(10 g/l bacto tryptone, 5 g/l yeast

(10 g/l bacto tryptone, 5 g/l yeast extract, 5 g/l NaCl, pH 7.5, 15 g/l agar, 100 µg/ml แอมพิซิลลิน). Plates were incubated overnight at 32°C. Infected cells were scraped from the agar plates using 50 ml 2xYT medium supplemented with 100
µg/ml แอมพิซิลลิน (2xYT/Amp). 50 ml 2xYT/Amp medium were inoculated with the appropriate volume of bacterial สารแขวนลอย to reach an OD550 of 0.08. The สิ่งเพาะเลี้ยง was incubated at 37°C on a shaker (160 rpm) until an OD550of0.5 was reached and then infected with helperphages (l.5x1011 pfu) by incubation for 15 min with gentle agitation and for 45 min on a shaker at 37°C. Subsequently, kanamycin was added to a final concentration of 70
µg/ml to select for bacteria that were infected by helperphages. Finally, expression of the pIII•

ไลโปคาลิน proteins was induced by addition of 25 ng/ml แอนไฮโดรเตตราไซคลิน.


[00163] Example 5: Identification of PCSK9-specific Tic มิวทีน by screening


[00164] The mutagenized central cassette of the ฟาสมิด preparation obtained after phage display selection, as described in Example 4, was isolated by digestion of the DNA with BstXl and subsequent purification via agarose gel electrophoresis using standard methods (Sambrook et al. 1989). The DNA was inserted into a likewise-cut เวกเตอร์ which allowed bacterial production of the มิวทีน under the control of a เตตราไซคลิน โปรโมเตอร์.
CaClz-competent TGl-F' cells were transformed with the ligation ของผสม and plated on LB/Amp plates. Individual colonies were used to inoculate 2xYT/Amp medium and grown overnight (14-18 h) to stationary phase. Subsequently, 50 µl 2xYT/Amp were inoculated from the stationary phase สิ่งเพาะเลี้ยง and incubated for 3h at 37°C and then shifted to 22°C until an OD595 of 0.6-0.8 was reached. ไลโปคาลิน-มิวทีน production was induced by addition of 10 µl
2xYT/Amp supplemented with 1.2 µg/ml แอนไฮโดรเตตราไซคลิน. สิ่งเพาะเลี้ยง were incubated at

22°C until the next day. After addition of 40 µl of 5% (w/v) BSA in PBS/T and incubation for lh at 25°C สิ่งเพาะเลี้ยง were ready for use in screening assays.

[00165] For selection ofไลโปคาลิน มิวทีน, human and ไซโนมอลกัส PCSK.9(1 µg/ml in PBS/T) as well as hPCSK9-D374Y mutant, which all carried a FLAG-tag, were captured on microtiterplates by means of an anti-FLAG-tag antibody (Sigma Aldrich, St. Louis, MO), which was coated on the plates the day before with an final concentration of 5 µg/ml in PBS. Subsequently, 20 µl of BSA-blocked สิ่งเพาะเลี้ยง were added and incubated for 1 h at 25°C. Bound ไลโปคาลิน มิวทีน were detected with a 1: 10000 dilution of anti-T7 antibody conjugated with HRP (Merck KgaA, Darmstadt) in PBS/T. For quantification, 20 µl QuantaBlu fluorogenic peroxidase substrate was added and measured at an excitation wavelength of 320 nm and an emission wavelength of 430 nm.

[00166] For แอฟฟินิตี้ ranking of ไลโปคาลิน มิวทีน, anti-Strep-tag antibody (IBA, Goettingen) in PBS was coated on microtiterplates and 20 µl of BSA-blocked สิ่งเพาะเลี้ยง were added, which allowed specific capture of ไลโปคาลิน มิวทีน on the plate. Different concentrations (0.5 - 5 nM) of biotinylated PCSK.9 proteins were added and specifically- • bound PCSK9 proteins were detected with extravidin-HRP (Sigma Aldrich, St. Louis, MO) after extensive washing. For quantification, 20 µl QuantaBlu was added and measured at an excitation wavelength of 320 nm and an emission wavelength of 430 nm.

[00167] Selection of competitive ไลโปคาลิน มิวทีน was performed by coating anti• FLAG-tag (5 µg/ml in PBS) on microtiterplates and subsequently capturing hPCSK9-D374Y mutant (1 µg/ml in PBS/T). Blocked สิ่งเพาะเลี้ยง were adjusted to 30 nM purified LDL receptor and added for 72 h to plates with captured hPCSK9-D374Y mutant. This allowed equilibration of the system and reliable selection of competitive มิวทีน. Bound receptor was detected with an HRP-conjugated anti-His-tag antibody (1 µg/ml in PBS/T; Abeam, Cambridge, UK). For quantification, 20 µl QuantaBlu fluorogenic peroxidase substrate was added and measured at an excitation wavelength of 320 nm and an emission wavelength of
430 nm.
[00168] Example 6: Affmity of representativeไลโปคาลิน มิวทีน to PCSK9


[00169] To measure the binding แอฟฟินิตี้ of a representative group of ไลโปคาลิน มิวทีน to biotinylated PCSK.9, a Surface Plasmon Resonance (SPR) based assay was employed utilizing a Biacore T200 instrument (GE Healthcare). For the SPR แอฟฟินิตี้ assay (Figure 1), the Biotin CAPture ชุดอุปกรณ์ (GE Healthcare) was used.

[00170] In each measurement cycle, Biotin CAPture Reagent (GE Healthcare) was applied to the reference and measurement channels of Sensor Chip CAP (GE Healthcare) for
5 min at a flow rate of 2 µI/min. Biotinylated PCSK9 at a concentration of 4. µg/ml was injected on the measurement channel for 2 min at a flow rate of 10 µI/min. To determine the แอฟฟินิตี้, three to four dilutions of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 10, SEQ ID NO: 11 and SEQ ID NO: 12 were prepared in HBS-EP+ (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl, 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20) buffer and applied to the chip surface, using concentrations of
500, 125, 31 and 8 nM for SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 11, and SEQ ID NO:

12, concentrations of 300, 75, 19 and 5 nM for SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO:

8, SEQ ID NO: 9 and SEQ ID NO: 10, and concentrations of 75, 19 and 5 nM for SEQ ID NO: 7. The binding assay was carried out with a contact time of 3 min, dissociation time of
20 min and applying a flow rate of 30 µI/min. All measurements were performed at 25°C. Regeneration of the Sensor Chip CAP surface was achieved with an injection of 6 M กัวนิดีน-HCl with 0.25 M NaOH (2 min) followed by an extra wash with running buffer and a stabilization period of 2 min. Prior to the measurements, one conditioning cycle consisting of three consecutive regeneration steps was performed. Data were evaluated with Biacore T200 Evaluation software (V 1.0). Double referencing was used. The 1: 1 binding แบบจำลอง was used to fit the raw data.

[00171] The resulting fit curves for SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 and SEQ ID NO: 11 are shown in Figure 1 (A-D), respectively. For example, the data shows that SEQ ID NO: 3 (รูป lA) bound with high แอฟฟินิตี้ to PCSK9 (Ko = 0.85 nM). Association rate constants k, หรือ kon, dissociation rate constants kd หรือ koff and the resulting dissociation constants Ko for all ไลโปคาลิน มิวทีน are summarized in Table 1 below.
[00172] Table 1:

+++
[00173] Example 7: Competitive mode of action of representative ไลโปคาลิน มิวทีน to PCSK9

[00174] Whether ไลโปคาลิน มิวทีน disclosed in Example 6 ยึดเกาะ to PCSK9 in a competitive mode was tested in vitro using a competition ELISA format. In this experiment, a constant concentration of ฮิวเมน PCSK9 (SEQ ID NO: 34) หรือ ฮิวเมน PCSK9_D374Y mutant was incubated with variable concentrations of ไลโปคาลิน มิวทีน for 1 h. After this pre• incubation in solution, an aliquot of the ไลโปคาลิน มิวทีน/PCSK9 ของผสม was transferred to an ELISA plate coated with human LDL-R to measure the concentration ofhPCSK9 that was not blocked to ยึดเกาะhLDL-R.

[00175] All incubation steps were performed with shaking at 300 rpm, and the plate was washed after each incubation step with 100 µl PBS-T buffer (PBS (Phosphate buffered saline), 0.05% Tween 20) for five times using a Biotek ELx405 select CW washer. In the first step, a 384-well fluorescence plate was coated with 20 µl of รีคอมบิแนนต์ human LDL-R (R&D Systems, Cat. No. 2148-LD/CF) at a concentration of 5 µg/ml in PBS over night at
4°C. After washing, the LDL-R-coated wells were blocked with 100 µl PBS-T/BSA (2% BSA (Bovine serum albumin) in PBS containing 0.05% Tween 20) for 1 h at room temperature ("RT").

[00176] A fixed concentration of 25 nM human PCSK9 หรือ of 0.25 nM ฮิวเมน PCSK9 D374Y mutant was incubated in solution with (i) varying concentrations of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, หรือ benchmark antibody of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 33, หรือ with (ii) SEQ ID NO: 2 as a negative control, using a starting concentration of 300 nM which was serially diluted at a 1 :3 ratio down to 5 pM in PBS-T/BSA buffer. After 1 h incubation at room temperature, 20 µl of the reaction ของผสม was transferred to the LDL-R-coated ELISA plate to capture unbound (free) หรือ non-competitively bound PCSK.9 for 20 min at RT. To allow for transformation of ELISA readout results into free hPCSK.9 concentrations (cf. below), a standard curve containing varying concentrations of hPCSK9 หรือ hPCSK9 _ D3 74Y mutant starting with 25 I 50 nM (1 :3 serially diluted in 11 steps) was prepared in PBS-T/BSA and incubated for 20 min on a MSD (MesoScaleDiscovery)plate as well.

[00177] To allow for detection and quantification of bound PCSK9, the residual supematants were discarded and 20 µl mouse-anti-Flag M2-ฮอร์สเรดิช เปอร์ออกซิเดส ("HRP") (Sigma-Aldrich) was added in a 1:5000 dilution in PBS-T/BSA and in

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

(tryptone bacto 10 g/l ยีสต์ 5 กรัม/l สารสกัดจาก 5 g/l NaCl, pH 7.5, agar 15 g/l, 100 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml แอมพิซิลลิน) แผ่นที่ incubated ค้างคืนที่ 32 องศาเซลเซียส เซลล์ที่ติดเชื้อถูกขูดจากแผ่น agar ใช้ 50 มล 2xYT กลางเสริม ด้วย 100แอมพิซิลลินไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml (2xYT/แอมป์) ขนาดกลาง 50 ml 2xYT/Amp ได้ inoculated ด้วยปริมาณที่เหมาะสมของแบคทีเรียสารแขวนลอยถึงการ OD550 0.08 สิ่งเพาะเลี้ยงถูก incubated ที่ 37° C ในเชคเกอร์ (160 รอบต่อนาที) จนถึงแล้ว ติด helperphages (l.5x1011 pfu) OD550of0.5 การ โดยคณะทันตแพทยศาสตร์ สำหรับ 15 นาทีมีอาการกังวลต่ออ่อนโยน และ 45 นาทีในเชคเกอร์ที่ 37 องศาเซลเซียส ในเวลาต่อมา กานามัยซินถูกเพิ่มความเข้มข้นสุดท้ายของ 70ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml ต้องการแบคทีเรียที่มีการติดเชื้อ โดย helperphages ในที่สุด ค่าของ pIII•ไลโปคาลินโปรตีนถูกเหนี่ยวนำ โดยเพิ่ม 25 ng/ml แอนไฮโดรเตตราไซคลิน[00163] ตัวอย่าง 5: การระบุเฉพาะ PCSK9 รับผลิตกระป๋องมิวทีน โดยคัดกรอง[00164] เทปเซ็นทรัล mutagenized เตรียมฟาสมิดที่ได้รับหลังจาก phage แสดงการเลือก ในตัวอย่าง 4 ถูกแบ่งแยกย่อยอาหารเอ็น BstXl และต่อมาฟอกผ่าน agarose เจ electrophoresis โดยใช้วิธีมาตรฐาน (Sambrook et al. 1989) ดีเอ็นเอถูกแทรกลงในเวกเตอร์ในทำนองเดียวกันตัดซึ่งอนุญาตให้แบคทีเรียผลิตมิวทีนภายใต้การควบคุมของเตตราไซคลินโปรโมเตอร์CaClz อำนาจ TGl-F' เซลล์แตกต่างของผสมไข่ และชุบบนแผ่น ปอนด์/Amp แต่ละอาณานิคมถูกใช้ฉีด 2xYT/แอมป์ กลาง และปลูกข้ามคืน (14-18 h) กับระยะ ในเวลาต่อมา 50 µl 2xYT/แอมป์ inoculated จากสิ่งเพาะเลี้ยงกับระยะ และ incubated สำหรับ h 3 ที่ 37° C แล้ว จาก 22° C จนถึงการ OD595 0.6-0.8 ผลิตไลโปคาลินมิวทีนถูกเหนี่ยวนำ โดยเพิ่ม 10 µl2xYT/แอมป์ เสริม ด้วย 1.2 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml แอนไฮโดรเตตราไซคลิน สิ่งเพาะเลี้ยงได้ incubated ที่22° C จนถึงวันถัดไป บีเอสเอใน PBS/T และคณะทันตแพทยศาสตร์สำหรับ lh ที่ 25° C สิ่งเพาะเลี้ยงก็ไม่พร้อมสำหรับการใช้ในการคัดกรอง assays หลังแห่ง µl 40 5% (w/v)[00165] เลือก ofไลโปคาลิน มิวทีน และไซโนมอลกัส PCSK.9 (1 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml ใน PBS/T) และ hPCSK9 D374Y mutant ซึ่งทั้งหมดดำเนินธงแท็ก ถูกจับบน microtiterplates โดยการต่อต้าน-FLAG-แท็กแอนติบอดี (Aldrich ซิก St. Louis, MO), ซึ่งถูกเคลือบบนแผ่นวันก่อนที่จะ มีความเข้มข้นสุดท้ายของไมโครกรัมเป็นเครื่อง 5 ml ใน PBS ในเวลาต่อมา 20 µl ของบีเอสเอบล็อคสิ่งเพาะเลี้ยงเพิ่ม และ incubated สำหรับ h 1 ที่ 25 องศาเซลเซียส มิวทีนไลโปคาลินผูกพบกับเจือจาง 1:10000 ของแอนติบอดีต้าน T7 กลวง มี HRP (ผล ดาร์มส) ใน PBS/ต. การนับ 20 µl QuantaBlu fluorogenic peroxidase พื้นผิวถูกเพิ่ม และวัดที่มีความยาวคลื่นในการกระตุ้นของ 320 nm และความยาวคลื่นการเล็ดรอดของ 430 nm[00166] สำหรับแอฟฟินิตี้การจัดอันดับของไลโปคาลินมิวทีน แอนติบอดีต่อต้าน-Strep-แท็ก (อิบา Goettingen) ใน PBS ถูกเคลือบบน microtiterplates และ 20 µl ของบีเอสเอบล็อคสิ่งเพาะเลี้ยง เพิ่ม ซึ่งได้จับภาพเฉพาะของไลโปคาลินมิวทีนในจาน ความเข้มข้นแตกต่างกัน (0.5 - 5 nM) มีเพิ่มโปรตีนของ biotinylated PCSK.9 และโดยเฉพาะ-•ผูก PCSK9 โปรตีนพบกับ extravidin-HRP (Aldrich ซิก St. Louis, MO) หลังจากซักผ้าอย่างละเอียด นับ 20 µl QuantaBlu ถูกเพิ่ม และวัดที่มีความยาวคลื่นในการกระตุ้นของ 320 nm และความยาวคลื่นการเล็ดรอดของ 430 nmตัวเลือก [00167] มิวทีนไลโปคาลินแข่งขันถูกดำเนินการ โดย anti• เคลือบป้ายธง (5 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml ใน PBS) microtiterplates และ hPCSK9 D374Y มาจับ mutant (1 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml ใน PBS/T) สิ่งเพาะเลี้ยงถูกบล็อคได้ปรับตัวรับ LDL nM บริสุทธิ์ 30 และเพิ่มสำหรับ 72 h แผ่นกับ mutant จับ hPCSK9-D374Y นี้ equilibration อนุญาตของระบบและเลือกเชื่อถือได้ของมิวทีนแข่งขัน ตัวรับผูกถูกตรวจพบมีแอนติบอดีต่อต้าน-His-แท็ก HRP กลวง (1 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml ใน PBS/T Abeam เคมบริดจ์ สหราชอาณาจักร) การนับ 20 µl QuantaBlu fluorogenic peroxidase พื้นผิวถูกเพิ่ม และวัดที่มีความยาวคลื่นในการกระตุ้นของ 320 nm และความยาวคลื่นการเล็ดรอดของ430 nm [00168] ตัวอย่าง 6: Affmity มิวทีน representativeไลโปคาลิน ถึง PCSK9[00169] วัดแอฟฟินิตี้รวมมิวทีนไลโปคาลิน biotinylated PCSK.9 มีผิว Plasmon การสั่นพ้อง (คอฟฟี่ช็อป/) ทดสอบตามที่พนักงานใช้เครื่องมือ Biacore T200 (GE สุขภาพ) กับกลุ่มตัวแทน สำหรับคอฟฟี่ช็อป/แอฟฟินิตี้ assay (รูปที่ 1), มีใช้ชุดอุปกรณ์จับไบโอติน (GE สุขภาพ)[00170] ในแต่ละรอบการประเมิน รีเอเจนต์ในการจับภาพไบโอติน (GE สุขภาพ) ใช้เพื่ออ้างอิงและประเมินช่องของเซ็นเซอร์ชิหมวก (GE สุขภาพ) สำหรับ5 นาทีที่อัตราการไหลของ 2 µI/นาที Biotinylated PCSK9 ที่ความเข้มข้น 4 ไมโครกรัมเป็น เครื่อง/ml ถูกฉีดบนสถานีวัดใน 2 นาทีที่อัตราการไหลของ µI 10 นาที กำหนดแอฟฟินิตี้ dilutions 3-4 ของลำดับ ID ไม่: 3 เลขรหัสลำดับ: 4 เลขรหัสลำดับ: 5 เลขรหัสลำดับ: 6 เลขรหัสลำดับ: 7 ไม่มีรหัสของลำดับ: 8 ลำดับ ID ไม่: 9 เลขรหัสลำดับ: 10 เลขรหัสลำดับ: 11 และเลขรหัสลำดับ: 12 ถูกเตรียมใน HBS-EP + (0.01 M HEPES pH 7.4, 0.15 M NaCl , 3 mM EDTA, 0.005% Surfactant P20) บัฟเฟอร์ และการนำไปใช้กับพื้นผิว ชิใช้ความเข้มข้นของ500, 125, 31 และ 8 nM สำหรับรหัสลำดับหมายเลข: 3 เลขรหัสลำดับ: 6 เลขรหัสลำดับ: 11 และลำดับ ID ไม่:12 ความเข้มข้นของ 300, 75, 19 และ 5 nM สำหรับรหัสลำดับหมายเลข: 4 ลำดับ ID ไม่: 5 ลำดับ ID ไม่:8 ลำดับ ID ไม่: 9 และเลขรหัสลำดับ: 10 และความเข้มข้น 75, 19 และ 5 nM ลำดับ ID ไม่: 7. วิเคราะห์ผูกถูกดำเนินการ ด้วยเวลาติดต่อ 3 นาที dissociation เวลา20 นาทีและใช้อัตราการไหลของ µI 30 นาที ดำเนินการประเมินทั้งหมดที่ 25 องศาเซลเซียส ฟื้นฟูผิวหมวกเซนเซอร์ชิสำเร็จกับฉีดของ HCl กัวนิดีน 6 M กับ 0.25 M NaOH (2 นาที) ตาม ด้วยการซักเพิ่มเติมบัฟเฟอร์และเป็นเวลา 2 นาทีก่อนการวัดเสถียรภาพ ทำการปรับวงจรหนึ่งที่ประกอบด้วยสามขั้นตอนฟื้นฟูต่อเนื่อง มีประเมินข้อมูล ด้วยซอฟแวร์ Biacore ประเมิน T200 (V 1.0) การอ้างอิงคู่ใช้ แบบจำลอง 1:1 ผูกใช้ให้พอดีกับข้อมูลดิบ[00171] งบพอดีกับเส้นโค้งสำหรับเลขรหัสลำดับ: 3 เลขรหัสลำดับ: 4 ลำดับ ID ไม่: 6 และเลขรหัสลำดับ: 11 มีแสดงในรูปที่ 1 (A-D), ตามลำดับ ตัวอย่าง ข้อมูลแสดงที่ลำดับ ID ไม่: 3 (รูปลา) กับ มีแอฟฟินิตี้สูง PCSK9 (เกาะ = 0.85 nM) ความสัมพันธ์อัตราค่าคงที่ k หรือคอน dissociation อัตราคงบีบหรือ koff และผลลัพธ์ dissociation ค่าคงที่ที่เกาะสำหรับมิวทีนไลโปคาลินทั้งหมดจะสรุปในตารางที่ 1 ข้างล่าง [00172] ตารางที่ 1:+++[00173] ตัวอย่าง 7: โหมดการแข่งขันของการดำเนินการของพนักงานไลโปคาลินมิวทีนถึง PCSK9[00174] ว่ามิวทีนไลโปคาลินที่เปิดเผยใน 6 ตัวอย่างยึดเกาะกับ PCSK9 ในโหมดการแข่งขันได้รับการทดสอบใน การแข่งขัน ELISA โดยใช้รูปแบบการ ในการทดลองนี้ ความเข้มข้นคงที่ของฮิวเมน PCSK9 (ลำดับ ID ไม่: 34) หรือฮิวเมน PCSK9_D374Y mutant ที่ incubated กับตัวแปรความเข้มข้นของมิวทีนไลโปคาลินสำหรับ 1 h หลังจากบ่มนี้ pre• ในโซลูชัน เป็นส่วนลงตัวของของผสม มิวทีน/PCSK9 ไลโปคาลินถูกถ่ายโอนไปจาน ELISA การเคลือบ ด้วยมนุษย์ LDL-R วัด ofhPCSK9 ความเข้มข้นที่ถูกบล็อกไม่ให้อาร์ ยึดเกาะhLDL[00175] ดำเนินทุกขั้นตอนการบ่ม ด้วยการสั่นที่ 300 rpm และมีล้างจานหลังจากแต่ละขั้นตอนบ่มกับ 100 µl PBS T บัฟเฟอร์ (PBS (น้ำเกลือฟอสเฟต buffered), 0.05% Tween 20) สำหรับครั้งที่ 5 โดยใช้เครื่อง Biotek ELx405 เลือกตามน้ำหนักจริงซักผ้า ในขั้นแรก จาน fluorescence 384-ดีถูกเคลือบ ด้วย 20 µl ของรีคอมบิแนนต์มนุษย์ LDL-R (R & D ระบบ แมว หมายเลข 2148 - LD/CF) ที่เข้มข้นของไมโครกรัมเป็นเครื่อง 5 ml ใน PBS ผ่านคืนที่4 องศาเซลเซียส หลังจากซักผ้า บล็อกบ่อ LDL-R-เคลือบ ด้วย 100 µl PBS-T/บี เอสเอ (2% บีเอสเอ (วัว serum albumin) ใน PBS ประกอบด้วย 0.05% Tween 20) สำหรับ h 1 ที่อุณหภูมิห้อง ("RT")[00176] A fixed concentration of 25 nM human PCSK9 หรือ of 0.25 nM ฮิวเมน PCSK9 D374Y mutant was incubated in solution with (i) varying concentrations of SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 8, หรือ benchmark antibody of SEQ ID NO: 29 and SEQ ID NO: 33, หรือ with (ii) SEQ ID NO: 2 as a negative control, using a starting concentration of 300 nM which was serially diluted at a 1 :3 ratio down to 5 pM in PBS-T/BSA buffer. After 1 h incubation at room temperature, 20 µl of the reaction ของผสม was transferred to the LDL-R-coated ELISA plate to capture unbound (free) หรือ non-competitively bound PCSK.9 for 20 min at RT. To allow for transformation of ELISA readout results into free hPCSK.9 concentrations (cf. below), a standard curve containing varying concentrations of hPCSK9 หรือ hPCSK9 _ D3 74Y mutant starting with 25 I 50 nM (1 :3 serially diluted in 11 steps) was prepared in PBS-T/BSA and incubated for 20 min on a MSD (MesoScaleDiscovery)plate as well.[00177] To allow for detection and quantification of bound PCSK9, the residual supematants were discarded and 20 µl mouse-anti-Flag M2-ฮอร์สเรดิช เปอร์ออกซิเดส ("HRP") (Sigma-Aldrich) was added in a 1:5000 dilution in PBS-T/BSA and in

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

(10 g / l bacto tryptone 5 g / l สารสกัดจากยีสต์, 5 g / l โซเดียมคลอไรด์, พีเอช 7.5, 15 กรัม / ลิตรวุ้น 100 ไมโครกรัม / มล. แอมพิซิลลิน) แผ่นถูกบ่มค้างคืนที่ 32 ° C เซลล์ที่ติดเชื้อถูกคัดลอกมาจากแผ่นวุ้นใช้ 50 มลกลาง 2xYT เสริมด้วย 100
ไมโครกรัม / มล. แอมพิซิลลิน (2xYT / แอมป์) 50 มล 2xYT / กลางแอมป์ถูกเชื้อที่มีปริมาณที่เหมาะสมของสารแขวนลอยแบคทีเรียไปถึง OD550 0.08 สิ่งเพาะเลี้ยงได้รับการบ่มที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียสบนเครื่องปั่น (160 รอบต่อนาที) จนกระทั่ง OD550of0.5 ก็มาถึงและติดเชื้อแล้วกับ helperphages (l.5x1011 PFU) โดยการบ่มเป็นเวลา 15 นาทีกับการกวนอ่อนโยนและเป็นเวลา 45 นาทีในเครื่องปั่น ที่อุณหภูมิ 37 องศาเซลเซียส ต่อมากานามัยซินถูกบันทึกอยู่ในความเข้มข้นสุดท้ายของ 70
ไมโครกรัม / มิลลิลิตรเพื่อเลือกสำหรับแบคทีเรียที่มีการติดเชื้อโดย helperphages สุดท้ายแสดงออกของ PIII •ไลโปคาลินโปรตีนที่ถูกชักนำโดยนอกเหนือจาก25 นาโนกรัม / มล. แอนไฮโดรเตตราไซคลิน. [00163] ตัวอย่างที่ 5: บัตรประจำตัวของ PCSK9 เฉพาะ Tic มิวทีนโดยการตรวจคัดกรอง[00164] ที่ mutagenized เทปกลางของฟาสมิดเตรียมรับหลังจากเลือกการแสดงผลทำลายจุลินทรีย์ที่อธิบายไว้ในตัวอย่างที่ 4, ที่แยกได้จากการย่อยอาหารของดีเอ็นเอที่มี BstXl และการทำให้บริสุทธิ์ตามมาผ่านข่าวคราว agarose โดยใช้วิธีการมาตรฐาน (Sambrook et al. 1989 ) ดีเอ็นเอถูกแทรกลงในทำนองเดียวกันตัดเวกเตอร์ที่ได้รับอนุญาตการผลิตแบคทีเรียของมิวทีนภายใต้การควบคุมของเตตราไซคลินโปรโมเตอร์. CaClz-อำนาจ TGL-F เซลล์ถูกเปลี่ยนด้วย ligation ของผสมและชุบ บนจาน LB / แอมป์ อาณานิคมส่วนบุคคลถูกนำมาใช้ในการฉีดวัคซีนกลาง 2xYT / แอมป์และเติบโตขึ้นในชั่วข้ามคืน (14-18 ชั่วโมง) เพื่อเฟส ต่อมา 50 ไมโครลิตร 2xYT / แอมป์ถูกเชื้อจากเฟสสิ่งเพาะเลี้ยงและบ่มเป็นเวลา 3h ที่ 37 องศาเซลเซียสและจากนั้นขยับไปที่ 22 องศาเซลเซียสจน OD595 ของ 0.6-0.8 ก็มาถึง ไลโปคาลิน - มิวทีนการผลิตที่เกิดจากการเพิ่มขึ้นของ 10 ไมโครลิตร2xYT / แอมป์เสริมด้วย 1.2 ไมโครกรัม / มล. แอนไฮโดรเตตราไซคลิน สิ่งเพาะเลี้ยงได้รับการบ่มที่22 องศาเซลเซียสจนกระทั่งวันรุ่งขึ้น หลังจากที่นอกเหนือจาก 40 ไมโครลิตร 5% (w / v) บีเอสเอในพีบีเอส / T และบ่มสำหรับ lh ที่ 25 ° C สิ่งเพาะเลี้ยงมีความพร้อมสำหรับการใช้งานในการตรวจคัดกรอง. [00165] สำหรับการเลือกของไลโปคาลินมิว ทีน, มนุษย์และไซโนมอลกัส PCSK.9 (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส / T) เช่นเดียวกับมนุษย์กลายพันธุ์ hPCSK9-D374Y ซึ่งทั้งหมดถือธงแท็กถูกจับใน microtiterplates โดยใช้วิธีการป้องกัน ธงแท็กแอนติบอดี (ซิกม่าดิช, เซนต์หลุยส์) ซึ่งถูกเคลือบบนจานวันก่อนที่จะมีความเข้มข้นสุดท้ายของ 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส ต่อมา 20 ไมโครลิตรของบีเอสเอถูกบล็อกสิ่งเพาะเลี้ยงมีการเพิ่มและบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่ 25 ° C Bound ไลโปคาลินมิวทีนที่ตรวจพบกับที่ 1: 10000 ลดสัดส่วนของแอนติบอดีต่อต้าน T7 ผันกับ HRP (Merck KGaA, Darmstadt) ในพีบีเอส / T สำหรับปริมาณ 20 ไมโครลิตร QuantaBlu พื้นผิว peroxidase แจงถูกบันทึกและวัดที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 320 นาโนเมตรและความยาวคลื่นปล่อย 430 นาโนเมตร. [00166] สำหรับแอฟฟินิตี้จัดอันดับของไลโปคาลินมิวทีน, การป้องกัน แอนติบอดี -Strep แท็ก (IBA, Goettingen) ในพีบีเอสได้รับการเคลือบบน microtiterplates และ 20 ไมโครลิตรของบีเอสเอถูกบล็อกสิ่งเพาะเลี้ยงที่ถูกเพิ่มซึ่งได้รับอนุญาตจับภาพเฉพาะของไลโปคาลินมิวทีนบนจาน ความเข้มข้นที่แตกต่างกัน (0.5-5 นาโนเมตร) ของโปรตีน biotinylated PCSK.9 ถูกเพิ่มและ specifically- •โปรตีน PCSK9 ที่ถูกผูกไว้กับตรวจพบ extravidin-HRP (ซิกม่าดิช, เซนต์หลุยส์) หลังจากล้างที่กว้างขวาง สำหรับปริมาณ 20 ไมโครลิตร QuantaBlu ถูกบันทึกและวัดที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 320 นาโนเมตรและความยาวคลื่นปล่อย 430 นาโนเมตร. [00167] การคัดเลือกในการแข่งขันไลโปคาลินมิวทีนได้ดำเนินการโดยการเคลือบป้องกัน•ธงแท็ก ( 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส) บน microtiterplates และต่อมากลายพันธุ์จับ hPCSK9-D374Y (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส / T) บล็อคสิ่งเพาะเลี้ยงมีการปรับถึง 30 นาโนเมตรรับ LDL บริสุทธิ์และเพิ่มเวลา 72 ชั่วโมงในการจับกับจานกลายพันธุ์ hPCSK9-D374Y นี้ได้รับอนุญาตสมดุลของระบบและการเลือกที่เชื่อถือได้ของการแข่งขันมิวทีน รับ Bound พบกับ HRP-ผันแอนติบอดีต่อต้านแท็กของเขา (1 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรในพีบีเอส / T; ขวางเคมบริดจ์สหราชอาณาจักร) สำหรับปริมาณ 20 ไมโครลิตร QuantaBlu พื้นผิว peroxidase แจงถูกบันทึกและวัดที่ความยาวคลื่นกระตุ้น 320 นาโนเมตรและความยาวคลื่นปล่อย430 นาโนเมตร. [00168] ตัวอย่างที่ 6: Affmity ตัวแทนไลโปคาลินมิวทีนที่จะ PCSK9 [00169 ] เพื่อตรวจจับแอฟฟินิตี้ของกลุ่มตัวแทนของไลโปคาลินมิวทีนที่จะ PCSK.9 biotinylated เป็นพื้นผิว Plasmon Resonance (SPR) ทดสอบตามถูกจ้างมาใช้เป็นเครื่องมือ Biacore T200 (GE Healthcare) . สำหรับ SPR แอฟฟินิตี้ทดสอบ (รูปที่ 1) ที่ไบโอตินจับภาพชุดอุปกรณ์ (GE Healthcare) ถูกนำมาใช้. [00,170] ในวงจรการวัดแต่ละไบโอตินจับภาพ Reagent (GE Healthcare) ถูกนำไปใช้กับช่องการอ้างอิงและการวัด เซนเซอร์ CAP ชิป (GE Healthcare) สำหรับ5 นาทีที่อัตราการไหล 2 μI / นาที ไบโอติน PCSK9 ที่ความเข้มข้น 4 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรถูกฉีดในช่องทางวัดเป็นเวลา 2 นาทีในอัตราการไหลของ 10 μI / นาที เพื่อตรวจสอบแอฟฟินิตี้, 03:57 เจือจางของ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 SEQ ID NO: 10 ID SEQ NO: 11 SEQ ID NO: 12 ได้จัดทำขึ้น HBS-EP + (0.01 M HEPES พีเอช 7.4, 0.15 M NaCl, EDTA 3 มิลลิ, 0.005% ลดแรงตึงผิว P20) บัฟเฟอร์ และนำไปใช้กับพื้นผิวของชิปที่ใช้ความเข้มข้น500, 125, 31 และ 8 นาโนเมตรสำหรับ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 11 และ SEQ ID NO: 12 ระดับความเข้มข้น 300, 75, 19 และ 5 นาโนเมตรสำหรับ SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 และ SEQ ID NO: 10 และความเข้มข้นของ 75, 19 และ 5 นาโนเมตรสำหรับ SEQ ID NO: 7 . การวิเคราะห์ผลผูกพันได้รับการดำเนินการที่มีเวลาเป็นเพื่อนกับ 3 นาทีเวลาของการแยกตัวออก20 นาทีและการใช้อัตราการไหล 30 μI / นาที วัดทั้งหมดได้ดำเนินการที่ 25 ° C การฟื้นฟูของพื้นผิวเซนเซอร์ CAP ชิปก็ประสบความสำเร็จด้วยการฉีด 6 M กัวนิดีน -HCl 0.25 M NaOH (2 นาที) ตามด้วยการล้างเป็นพิเศษกับการทำงานบัฟเฟอร์และระยะเวลาการรักษาเสถียรภาพของ 2 นาที ก่อนที่จะมีการตรวจวัดที่หนึ่งรอบเครื่องประกอบด้วยสามขั้นตอนการฟื้นฟูได้ดำเนินการติดต่อกัน ข้อมูลการประเมินด้วยซอฟแวร์ Biacore T200 ประเมินผล (V 1.0) อ้างอิงคู่ถูกนำมาใช้ 1: 1 ที่มีผลผูกพันแบบจำลองถูกนำมาใช้เพื่อให้พอดีกับข้อมูลดิบ. [00171] ผลโค้งเหมาะสำหรับ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 และ SEQ ID NO: 11 จะแสดงในรูป 1 (AD) ตามลำดับ ตัวอย่างเช่นข้อมูลแสดงให้เห็นว่า SEQ ID NO: 3 (รูป La) ที่ถูกผูกไว้กับสูงแอฟฟินิตี้ที่จะ PCSK9 (เกาะ = 0.85 นาโนเมตร) ค่าคงที่อัตราสมาคม k, กรณ์หรือค่าคงที่อัตราการแยกตัวออก KD หรือ Koff และค่าคงที่แยกออกจากกันส่งผลให้เกาะสำหรับทุกไลโปคาลินมิวทีนได้สรุปไว้ในตารางที่ 1 ด้านล่าง. [00172] ตารางที่ 1: +++ [00,173] ตัวอย่างที่ 7: โหมดการแข่งขันของการกระทำของตัวแทนไลโปคาลินมิวทีนที่จะ PCSK9 [00174] ไม่ว่าจะเป็นไลโปคาลินมิวทีนเปิดเผยในตัวอย่างที่ 6 ยึดเกาะเพื่อ PCSK9 ในโหมดการแข่งขันได้รับการทดสอบในหลอดทดลองใช้ รูปแบบการแข่งขัน ELISA ในการทดลองนี้มีความเข้มข้นอย่างต่อเนื่องของฮิวเมน PCSK9 (SEQ ID NO: 34) หรือฮิวเมนกลายพันธุ์ PCSK9_D374Y ถูกบ่มที่มีความเข้มข้นของตัวแปรไลโปคาลินมิวทีนเป็นเวลา 1 ชั่วโมง หลังจากนี้ก่อน•การบ่มในการแก้ปัญหาการหารของไลโปคาลินมิวทีน / PCSK9 ของผสมที่ถูกย้ายไปจาน ELISA เคลือบด้วย LDL-R ในการวัดของมนุษย์ความเข้มข้น ofhPCSK9 ที่ไม่ได้ปิดกั้นการยึดเกาะ hLDL -R. [00175] ทุกขั้นตอนการบ่มได้ดำเนินการเขย่าที่ 300 รอบต่อนาทีและจานถูกล้างหลังจากที่แต่ละขั้นตอนการบ่มด้วย 100 ไมโครลิตรบัฟเฟอร์พีบีเอส-T (พีบีเอส (ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ) 0.05% Tween 20) ห้าครั้งโดยใช้ Biotek ELx405 เลือกเครื่องซักผ้า CW ในขั้นตอนแรก, แผ่นเรืองแสง 384 ดีถูกเคลือบด้วย 20 ไมโครลิตรของรีคอมบิแนนต์ของมนุษย์ LDL-R (R & D Systems, แมว. เลขที่ 2148-LD / CF) ที่ความเข้มข้น 5 ไมโครกรัม / มิลลิลิตรใน พีบีเอสในช่วงคืนที่4 องศาเซลเซียส หลังจากล้างที่ LDL-R-เคลือบหลุมถูกบล็อกด้วย 100 ไมโครลิตรพีบีเอส-T / บีเอสเอ (2% บีเอสเอ (โคโปรตีนชนิดหนึ่งในซีรั่ม) ในพีบีเอสที่มี Tween 0.05 20%) เป็นเวลา 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง ("RT"). [ 00176] ความเข้มข้นคงที่ 25 นาโนเมตรของมนุษย์ PCSK9 หรือ 0.25 นาโนเมตรฮิวเมน PCSK9 กลายพันธุ์ D374Y ถูกบ่มในการแก้ปัญหาด้วย (i) ที่แตกต่างกันมีความเข้มข้นของ SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 8 หรือแอนติบอดีมาตรฐานของ SEQ ID NO: 29 SEQ ID NO: 33, หรือกับ (ii) SEQ ID NO: 2 เป็นตัวควบคุมเชิงลบโดยใช้ความเข้มข้นเริ่มต้นที่ 300 นาโนเมตรซึ่ง ถูกเจือจางลำดับที่ 1: 3 อัตราส่วนลงไปที่ 05:00 ในบัฟเฟอร์พีบีเอส-T / บีเอสเอ หลังจากการบ่ม 1 ชั่วโมงที่อุณหภูมิห้อง 20 ไมโครลิตรของปฏิกิริยาของผสมที่ถูกย้ายไปแผ่นวิธี ELISA LDL-R-เคลือบในการจับภาพหลุด (ฟรี) หรือที่ไม่สามารถแข่งขันได้ PCSK.9 ผูกไว้เป็นเวลา 20 นาทีที่ RT เพื่อให้การเปลี่ยนแปลงของผลการอ่านข้อมูลวิธี ELISA เข้าสู่ความเข้มข้น hPCSK.9 ฟรี (cf ด้านล่าง) เส้นโค้งที่มีมาตรฐานความเข้มข้นที่แตกต่างของ hPCSK9 หรือ hPCSK9 _ D3 กลายพันธุ์ 74Y เริ่มต้นด้วย 25 ผม 50 นาโนเมตร (1: 3 ปรับลดลำดับในขั้นตอนที่ 11) ถูกจัดทำขึ้นในพีบีเอส-T / บีเอสเอและบ่มเป็นเวลา 20 นาทีในเอ็มเอส (MesoScaleDiscovery) แผ่นเช่นกัน. [00177] เพื่ออนุญาตให้มีการตรวจสอบและการหาปริมาณของ PCSK9 ที่ถูกผูกไว้ที่ supematants ที่เหลือถูกทิ้งและ 20 ไมโครลิตรเมาส์ต่อต้านธง M2 - ฮอร์สเรดิชเปอร์ออกซิเดส ("HRP") (Sigma-Aldrich) ถูกเพิ่มเข้ามาใน 1: 5000 เจือจางในพีบีเอส-T / บีเอสเอและ

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

( 10 กรัม / ลิตร Bacto ทริพโทน 5 กรัมต่อลิตรและสารสกัดจากยีสต์ เกลือ 5 กรัมต่อลิตร pH 7.5 , 15 กรัม / ลิตรต่อ 100 µ g / ml แอมพิซิลลิน ) จานถูกบ่มค้างคืนที่ 32 องศา เซลล์ถูกขูดจากวุ้นแผ่นโดยใช้ 50 ml 2xyt เติม 100
µ g / ml แอมพิซิลลิน ( 2xyt / แอมป์ )50 ml 2xyt / แอมป์ขนาดกลาง ปลูกเชื้อด้วยปริมาณที่เหมาะสมของแบคทีเรียสารแขวนลอยจะถึง od550 เท่ากับ . การสิ่งเพาะเลี้ยงถูกบ่มที่ 37 ° C ในเครื่องปั่น ( 160 รอบต่อนาที ) จนกระทั่งมาถึง od550of0.5 แล้วติดเชื้อ helperphages ( l.5x1011 พีเอฟยู ) โดยระยะเวลา 15 นาทีด้วยความอ่อนโยนการกวนและ 45 นาทีบนเครื่องปั่นที่ 37 องศา ภายหลังนได้เพิ่มความเข้มข้นสุดท้าย 70
µ g / ml เพื่อเลือกสำหรับแบคทีเรียที่ติดเชื้อโดย helperphages . ในที่สุด สีหน้าของ piii A4

ไลโปคาลินโปรตีนถูกชักจูงโดยเพิ่ม 25 นาโนกรัม / มิลลิลิตรแอนไฮโดรเตตราไซคลิน


[ 00163 ] ตัวอย่างที่ 5 : การ pcsk9 เฉพาะ TIC มิวทีนคัดกรอง


โดย[ 00164 ] mutagenized กลางเทปของฟาสมิดเตรียมตัวรับหลังจากเลือกฟาจตามที่อธิบายไว้ในตัวอย่างที่ 4 แยก โดยการย่อย DNA และเอนไซม์บำบัดน้ำเสีย ตามมาด้วย bstxl ผ่านเจล ( ใช้วิธีมาตรฐาน ( sambrook et al . 1989 )ดีเอ็นเอที่ถูกแทรกลงในทำนองเดียวกันตัดเวกเตอร์ซึ่งได้รับอนุญาตการผลิตแบคทีเรียของมิวทีนภายใต้การควบคุมของเตตราไซคลินโปรโมเตอร์ .
caclz เชี่ยวชาญ tgl-f ' เซลล์ถูกเปลี่ยนด้วยของผสม Ligation และชุบบนปอนด์ ) แผ่น อาณานิคมบุคคลเคยฉีดวัคซีน 2xyt / แอมป์ขนาดกลาง และปลูกในชั่วข้ามคืน ( 14-18 H ) เฟสอยู่กับที่จำนวน 50 µผม 2xyt / แอมป์ปลูกเชื้อจากสิ่งเพาะเลี้ยงระยะ stationary บ่มที่ 37 ° C เป็นเวลา 3 และจากนั้นย้ายไป 22 ° C od595 0.6-0.8 จนกว่าของครบ ไลโปคาลิน - การผลิตมิวทีนถูกชักจูงโดยเพิ่ม 10 µ L
2xyt / แอมป์เสริม 1.2 µ g / ml แอนไฮโดรเตตราไซคลิน . สิ่งเพาะเลี้ยงอุณหภูมิ

22 ° C จนถึงวันถัดไป หลังจากเพิ่ม 40 µ L 5 % ( w / v ) BSA ใน PBS / T และบ่มที่อุณหภูมิ 25 ° C ลสิ่งเพาะเลี้ยงพร้อมสำหรับใช้ตรวจคัดกรอง 00165

[ ] เพื่อเลือกไลโปคาลินมิวทีนมนุษย์ และไซโนมอลกัส pcsk . 9 ( 1 µ g / ml ใน PBS / T ) รวมทั้ง hpcsk9-d374y กลายพันธุ์ ซึ่งทั้งหมดถือธงป้ายถูกจับใน microtiterplates โดยวิธีการป้องกันป้ายธงแอนติบอดี ( ซิกม่า Aldrich St . Louis , MO ) ซึ่งเคลือบบนแผ่นวันก่อนที่มีความเข้มข้นสุดท้าย 5 µ g / ml ใน PBS จำนวน 20 µ L ขนาดของบล็อกสิ่งเพาะเลี้ยงเพิ่มบ่มเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ที่อุณหภูมิ 25 องศา ผูกพันไลโปคาลินมิวทีนถูกตรวจพบด้วย 110 , 000 anti-t7 แอนติบอดีและเจือจางด้วย HRP ( กระตุ้นการท ดาร์มชตัท , ) ใน PBS / T . สำหรับปริมาณ 20 µผม quantablu fluorogenic peroxidase ( เพิ่มและวัดที่ความยาวคลื่น 320 nm และกระตุ้นการปล่อยความยาวคลื่น 430 nm .

[ 00166 ] สำหรับการจัดอันดับของแอฟฟินิตี้ไลโปคาลินมิวทีน anti Strep ( แท็กแอนติบอดี ๆ ,เกิททิงเงิน ) ใน PBS ถูกเคลือบบน microtiterplates 20 µ L ขนาดของบล็อกสิ่งเพาะเลี้ยงเพิ่มขึ้น ซึ่งได้รับอนุญาตให้จับเฉพาะของไลโปคาลินมิวทีนบนจาน ความเข้มข้นต่างกัน ( 0.5 - 5 nm ) ของไล pcsk 9 โปรตีนเพิ่มโดยเฉพาะ - - ผูก pcsk9 โปรตีนพบกับ extravidin HRP ( ซิกม่า Aldrich เซนต์ หลุยส์โม ) หลังจากล้างอย่างละเอียด สำหรับปริมาณ 20 µผม quantablu เพิ่มความตื่นเต้นและวัดที่ความยาวคลื่น 320 nm และปล่อยความยาวคลื่น 430 nm .

[ 00167 ] เลือกมิวทีนไลโปคาลินแข่งขันโดยใช้เคลือบ Anti - ป้ายธง ( 5 µ g / ml ใน PBS ) ใน microtiterplates และต่อมาจับ hpcsk9-d374y กลายพันธุ์ ( 1 µกรัม / ml ใน PBS / T )บล็อกสิ่งเพาะเลี้ยงกำลังปรับ 30 nm LDL receptor บริสุทธิ์และเพิ่มสำหรับ 72 ชั่วโมงเพื่อแผ่นจับ hpcsk9-d374y กลายพันธุ์ นี้ได้รับอนุญาต equilibration ของระบบและการเลือกที่เชื่อถือได้ของมิวทีนแข่งขัน ผูกไว้กับตัวรับที่ตรวจพบแอนติบอดีต่อต้าน HRP และแท็กของเขา ( 1 µ g / ml ใน PBS / t ; บีม , เคมบริดจ์ , UK ) สำหรับปริมาณ ,20 µผม quantablu fluorogenic peroxidase ( เพิ่มและวัดที่ความยาวคลื่น 320 nm และกระตุ้นการปล่อยความยาวคลื่น
430 nm .
[ 00168 ] ตัวอย่าง 6 : affmity ของตัวแทนไลโปคาลินมิวทีนเพื่อ pcsk9


[ 00169 ] วัดผูกแอฟฟินิตี้ของตัวแทนกลุ่มไลโปคาลินมิวทีนกับไล pcsk . ,พื้นผิว PLASMON เรโซแนนซ์ ( SPR ) ตามวิธีใช้ ใช้ biacore t200 เครื่องดนตรี ( GE Healthcare ) สำหรับกลยุทธ์แอฟฟินิตี้ assay ( รูปที่ 1 ) , ไบโอตินจับชุดอุปกรณ์ ( GE Healthcare ) คือใช้

[ 00170 ] ในแต่ละวัดรอบ biotin จับรีเอเจนต์ ( GE Healthcare ) มาใช้ในการอ้างอิงและช่องทางการวัดฝาครอบชิปเซ็นเซอร์ ( GE Healthcare )
5 นาที ที่อัตราการไหล 2 µผม / นาที ไล pcsk9 ความเข้มข้น 4 µ g / ml ฉีดในการวัดช่องสัญญาณสำหรับ 2 นาทีที่อัตราการ ไหลของ 10 µผม / นาที เพื่อตรวจสอบแอฟฟินิตี้ สามถึงสี่วิธีการ seq id ไม่ : 3 , seq id : 4 , seq id ไม่มี seq id : 5 : 6 : 7 , seq seq ไม่มี ID ไม่มี ID : 8 , seq id : 9 , seq id : 10 : 11 หมายเลข seq seq id ไม่ :12 ที่ถูกเตรียมไว้ใน hbs-ep ( 0.01 M ฮีเปส pH 7.4 0.15 M NaCl , 3 mM EDTA , 0.005 % สารลดแรงตึงผิว p20 ) บัฟเฟอร์ และใช้กับพื้นผิวชิปโดยใช้ความเข้มข้นของ
500 , 125 , 31 และ 8 nm สำหรับ seq id ไม่มี seq id : 3 : 6 , seq id ไม่มี : 11 seq และไม่มี ID :

12 ปริมาณ 300 , 75 , 19 และ 5 nm สำหรับ seq id : 4 , seq id : 5 , seq id :

8 , seq id : 9 และ seq id : 10 , และความเข้มข้นของ 7519 5 nm สำหรับ seq id : 7 ( รวมครั้งนี้ด้วยการติดต่อเวลา 3 นาที เวลาของ
20 นาทีและใช้อัตราการไหลของµผม 30 / นาทีวัดทั้งหมดจำนวน 25 ° C . ใหม่ของชิปเซ็นเซอร์ฝาบนได้ด้วยการฉีดยา 6 M HCl กับกัวนิดีน - 025 M NaOH ( 2 นาที ) ตามด้วยการล้างพิเศษกับวิ่งบัฟเฟอร์และเสถียรภาพเวลา 2 นาที ก่อนการวัด หนึ่งวงจรเครื่องปรับอากาศประกอบด้วยสามขั้นตอนการฟื้นฟูต่อเนื่องกำหนด ประมวลผลข้อมูลด้วยซอฟต์แวร์ประเมิน t200 biacore ( V 1.0 ) คู่อ้างอิงที่ใช้ 1 : 1 แบบจำลองผูกใช้กับข้อมูลดิบ .

[ 00171 ] ส่งผลให้พอดีกับเส้นโค้งสำหรับ seq id ไม่ : 3 , seq id : 4 , seq id : 6 และ seq ไม่มี ID : 11 แสดงในรูปที่ 1 ( AD ) , ตามลำดับ ตัวอย่างเช่น ข้อมูลแสดงให้เห็นว่าไม่มี seq id : 3 ( รูปลา ) ผูกไว้กับแอฟฟินิตี้สูง pcsk9 ( KO = 0.85 nm ) สมาคมค่าคงที่ K ค็อคโคนค่าคงที่การ KD ค็อค คอฟฟ์และผลของค่าคงที่การแตกตัวเกาะสำหรับมิวทีนไลโปคาลินทั้งหมดสรุปได้ในตารางที่ 1 ด้านล่าง ตารางที่ 1 : 00172
[ ]


[ 00173 ] ตัวอย่าง 7 : โหมดการแข่งขันของการกระทำของตัวแทนไลโปคาลินมิวทีนเพื่อ pcsk9

[ 00174 ] ไม่ว่าไลโปคาลินมิวทีนเปิดเผยในตัวอย่าง 6 ยึดเกาะเพื่อ pcsk9 ในโหมดแข่งขันทดสอบในหลอดทดลองโดยใช้รูปแบบการแข่งขัน 3 . ในการทดลองนี้มีค่าคงที่ของฮิวเมน pcsk9 ( seq id : 34 ) ค็อคฮิวเมน pcsk9_d374y กลายพันธุ์เป็นเชื้อตามความเข้มข้นของไลโปคาลินมิวทีนเป็นเวลา 1 ชั่วโมงหลังจาก pre - บ่มในสารละลายเป็นส่วนลงตัวของไลโปคาลินมิวทีน / pcsk9 ของผสมถูกโอนไปยังจาน + เคลือบด้วย ldl-r มนุษย์เพื่อวัดความเข้มข้น ofhpcsk9 ที่ไม่ได้ถูกปิดกั้น เพื่อยึดเกาะ hldl-r.

[ 00175 ] ทุกขั้นตอนการบ่มการเขย่า 300 รอบต่อนาที ,และจานถูกล้างหลังจากแต่ละขั้นตอนการบ่มด้วย 100 µผม pbs-t บัฟเฟอร์ ( PBS ( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ ) 0.05 เปอร์เซ็นต์ Tween 20 ) 5 ครั้ง โดยใช้ biotek elx405 เลือก CW เครื่องซักผ้า ในขั้นตอนแรกคือการเป็นแผ่นแล้วเคลือบด้วยµ 20 ลิตร ldl-r มนุษย์รีคอมบิแนนต์ ( R & D ระบบ , แมว ไม่ 2148-ld / CF ) ที่ระดับความเข้มข้น 5 µ g / ml ใน PBS ผ่านคืนที่
4 ° C