสำหรับ IB พบเป็นบวกสำหรับ ib-qx เมื่อกำลังทดสอบ .
ความถูกต้องของจริง เวลา PCR assay เพื่อตรวจหาเฉพาะของ ib-qx ไว