- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2.1. Plant material and chemicalsFl
2.1. Plant material and chemicals
Flowers of V. pompona ssp. grandiflora (Lindl.) Soto-Arenas were hand pollinated in October 2008 at selected wetland ecosystems of Madre de Dios, Peru. For a description of field research methods and the habitats, see Householder et al. (2010). Fruits were harvested during months three and half to nine after pollination. Herbarium voucher specimens (MC366, MC684, MC599, MC660, MC296, PM865 and JJ2671) were collected in duplicate sets and deposited at the San Marcos Herbarium in Lima, Peru, and at the BRIT Herbarium in Fort Worth, Texas. Specimens were identified by the late neotropical orchid experts E.A. Christenson and Miguel Soto-Arenas ( Householder et al., 2010). Details of these collections are posted in the Atrium Biodiversity Information System, programmed and managed at BRIT (http://atrium.andesamazon.org).
The standard compounds vanillin, vanillyl alcohol, vanillic acid, 4-hydroxybenzyl alcohol, 4-hydroxybenzaldehyde, 4-hydroxybenzoic acid, and anisyl alcohol, as well as Viscozyme (V2010, lot # 085K1587) and Celluclast (C2730, lot # 074K1156), were purchased from Sigma–Aldrich. Glucovanillin was obtained from Chromadex. Methanol (HPLC-grade) and ethanol (99.9%) were purchased from J.T. Baker, Co. The water used was Milli-Q-purified. The studies were performed with three individual fruits per month, except for month nine, in which six fruits were considered.
2.2. Humidity determination
Upon arrival to the laboratory, no more than two days after harvest, the fruits were frozen in liquid nitrogen and immediately lyophilized (LABCONCO, Freeze Dry System/Freezone 4.5) for 3–5 days. Humidity is expressed as percentages [(wwet − wdry/wwet) × 100].
2.3. Vanilla sample preparation
Individual lyophilized fruits were ground to a fine powder using an electric grinder (Sigma–Aldrich, model Z278181). Two grams of the ground material was Soxhlet-extracted with 48% aqueous EtOH (200 ml) for 24 h (Voisine, Carmichael, Chalier, Cormier, & Morin, 1992). The ethanol was removed by vacuum evaporation (150 mBar, 40 °C) and the aqueous, turbid solution was taken to 50 ml in a volumetric flask. Hydrolysis of the glucosides was achieved by incubating 10 ml of the extract with 150 μl of Viscozyme and 300 μl of Celluclast at 45 °C for 8 h (Inkubator 1000/Unimax 1010, Heildolph Instr.). Ethanol (4.5 ml) was added and the process continued for 1 h to yield the hydrolyzed fraction. The non-hydrolyzed portion followed the same procedure except for the enzyme addition. The volume of both samples was adjusted to 15 ml prior to HPLC analysis. The experiments were performed in duplicate. The vanilla extract was passed through a 25 mm PTFE 0.45 μm syringe filter prior to injection (10 μl) into the HPLC system. Each extract was evaluated in triplicate.
2.4. HPLC analysis
The samples were analysed on an Agilent 1200 series – DAD equipped with a binary pump unit (G1312A), UV–VIS detector (G1315D), degasser (G13798), column oven (G1316A), a 20 μl loop manual injector (G1328B) controlled by Chemstation software LC3D (Agilent Technologies, Inc.). The column used was a Cromolith RP – 18e (100 × 4.6 mm, Merck-Darmstadt), and the mobile phase a mixture of two solvents: A (1 × 10−3 M K – PO4, pH 3.1) and B (MeOH). Elution was achieved at 30 °C with a gradient of 3–7% B in 2 min (1.0 ml/min), 7–9% B in 10 min (1.0–2.0 ml/min), and 9–19% B in 7 min (2.0 ml/min). The compounds were monitored at: 230 nm for GV, vanillin, and alcohols 2, 4, and 7; 254 nm for vanillic acid and 4-hydroxybenzoic acid; and 280 nm for 4-hydroxybenzaldehyde. The injection volume was 10 μl, and all samples were filtered through a PTFE – 0.45 μm syringe filter (Millipore, Germany) prior to analysis. The LC–ESI-MS experiments were performed on a Bruker Daltonics Esquire 6000 controlled by Compass 1.3 for Esquire/HCT software (Bruker Daltonik GmbH). The HPLC system was as described for the HPLC-DAD. The gradient separation was carried out at 35 °C using a volatile mobile phase composed of solvents A (4.2 × 10−3 M Formic acid, pH 3.1) and B (MeOH), following the same gradient as above but at a flow rate of 1 ml/min. After reaching 19% B it was held isocratic for 16 min. The injection volume was 7 μl. The ESI-MS operating conditions were: positive ionisation mode, drying gas (N2) flow, 12 l/min; nebulizer pressure, 65 psi; gas drying temperature, 350 °C; capillary voltage 4000 V; scan mode m/z, 90–800. ESI-MS and UV-DAD spectra of authentic standards, 1–7 and GV, were recorded and used to corroborate identity. The semipreparative HPLC purification was conducted with a Cromolith RP – 18e (100 × 10 mm, Merck – Darmstadt) using the conditions established for the LC–ESI-MS run, but with a flow rate of 2.5 ml/min. The lyophilized extract (75 mg), dissolved in 1.5 ml of 30% aqueous ethanol, was injected through a 2 ml loop. Fraction collection was guided by retention time and UV spectra of the eluate.
2.5. Method validation
The HPLC method was validated according to ICH requirements (ICH, 1996). The external calibration curves were prepared with solutions containing compounds 1–7 in concentrations between 0.167 and 992.8 μg/ml. In the case of GV the range was 0.864–1035 μg/ml. The linearity was checked by regression analysis of at least six concentrations of each compound. Repeatability was confirmed by performing injections on the same day (intra-day precision, n = 5) at a given concentration of each compound. The intermediate precision was calculated over five different days (inter-day) at an established concentration per substance. Highly diluted solutions of each compound were used to achieve signal-to-noise (S/N) ratios of 3 (limit of detection, LOD) and 10 (limit of quantification, LOQ). The recovery of the complete analytical protocol was evaluated by the enrichment of vanilla samples (2 g) with 50 mg of compounds 1, 4, and 7, and 10 mg of 2, 3, 5, and 6. The recovery was expressed as the percentage of the total amount recovered. The process was repeated in triplicate. The fruits used for this study were nine-month old.
2.6. Statistical analysis
Statistical analysis of the data was carried out using IBM SPSS Statistics Version 19.0 (SPSS, Inc. Chicago, IL) and the multivariate analysis was performed using MATLAB software Version 7.11 (Matworks, Inc., Natick, MA). The PCA analysis was carried out using standardized variables.
3. Results and discussion
3.1. Humidity
The average humidity of intact V. pompona ssp. grandiflora fruits, three and a half to nine months old, is presented in Table 1. The observed increment of dry weight through fruit maturation has been noted earlier with V. planifolia fruits ( Brodelius, 1994). The size of the 24 fruits used to calculate humidity ranged from 10 to 25 cm in length and 2–4 cm in width.
Flowers of V. pompona ssp. grandiflora (Lindl.) Soto-Arenas were hand pollinated in October 2008 at selected wetland ecosystems of Madre de Dios, Peru. For a description of field research methods and the habitats, see Householder et al. (2010). Fruits were harvested during months three and half to nine after pollination. Herbarium voucher specimens (MC366, MC684, MC599, MC660, MC296, PM865 and JJ2671) were collected in duplicate sets and deposited at the San Marcos Herbarium in Lima, Peru, and at the BRIT Herbarium in Fort Worth, Texas. Specimens were identified by the late neotropical orchid experts E.A. Christenson and Miguel Soto-Arenas ( Householder et al., 2010). Details of these collections are posted in the Atrium Biodiversity Information System, programmed and managed at BRIT (http://atrium.andesamazon.org).
The standard compounds vanillin, vanillyl alcohol, vanillic acid, 4-hydroxybenzyl alcohol, 4-hydroxybenzaldehyde, 4-hydroxybenzoic acid, and anisyl alcohol, as well as Viscozyme (V2010, lot # 085K1587) and Celluclast (C2730, lot # 074K1156), were purchased from Sigma–Aldrich. Glucovanillin was obtained from Chromadex. Methanol (HPLC-grade) and ethanol (99.9%) were purchased from J.T. Baker, Co. The water used was Milli-Q-purified. The studies were performed with three individual fruits per month, except for month nine, in which six fruits were considered.
2.2. Humidity determination
Upon arrival to the laboratory, no more than two days after harvest, the fruits were frozen in liquid nitrogen and immediately lyophilized (LABCONCO, Freeze Dry System/Freezone 4.5) for 3–5 days. Humidity is expressed as percentages [(wwet − wdry/wwet) × 100].
2.3. Vanilla sample preparation
Individual lyophilized fruits were ground to a fine powder using an electric grinder (Sigma–Aldrich, model Z278181). Two grams of the ground material was Soxhlet-extracted with 48% aqueous EtOH (200 ml) for 24 h (Voisine, Carmichael, Chalier, Cormier, & Morin, 1992). The ethanol was removed by vacuum evaporation (150 mBar, 40 °C) and the aqueous, turbid solution was taken to 50 ml in a volumetric flask. Hydrolysis of the glucosides was achieved by incubating 10 ml of the extract with 150 μl of Viscozyme and 300 μl of Celluclast at 45 °C for 8 h (Inkubator 1000/Unimax 1010, Heildolph Instr.). Ethanol (4.5 ml) was added and the process continued for 1 h to yield the hydrolyzed fraction. The non-hydrolyzed portion followed the same procedure except for the enzyme addition. The volume of both samples was adjusted to 15 ml prior to HPLC analysis. The experiments were performed in duplicate. The vanilla extract was passed through a 25 mm PTFE 0.45 μm syringe filter prior to injection (10 μl) into the HPLC system. Each extract was evaluated in triplicate.
2.4. HPLC analysis
The samples were analysed on an Agilent 1200 series – DAD equipped with a binary pump unit (G1312A), UV–VIS detector (G1315D), degasser (G13798), column oven (G1316A), a 20 μl loop manual injector (G1328B) controlled by Chemstation software LC3D (Agilent Technologies, Inc.). The column used was a Cromolith RP – 18e (100 × 4.6 mm, Merck-Darmstadt), and the mobile phase a mixture of two solvents: A (1 × 10−3 M K – PO4, pH 3.1) and B (MeOH). Elution was achieved at 30 °C with a gradient of 3–7% B in 2 min (1.0 ml/min), 7–9% B in 10 min (1.0–2.0 ml/min), and 9–19% B in 7 min (2.0 ml/min). The compounds were monitored at: 230 nm for GV, vanillin, and alcohols 2, 4, and 7; 254 nm for vanillic acid and 4-hydroxybenzoic acid; and 280 nm for 4-hydroxybenzaldehyde. The injection volume was 10 μl, and all samples were filtered through a PTFE – 0.45 μm syringe filter (Millipore, Germany) prior to analysis. The LC–ESI-MS experiments were performed on a Bruker Daltonics Esquire 6000 controlled by Compass 1.3 for Esquire/HCT software (Bruker Daltonik GmbH). The HPLC system was as described for the HPLC-DAD. The gradient separation was carried out at 35 °C using a volatile mobile phase composed of solvents A (4.2 × 10−3 M Formic acid, pH 3.1) and B (MeOH), following the same gradient as above but at a flow rate of 1 ml/min. After reaching 19% B it was held isocratic for 16 min. The injection volume was 7 μl. The ESI-MS operating conditions were: positive ionisation mode, drying gas (N2) flow, 12 l/min; nebulizer pressure, 65 psi; gas drying temperature, 350 °C; capillary voltage 4000 V; scan mode m/z, 90–800. ESI-MS and UV-DAD spectra of authentic standards, 1–7 and GV, were recorded and used to corroborate identity. The semipreparative HPLC purification was conducted with a Cromolith RP – 18e (100 × 10 mm, Merck – Darmstadt) using the conditions established for the LC–ESI-MS run, but with a flow rate of 2.5 ml/min. The lyophilized extract (75 mg), dissolved in 1.5 ml of 30% aqueous ethanol, was injected through a 2 ml loop. Fraction collection was guided by retention time and UV spectra of the eluate.
2.5. Method validation
The HPLC method was validated according to ICH requirements (ICH, 1996). The external calibration curves were prepared with solutions containing compounds 1–7 in concentrations between 0.167 and 992.8 μg/ml. In the case of GV the range was 0.864–1035 μg/ml. The linearity was checked by regression analysis of at least six concentrations of each compound. Repeatability was confirmed by performing injections on the same day (intra-day precision, n = 5) at a given concentration of each compound. The intermediate precision was calculated over five different days (inter-day) at an established concentration per substance. Highly diluted solutions of each compound were used to achieve signal-to-noise (S/N) ratios of 3 (limit of detection, LOD) and 10 (limit of quantification, LOQ). The recovery of the complete analytical protocol was evaluated by the enrichment of vanilla samples (2 g) with 50 mg of compounds 1, 4, and 7, and 10 mg of 2, 3, 5, and 6. The recovery was expressed as the percentage of the total amount recovered. The process was repeated in triplicate. The fruits used for this study were nine-month old.
2.6. Statistical analysis
Statistical analysis of the data was carried out using IBM SPSS Statistics Version 19.0 (SPSS, Inc. Chicago, IL) and the multivariate analysis was performed using MATLAB software Version 7.11 (Matworks, Inc., Natick, MA). The PCA analysis was carried out using standardized variables.
3. Results and discussion
3.1. Humidity
The average humidity of intact V. pompona ssp. grandiflora fruits, three and a half to nine months old, is presented in Table 1. The observed increment of dry weight through fruit maturation has been noted earlier with V. planifolia fruits ( Brodelius, 1994). The size of the 24 fruits used to calculate humidity ranged from 10 to 25 cm in length and 2–4 cm in width.
0/5000
2.1 การปลูกวัสดุและเคมีภัณฑ์ดอกไม้ของ V. pompona ssp. ซาก (Lindl) Soto สถานถูกมือ pollinated ในเดือน 2008 ตุลาคมในระบบนิเวศพื้นที่ชุ่มน้ำที่เลือกของ Madre de Dios เปรู สำหรับคำอธิบายของฟิลด์วิธีวิจัยและอยู่อาศัย ดูคฤหัสถ์ร้อยเอ็ด al. (2010) ผลไม้เก็บเกี่ยวในช่วงเดือนสามและครึ่งถึงเก้าหลัง pollination หอพรรณไม้สำคัญไว้เป็นตัวอย่าง (MC366, MC684, MC599, MC660, MC296, PM865 และ JJ2671) ถูกรวบรวมไว้ในชุดซ้ำ และฝาก ที่หอพรรณไม้ San Marcos ในลิมา เปรู และ ที่หอพรรณ ไม้อุโมงค์ในฟอร์ตเวิร์ธ เท็กซัส ไว้เป็นตัวอย่างที่ระบุ โดยสาย neotropical กล้วยไม้ผู้เชี่ยวชาญ E.A. Christenson และ Miguel Soto-อาเรนัส (คฤหัสถ์ร้อยเอ็ด al., 2010) รายละเอียดชุดจะลงในระบบฐานข้อมูลความหลากหลายทางชีวภาพเอเทรียม โปรแกรม และจัดการที่อุโมงค์ (http://atrium.andesamazon.org)มาตรฐานสารวานิลลิน vanillyl แอลกอฮอล์ กรด vanillic แอลกอฮอล์ 4-hydroxybenzyl, 4 hydroxybenzaldehyde, 4-hydroxybenzoic กรด และ anisyl แอลกอฮอล์ ตลอดจน Viscozyme (V2010 ล็อต#085 K 1587) กับ Celluclast (C2730 ล็อต 1156 #074 K), ถูกซื้อจากซิก-Aldrich Glucovanillin ได้รับจาก Chromadex เมทานอล (HPLC เกรด) และเอทานอล (99.9%) ซื้อจาก J.T. เบเกอร์ จำกัด น้ำที่ใช้ได้ที่-Q-บริสุทธิ์ ศึกษาได้ทำกับผลไม้แต่ละสามต่อเดือน ยกเว้นเดือนเก้า ที่ 6 ผลไม้ถูกพิจารณา2.2. กำหนดความชื้นเมื่อมาถึงห้องปฏิบัติการ ไม่เกิน 2 วันหลังการเก็บเกี่ยว ผลไม้ถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและ lyophilized ทันที (LABCONCO ตรึงแห้ง ระบบ/Freezone 4.5) 3-5 วัน ความชื้นจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ [(wwet − wdry/wwet) × 100]2.3. ตัวอย่างวานิลลาบุคคล lyophilized ผลไม้ได้พื้นละอองใช้โม่ไฟฟ้า (ซิก-Aldrich รุ่น Z278181) กรัมสองวัสดุพื้นถูกสกัด Soxhlet 48% (200 ml) EtOH อควีใน 24 h (Voisine, Carmichael, Chalier, Cormier และโม ริน 1992) เอทานอลถูกเอาออกจากเครื่องระเหย (150 mBar, 40 ° C) และโซลูชัน turbid อควีถูกนำไป 50 ml ในหนาว volumetric ไฮโตรไลซ์ glucosides ที่สำเร็จ โดย incubating 10 ml ของสารสกัด 150 μl ของ Viscozyme และ μl Celluclast 300 ที่ 45 ° C สำหรับ 8 h (Inkubator 1000/Unimax 1010, Heildolph Instr.) เพิ่มเอทานอล (4.5 ml) และกระบวนการอย่างต่อเนื่องสำหรับ 1 h ให้เศษ hydrolyzed ส่วนไม่ใช่ hydrolyzed ตามกระบวนการเดียวกันยกเว้นการเพิ่มเอ็นไซม์ ปริมาตรของตัวอย่างทั้งสองถูกปรับ 15 ml ก่อนวิเคราะห์ HPLC การทดลองถูกทำสำเนา สารสกัดวานิลลาถูกส่งผ่านผ่าน 25 มม.ไฟเบอร์ 0.45 μm เข็มตัวก่อนฉีด (10 μl) เข้าระบบ HPLC สารสกัดแต่ละถูกประเมินใน triplicate2.4 การการวิเคราะห์ HPLCตัวอย่างที่ analysed ชุด Agilent 1200 – พ่อพร้อมหน่วยปั๊มไบนารี (G1312A), เครื่องตรวจจับ UV – VIS (G1315D), degasser (G13798) คอลัมน์เตา (G1316A) 20 μl วนเองอัด (G1328B) ถูกควบคุม โดยซอฟต์แวร์ Chemstation LC3D (Agilent เทคโนโลยี Inc.) คอลัมน์ที่ใช้เป็นแบบ Cromolith RP-18e (100 × 4.6 มม. เมอร์คดาร์มส), และผสมกันหรือสารทำละลาย 2 เฟสมือถือ: (1 × 10−3 M K – PO4, pH 3.1) และ B (ทานอล Elution สำเร็จที่ 30 ° C มีการไล่ระดับสีของ B 3 – 7% ใน 2 นาที (1.0 ml/min), B 7-9% ใน 10 นาที (1.0 – 2.0 ml/min), และ B 9-19% ใน 7 นาที (2.0 ml/min) มีการตรวจสอบสารประกอบที่: 230 nm สำหรับจีวี วานิลลิน และ alcohols 2, 4 และ 7 254 nm vanillic กรดและกรด 4-hydroxybenzoic และ 280 นาโนเมตรสำหรับ 4 hydroxybenzaldehyde ปริมาณฉีด 10 μl และตัวอย่างทั้งหมดถูกกรองผ่านไฟเบอร์ – 0.45 μm เข็มกรอง (มาก เยอรมนี) ก่อนที่จะวิเคราะห์ ทดลอง LC – ESI-MS ได้ทำบนโฮ 6000 Daltonics Bruker ควบคุมซอฟต์แวร์ โฮ/HCT (Bruker Daltonik GmbH) 1.3 เข็มทิศ ระบบ HPLC ได้ตามที่อธิบายไว้สำหรับ HPLC-พ่อ แยกการไล่ระดับสีได้ดำเนินที่ 35 ° C โดยใช้ระเหยเคลื่อนเฟสประกอบหรือสารทำละลาย A (4.2 × 10−3 กรด M Formic, pH 3.1) และ B (ทานอล ต่อไล่ระดับเดียวกัน กับข้างบน แต่ ในอัตราการไหล 1 มิลลิลิตร/นาที หลังจากถึง 19% B จะถูกจัดขึ้น isocratic คิดใน 16 นาที ปริมาณฉีดได้ 7 μl ESI-MS มีการทำงาน: โหมด ionisation บวก ขั้นตอนการอบแห้ง (N2) ก๊าซ 12 l/min ฝอยละอองความดัน 65 psi ก๊าซแห้งอุณหภูมิ 350 ° C แรงเส้นเลือดฝอย 4000 V สแกนโหมด m/z, 90-800 ESI MS และ UV-พ่อแรมสเป็คตรามาตรฐานแท้ 1 – 7 และจี วี ถูกบันทึก และใช้รหัสประจำตัว corroborate วิธีการฟอก HPLC semipreparative กับ Cromolith RP-18e (100 × 10 มม. เมอร์ค – ดาร์มส) ใช้ก่อตั้งขึ้น สำหรับเรียกใช้ LC – ESI-MS แต่ ด้วยอัตราการไหลของ 2.5 ml/min ที่ lyophilized สารสกัด (75 mg), ละลายใน 1.5 ml ของ 30% อควีเอทานอล ถูกฉีดผ่านวน 2 ml ชุดเศษส่วนมีตัว โดยเก็บข้อมูลเวลาและ UV แรมสเป็คตราของ eluate ใน2.5. วิธีตรวจสอบวิธี HPLC ถูกตรวจสอบตามข้อกำหนดของ ICH (ICH, 1996) เส้นโค้งเทียบภายนอกถูกเตรียม ด้วยโซลูชั่นที่ประกอบด้วยสารประกอบ 1 – 7 ในความเข้มข้นระหว่าง 0.167 992.8 μg/ml ในกรณีของจีวี ช่วงถูก 0.864 – 1035 μg/ml แบบดอกไม้ที่ถูกตรวจสอบ โดยการวิเคราะห์การถดถอยของความเข้มข้นน้อยหกของสารประกอบแต่ละ ทำซ้ำในได้รับการยืนยัน โดยการฉีดในวันเดียว (อินทราวันแม่นยำ n = 5) ที่ความเข้มข้นที่กำหนดของแต่ละบริเวณ ความแม่นยำระดับปานกลางไม่ได้ห้าวันต่าง ๆ (ระหว่างวัน) ที่มีความเข้มข้นขึ้นต่อสาร โซลูชั่นสูงแตกออกของสารประกอบแต่ละถูกใช้เพื่อให้บรรลุอัตราส่วน (S/N) สัญญาณเสียง 3 (ขีดจำกัดของการตรวจสอบ ลอด) และ 10 (จำนวนนับ LOQ) การฟื้นตัวของโพรโทคอลการวิเคราะห์สมบูรณ์ถูกประเมิน โดยขอตัวอย่างวานิลลา (2 กรัม) กับ 50 มิลลิกรัมของสาร 1, 4 และ 7, 2, 3, 5, 6 และ 10 มก. การกู้คืนถูกแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของยอดรวมเงินกู้ การถูกทำซ้ำใน triplicate ผลไม้ที่ใช้ในการศึกษานี้ได้เก้าเก่า - เดือน2.6. สถิติวิเคราะห์การวิเคราะห์ข้อมูลทางสถิติทำออกใช้ IBM โปรแกรมสถิติรุ่น 19.0 (โปรแกรม Inc. ชิคาโก IL) และทำการวิเคราะห์ตัวแปรพหุโดยใช้ MATLAB ซอฟต์แวร์รุ่น 7.11 (Matworks, Inc., Natick, MA) การวิเคราะห์ PCA ที่ดำเนินการโดยใช้ตัวแปรมาตรฐาน3. ผลลัพธ์ และสนทนา3.1. ความชื้นความชื้นเฉลี่ยของเหมือนเดิม V. pompona ssp. ซากผลไม้ สามครึ่งถึงเก้าเดือนเก่า นำเสนอในตารางที่ 1 การสังเกตเพิ่มขึ้นของน้ำหนักแห้งโดยผลไม้พ่อแม่มีการตั้งข้อสังเกตก่อนหน้ากับ V. planifolia ผลไม้ (Brodelius, 1994) ขนาดของผลไม้ 24 ที่ใช้ในการคำนวณความชื้นอยู่ในช่วงตั้งแต่ 10 ถึง 2 – 4 ซม.ความกว้างและความยาว 25 ซม.
การแปล กรุณารอสักครู่..
2.1 วัสดุจากพืชและสารเคมี
ดอกไม้ของวีเอสเอส pompona grandiflora (Lindl.) Soto-Arenas ถูกมือเรณูในเดือนตุลาคม 2008 ในระบบนิเวศพื้นที่ชุ่มน้ำที่เลือกของ Madre de Dios, เปรู สำหรับรายละเอียดของวิธีการวิจัยภาคสนามและที่อยู่อาศัยให้ดูเจ้าของบ้าน et al, (2010) ผลไม้ที่เก็บเกี่ยวในช่วงเดือนสามและครึ่งหนึ่งถึงเก้าหลังจากการผสมเกสร ตัวอย่างบัตรกำนัลสมุนไพร (MC366, MC684, MC599, MC660, MC296, PM865 และ JJ2671) ถูกเก็บไว้ในชุดที่ซ้ำกันและนำไปฝากไว้ที่หอพรรณไม้ซานมาร์คอสในกรุงลิมาเปรูและที่บริตสมุนไพรในฟอร์ตเวิร์ ธ เท็กซัส ชิ้นงานที่ถูกระบุโดยสายผู้เชี่ยวชาญด้านกล้วยไม้ neotropical EA Christenson และมิเกล Soto-Arenas (เจ้าของบ้าน et al., 2010) รายละเอียดของคอลเลกชันเหล่านี้จะถูกโพสต์ในเอเทรียมความหลากหลายทางชีวภาพระบบสารสนเทศโปรแกรมและการบริหารจัดการที่บริต (http://atrium.andesamazon.org). สารมาตรฐาน vanillin, vanillyl แอลกอฮอล์กรด vanillic แอลกอฮอล์ 4 hydroxybenzyl 4 hydroxybenzaldehyde, กรด 4 hydroxybenzoic และเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ anisyl เช่นเดียวกับ Viscozyme (V2010 มาก # 085K1587) และ Celluclast (C2730 มาก # 074K1156) ถูกซื้อมาจาก Sigma-Aldrich Glucovanillin ที่ได้รับจาก ChromaDex เมทานอล (HPLC เกรด) และเอทานอล (99.9%) ได้รับซื้อมาจากเจเบเกอร์ จำกัด น้ำที่ใช้เป็นพัน-Q บริสุทธิ์ การศึกษาได้ดำเนินการกับบุคคลที่สามผลไม้ต่อเดือนยกเว้นเดือนเก้าที่หกผลไม้ได้รับการพิจารณา. 2.2 ความมุ่งมั่นความชื้นเมื่อมาถึงยังห้องปฏิบัติการไม่เกินสองวันหลังจากการเก็บเกี่ยวผลไม้ที่ถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและทันทีที่แห้ง (LABCONCO ระบบแห้งแช่แข็ง / Freezone 4.5) สำหรับ 3-5 วัน ความชื้นจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ [(wwet - wdry / wwet) × 100]. 2.3 ตัวอย่างวานิลลาเตรียมผลไม้แห้งส่วนบุคคลมาบดให้เป็นผงละเอียดโดยใช้เครื่องบดไฟฟ้า (Sigma-Aldrich รุ่น Z278181) สองกรัมของวัสดุพื้นดินที่ถูกวิธีการสกัดแบบ-สกัดด้วยน้ำ 48% EtOH (200 มล.) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (Voisine, คาร์ไมเคิ Chalier ไมเออร์และโม, 1992) เอทานอลจะถูกลบออกโดยการระเหยสูญญากาศ (150 mBar 40 ° C) และน้ำ, การแก้ปัญหาขุ่นถูกนำตัวไป 50 มล. ในขวดปริมาตร การย่อยสลายของ glucosides ก็ประสบความสำเร็จจากการบ่ม 10 มล. ของสารสกัดจาก 150 ไมโครลิตรของ Viscozyme และ 300 ไมโครลิตรของ Celluclast ที่ 45 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 8 ชั่วโมง (Inkubator 1000 / Unimax 1010 Heildolph Instr.) เอทานอล (4.5 ml) ถูกบันทึกและประมวลผลอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้ส่วนไฮโดรไลซ์ ส่วนที่ไม่ใช่ไฮโดรไลซ์ตามขั้นตอนเดียวกันยกเว้นสำหรับการเพิ่มเอนไซม์ ปริมาณของกลุ่มตัวอย่างทั้งสองมีการปรับถึง 15 มล. ก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ HPLC ทดลองดำเนินการในที่ซ้ำกัน วานิลลาก็ผ่านไปผ่าน 25 มม PTFE กรอง 0.45 ไมครอนเข็มก่อนที่จะมีการฉีด (10 ไมโครลิตร) ลงในระบบ HPLC สารสกัดแต่ละคนได้รับการประเมินในเพิ่มขึ้นสามเท่า. 2.4 การวิเคราะห์ HPLC ตัวอย่างวิเคราะห์ใน Agilent 1200 ซีรีส์ - DAD พร้อมกับหน่วยปั๊มไบนารี (G1312A) เครื่องตรวจจับรังสี UV-VIS (G1315D) degasser (G13798) เตาอบคอลัมน์ (G1316A) หัวฉีดคู่มือห่วงไมโครลิตร 20 (G1328B ) ควบคุมโดยซอฟต์แวร์ LC3D ChemStation (Agilent Technologies, Inc) คอลัมน์ที่ใช้เป็น Cromolith RP - 18e (100 × 4.6 มมเมอร์ค-Darmstadt) และเฟสเคลื่อนที่ส่วนผสมของทั้งสองตัวทำละลาย: (1 × 10-3 MK - PO4 ค่า pH 3.1) และ B (เมธานอล) elution ก็ประสบความสำเร็จที่ 30 ° C ที่มีความลาดชัน 3-7% B ใน 2 นาที (1.0 มล. / นาที), B 7-9% ในเวลา 10 นาที (1.0-2.0 มล. / นาที) และ 9-19% B ใน 7 นาที (2.0 มล. / นาที) สารประกอบที่ถูกตรวจสอบได้ที่: 230 นาโนเมตรสำหรับ GV, วานิลและแอลกอฮอล์ 2, 4 และ 7; 254 นาโนเมตรสำหรับ vanillic กรดและกรด 4 hydroxybenzoic; และ 280 นาโนเมตรสำหรับ 4 hydroxybenzaldehyde ปริมาณการฉีด 10 ไมโครลิตรและตัวอย่างทั้งหมดถูกกรองผ่าน PTFE - 0.45 ไมโครเมตรเข็มฉีดยากรอง (ค, เยอรมนี) ก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ LC-ESI-MS ทดลองดำเนินการใน Bruker Daltonics อัศวิน 6000 ควบคุมโดยเข็มทิศ 1.3 สำหรับอัศวิน / ซอฟแวร์ HCT (Bruker Daltonik GmbH) ระบบ HPLC ได้รับตามที่อธิบายไว้สำหรับ HPLC-DAD แยกลาดได้ดำเนินการที่ 35 องศาเซลเซียสโดยใช้เฟสเคลื่อนที่ระเหยประกอบด้วยตัวทำละลาย (4.2 × 10-3 M กรดฟอร์มิคค่า pH 3.1) และ B (เมธานอล) ดังต่อไปนี้การไล่ระดับสีเดียวกับข้างต้น แต่ในอัตราการไหลของ 1 มล. / นาที หลังจากที่ไปถึง 19% B จะจัดขึ้น isocratic 16 นาที ปริมาณการฉีด 7 ไมโครลิตร สภาพการใช้งาน ESI-MS คือโหมด Ionisation บวกก๊าซแห้ง (N2) การไหล 12 ลิตร / นาที; ความดัน nebulizer 65 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว; ก๊าซอุณหภูมิ 350 ° C; แรงดันของเส้นเลือดฝอย 4000 V; โหมดการสแกนเมตร / z, 90-800 ESI-MS และสเปกตรัม UV-DAD มาตรฐานแท้ 1-7 และ GV ถูกบันทึกไว้และใช้ในการยืนยันตัวตน การทำให้บริสุทธิ์ semipreparative HPLC ได้ดำเนินการกับ Cromolith RP - 18e (100 × 10 มมเมอร์ - ดาร์มสตัด) โดยใช้เงื่อนไขที่จัดตั้งขึ้นเพื่อ LC-ESI-MS ทำงาน แต่มีอัตราการไหล 2.5 มล. / นาที สารสกัดแห้ง (75 มก.) ละลายใน 1.5 มิลลิลิตรของเอทานอล 30% น้ำถูกฉีดผ่าน 2 มิลลิลิตรห่วง คอลเลกชันส่วนถูกแนะนำโดยการเก็บรักษาเวลาและสเปกตรัมของรังสียูวี eluate. 2.5 วิธีการตรวจสอบวิธี HPLC ได้รับการตรวจสอบตามความต้องการของไอซี (ไอซี, 1996) เส้นโค้งการสอบเทียบภายนอกได้จัดทำด้วยโซลูชั่นที่มีสารประกอบที่ 1-7 ในความเข้มข้นระหว่าง 0.167 และ 992.8 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร ในกรณีของ GV ช่วงเป็น 0.864-1035 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร เส้นตรงที่ได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์การถดถอยอย่างน้อยหกความเข้มข้นของแต่ละสารประกอบ การทำซ้ำได้รับการยืนยันโดยการดำเนินการฉีดในวันเดียวกัน (ความแม่นยำภายในวัน, n = 5) ที่ความเข้มข้นที่กำหนดของแต่ละสารประกอบ ความแม่นยำกลางที่คำนวณได้กว่าห้าวันที่แตกต่างกัน (ระหว่างวัน) ที่จัดตั้งขึ้นต่อความเข้มข้นของสาร การแก้ปัญหาการเจือจางสูงของแต่ละสารประกอบถูกนำมาใช้เพื่อให้บรรลุสัญญาณต่อเสียงรบกวน (S / N) อัตราส่วน 3 (ขีด จำกัด ของการตรวจสอบล็อด) และ 10 (ขีด จำกัด ของปริมาณ, LOQ) การฟื้นตัวของการวิเคราะห์โปรโตคอลที่สมบูรณ์ได้รับการประเมินโดยการเพิ่มคุณค่าของตัวอย่างวานิลลา (2 กรัม) 50 มิลลิกรัมของสาร 1, 4 และ 7 และ 10 มิลลิกรัมของ 2, 3, 5, และ 6 ได้รับการกู้คืนแสดงเป็น ร้อยละของจำนวนเงินทั้งหมดหาย เป็นกระบวนการที่ทำซ้ำในเพิ่มขึ้นสามเท่า ผลไม้ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีเก้าเดือนเก่า. 2.6 การวิเคราะห์ทางสถิติการวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูลที่ถูกดำเนินการโดยใช้ IBM SPSS สถิติเวอร์ชั่น 19.0 (SPSS, Inc Chicago, IL) และการวิเคราะห์หลายตัวแปรที่ถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์เวอร์ชั่น 7.11 MATLAB (Matworks, Inc เนติ, MA) การวิเคราะห์ PCA ได้ดำเนินการใช้ตัวแปรมาตรฐาน. 3 และการอภิปรายผล3.1 ความชื้นความชื้นเฉลี่ยของโวลต์เหมือนเดิม pompona เอสเอส ผลไม้ grandiflora สามและครึ่งหนึ่งถึงเก้าเดือนเก่าจะถูกนำเสนอในตารางที่ 1 เพิ่มขึ้นสังเกตของน้ำหนักแห้งผ่านการสุกของผลไม้ที่ได้รับการตั้งข้อสังเกตก่อนหน้านี้กับโวลต์ผลไม้ planifolia (Brodelius, 1994) ขนาดของผลไม้ 24 ใช้ในการคำนวณที่มีความชื้นอยู่ในช่วง 10-25 เซนติเมตรยาว 2-4 เซนติเมตรและความกว้าง
ดอกไม้ของวีเอสเอส pompona grandiflora (Lindl.) Soto-Arenas ถูกมือเรณูในเดือนตุลาคม 2008 ในระบบนิเวศพื้นที่ชุ่มน้ำที่เลือกของ Madre de Dios, เปรู สำหรับรายละเอียดของวิธีการวิจัยภาคสนามและที่อยู่อาศัยให้ดูเจ้าของบ้าน et al, (2010) ผลไม้ที่เก็บเกี่ยวในช่วงเดือนสามและครึ่งหนึ่งถึงเก้าหลังจากการผสมเกสร ตัวอย่างบัตรกำนัลสมุนไพร (MC366, MC684, MC599, MC660, MC296, PM865 และ JJ2671) ถูกเก็บไว้ในชุดที่ซ้ำกันและนำไปฝากไว้ที่หอพรรณไม้ซานมาร์คอสในกรุงลิมาเปรูและที่บริตสมุนไพรในฟอร์ตเวิร์ ธ เท็กซัส ชิ้นงานที่ถูกระบุโดยสายผู้เชี่ยวชาญด้านกล้วยไม้ neotropical EA Christenson และมิเกล Soto-Arenas (เจ้าของบ้าน et al., 2010) รายละเอียดของคอลเลกชันเหล่านี้จะถูกโพสต์ในเอเทรียมความหลากหลายทางชีวภาพระบบสารสนเทศโปรแกรมและการบริหารจัดการที่บริต (http://atrium.andesamazon.org). สารมาตรฐาน vanillin, vanillyl แอลกอฮอล์กรด vanillic แอลกอฮอล์ 4 hydroxybenzyl 4 hydroxybenzaldehyde, กรด 4 hydroxybenzoic และเครื่องดื่มแอลกอฮอล์ anisyl เช่นเดียวกับ Viscozyme (V2010 มาก # 085K1587) และ Celluclast (C2730 มาก # 074K1156) ถูกซื้อมาจาก Sigma-Aldrich Glucovanillin ที่ได้รับจาก ChromaDex เมทานอล (HPLC เกรด) และเอทานอล (99.9%) ได้รับซื้อมาจากเจเบเกอร์ จำกัด น้ำที่ใช้เป็นพัน-Q บริสุทธิ์ การศึกษาได้ดำเนินการกับบุคคลที่สามผลไม้ต่อเดือนยกเว้นเดือนเก้าที่หกผลไม้ได้รับการพิจารณา. 2.2 ความมุ่งมั่นความชื้นเมื่อมาถึงยังห้องปฏิบัติการไม่เกินสองวันหลังจากการเก็บเกี่ยวผลไม้ที่ถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและทันทีที่แห้ง (LABCONCO ระบบแห้งแช่แข็ง / Freezone 4.5) สำหรับ 3-5 วัน ความชื้นจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ [(wwet - wdry / wwet) × 100]. 2.3 ตัวอย่างวานิลลาเตรียมผลไม้แห้งส่วนบุคคลมาบดให้เป็นผงละเอียดโดยใช้เครื่องบดไฟฟ้า (Sigma-Aldrich รุ่น Z278181) สองกรัมของวัสดุพื้นดินที่ถูกวิธีการสกัดแบบ-สกัดด้วยน้ำ 48% EtOH (200 มล.) เป็นเวลา 24 ชั่วโมง (Voisine, คาร์ไมเคิ Chalier ไมเออร์และโม, 1992) เอทานอลจะถูกลบออกโดยการระเหยสูญญากาศ (150 mBar 40 ° C) และน้ำ, การแก้ปัญหาขุ่นถูกนำตัวไป 50 มล. ในขวดปริมาตร การย่อยสลายของ glucosides ก็ประสบความสำเร็จจากการบ่ม 10 มล. ของสารสกัดจาก 150 ไมโครลิตรของ Viscozyme และ 300 ไมโครลิตรของ Celluclast ที่ 45 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 8 ชั่วโมง (Inkubator 1000 / Unimax 1010 Heildolph Instr.) เอทานอล (4.5 ml) ถูกบันทึกและประมวลผลอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 1 ชั่วโมงเพื่อให้ส่วนไฮโดรไลซ์ ส่วนที่ไม่ใช่ไฮโดรไลซ์ตามขั้นตอนเดียวกันยกเว้นสำหรับการเพิ่มเอนไซม์ ปริมาณของกลุ่มตัวอย่างทั้งสองมีการปรับถึง 15 มล. ก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ HPLC ทดลองดำเนินการในที่ซ้ำกัน วานิลลาก็ผ่านไปผ่าน 25 มม PTFE กรอง 0.45 ไมครอนเข็มก่อนที่จะมีการฉีด (10 ไมโครลิตร) ลงในระบบ HPLC สารสกัดแต่ละคนได้รับการประเมินในเพิ่มขึ้นสามเท่า. 2.4 การวิเคราะห์ HPLC ตัวอย่างวิเคราะห์ใน Agilent 1200 ซีรีส์ - DAD พร้อมกับหน่วยปั๊มไบนารี (G1312A) เครื่องตรวจจับรังสี UV-VIS (G1315D) degasser (G13798) เตาอบคอลัมน์ (G1316A) หัวฉีดคู่มือห่วงไมโครลิตร 20 (G1328B ) ควบคุมโดยซอฟต์แวร์ LC3D ChemStation (Agilent Technologies, Inc) คอลัมน์ที่ใช้เป็น Cromolith RP - 18e (100 × 4.6 มมเมอร์ค-Darmstadt) และเฟสเคลื่อนที่ส่วนผสมของทั้งสองตัวทำละลาย: (1 × 10-3 MK - PO4 ค่า pH 3.1) และ B (เมธานอล) elution ก็ประสบความสำเร็จที่ 30 ° C ที่มีความลาดชัน 3-7% B ใน 2 นาที (1.0 มล. / นาที), B 7-9% ในเวลา 10 นาที (1.0-2.0 มล. / นาที) และ 9-19% B ใน 7 นาที (2.0 มล. / นาที) สารประกอบที่ถูกตรวจสอบได้ที่: 230 นาโนเมตรสำหรับ GV, วานิลและแอลกอฮอล์ 2, 4 และ 7; 254 นาโนเมตรสำหรับ vanillic กรดและกรด 4 hydroxybenzoic; และ 280 นาโนเมตรสำหรับ 4 hydroxybenzaldehyde ปริมาณการฉีด 10 ไมโครลิตรและตัวอย่างทั้งหมดถูกกรองผ่าน PTFE - 0.45 ไมโครเมตรเข็มฉีดยากรอง (ค, เยอรมนี) ก่อนที่จะมีการวิเคราะห์ LC-ESI-MS ทดลองดำเนินการใน Bruker Daltonics อัศวิน 6000 ควบคุมโดยเข็มทิศ 1.3 สำหรับอัศวิน / ซอฟแวร์ HCT (Bruker Daltonik GmbH) ระบบ HPLC ได้รับตามที่อธิบายไว้สำหรับ HPLC-DAD แยกลาดได้ดำเนินการที่ 35 องศาเซลเซียสโดยใช้เฟสเคลื่อนที่ระเหยประกอบด้วยตัวทำละลาย (4.2 × 10-3 M กรดฟอร์มิคค่า pH 3.1) และ B (เมธานอล) ดังต่อไปนี้การไล่ระดับสีเดียวกับข้างต้น แต่ในอัตราการไหลของ 1 มล. / นาที หลังจากที่ไปถึง 19% B จะจัดขึ้น isocratic 16 นาที ปริมาณการฉีด 7 ไมโครลิตร สภาพการใช้งาน ESI-MS คือโหมด Ionisation บวกก๊าซแห้ง (N2) การไหล 12 ลิตร / นาที; ความดัน nebulizer 65 ปอนด์ต่อตารางนิ้ว; ก๊าซอุณหภูมิ 350 ° C; แรงดันของเส้นเลือดฝอย 4000 V; โหมดการสแกนเมตร / z, 90-800 ESI-MS และสเปกตรัม UV-DAD มาตรฐานแท้ 1-7 และ GV ถูกบันทึกไว้และใช้ในการยืนยันตัวตน การทำให้บริสุทธิ์ semipreparative HPLC ได้ดำเนินการกับ Cromolith RP - 18e (100 × 10 มมเมอร์ - ดาร์มสตัด) โดยใช้เงื่อนไขที่จัดตั้งขึ้นเพื่อ LC-ESI-MS ทำงาน แต่มีอัตราการไหล 2.5 มล. / นาที สารสกัดแห้ง (75 มก.) ละลายใน 1.5 มิลลิลิตรของเอทานอล 30% น้ำถูกฉีดผ่าน 2 มิลลิลิตรห่วง คอลเลกชันส่วนถูกแนะนำโดยการเก็บรักษาเวลาและสเปกตรัมของรังสียูวี eluate. 2.5 วิธีการตรวจสอบวิธี HPLC ได้รับการตรวจสอบตามความต้องการของไอซี (ไอซี, 1996) เส้นโค้งการสอบเทียบภายนอกได้จัดทำด้วยโซลูชั่นที่มีสารประกอบที่ 1-7 ในความเข้มข้นระหว่าง 0.167 และ 992.8 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร ในกรณีของ GV ช่วงเป็น 0.864-1035 ไมโครกรัม / มิลลิลิตร เส้นตรงที่ได้รับการตรวจสอบโดยการวิเคราะห์การถดถอยอย่างน้อยหกความเข้มข้นของแต่ละสารประกอบ การทำซ้ำได้รับการยืนยันโดยการดำเนินการฉีดในวันเดียวกัน (ความแม่นยำภายในวัน, n = 5) ที่ความเข้มข้นที่กำหนดของแต่ละสารประกอบ ความแม่นยำกลางที่คำนวณได้กว่าห้าวันที่แตกต่างกัน (ระหว่างวัน) ที่จัดตั้งขึ้นต่อความเข้มข้นของสาร การแก้ปัญหาการเจือจางสูงของแต่ละสารประกอบถูกนำมาใช้เพื่อให้บรรลุสัญญาณต่อเสียงรบกวน (S / N) อัตราส่วน 3 (ขีด จำกัด ของการตรวจสอบล็อด) และ 10 (ขีด จำกัด ของปริมาณ, LOQ) การฟื้นตัวของการวิเคราะห์โปรโตคอลที่สมบูรณ์ได้รับการประเมินโดยการเพิ่มคุณค่าของตัวอย่างวานิลลา (2 กรัม) 50 มิลลิกรัมของสาร 1, 4 และ 7 และ 10 มิลลิกรัมของ 2, 3, 5, และ 6 ได้รับการกู้คืนแสดงเป็น ร้อยละของจำนวนเงินทั้งหมดหาย เป็นกระบวนการที่ทำซ้ำในเพิ่มขึ้นสามเท่า ผลไม้ที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีเก้าเดือนเก่า. 2.6 การวิเคราะห์ทางสถิติการวิเคราะห์ทางสถิติของข้อมูลที่ถูกดำเนินการโดยใช้ IBM SPSS สถิติเวอร์ชั่น 19.0 (SPSS, Inc Chicago, IL) และการวิเคราะห์หลายตัวแปรที่ถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์เวอร์ชั่น 7.11 MATLAB (Matworks, Inc เนติ, MA) การวิเคราะห์ PCA ได้ดำเนินการใช้ตัวแปรมาตรฐาน. 3 และการอภิปรายผล3.1 ความชื้นความชื้นเฉลี่ยของโวลต์เหมือนเดิม pompona เอสเอส ผลไม้ grandiflora สามและครึ่งหนึ่งถึงเก้าเดือนเก่าจะถูกนำเสนอในตารางที่ 1 เพิ่มขึ้นสังเกตของน้ำหนักแห้งผ่านการสุกของผลไม้ที่ได้รับการตั้งข้อสังเกตก่อนหน้านี้กับโวลต์ผลไม้ planifolia (Brodelius, 1994) ขนาดของผลไม้ 24 ใช้ในการคำนวณที่มีความชื้นอยู่ในช่วง 10-25 เซนติเมตรยาว 2-4 เซนติเมตรและความกว้าง
การแปล กรุณารอสักครู่..
2.1 . วัสดุพืชและสารเคมี
ดอกไม้ V . pompona ssp . grandiflora ( + + เอื้องสีตาล ) โซโตโดยสิ้นเชิงเป็นมือผสมในเดือนตุลาคม 2008 ที่คัดเลือกพื้นที่ชุ่มน้ำระบบนิเวศของ Madre de Dios เปรู สำหรับรายละเอียดของวิธีวิจัยภาคสนามและที่อยู่อาศัย เห็นเจ้าของบ้าน et al . ( 2010 ) ผลเก็บเกี่ยวในช่วงเดือนสามและครึ่งเก้า หลังการผสมเกสร สมุนไพรใบตัวอย่าง ( mc366 mc684 , ,mc599 mc660 mc296 , , , และ pm865 jj2671 ) ถูกเก็บในชุดซ้ำและฝากใน ซานมาร์คอสอย่างในลิมา , เปรู และ ที่ บริทสมุนไพรในฟอร์ตเวิร์ท , เท็กซัส ตัวอย่างที่ถูกระบุโดยผู้เชี่ยวชาญสาย Neotropical กล้วยไม้ EA คริสตีสัน และมิเกล โซโตโดยสิ้นเชิง ( คฤหัสถ์ et al . , 2010 ) รายละเอียดของคอลเลกชันเหล่านี้จะโพสต์ในห้องโถง ความหลากหลายทางชีวภาพ ข้อมูลระบบโปรแกรมการจัดการที่อังกฤษ ( http : / / ลาน andesamazon . org ) .
สารมาตรฐาน vanillyl VANILLIN , แอลกอฮอล์ , vanillic acid , 4-hydroxybenzyl แอลกอฮอล์ 4-hydroxybenzaldehyde 4-hydroxybenzoic anisyl , กรด และแอลกอฮอล์ รวมทั้ง viscozyme ( v2010 มาก# 085k1587 ) และ celluclast ( c2730 มาก# 074k1156 ) , ซื้อจากซิกม่า – อัลดริช glucovanillin ได้จาก chromadex .เมทานอล ( ป. 2 ) และเอทานอล ( 99.9% ) ซื้อมาจาก J.T . เบเกอร์ จำกัด น้ำที่ใช้ milli-q-purified . การศึกษาจำนวน 3 รายผลต่อเดือนยกเว้นเดือนเก้าในที่ 6 ผล พิจารณา
2.2 . ความชื้น ปริมาณ
เมื่อมาถึงห้องปฏิบัติการ ไม่เกิน 2 วัน หลังจากเก็บเกี่ยวผลไม้ที่ถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและแห้งทันที ( แล็บคอนโก้ , แช่แข็งแห้ง / freezone 4.5 ) 3 – 5 วัน ความชื้นจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ [ ( wwet − wdry / wwet ) × 100 ] .
2.3 การเตรียมตัวอย่างโปรตีนวานิลลา
แต่ละผลไม้พื้นเพื่อผงละเอียดโดยใช้เครื่องบดไฟฟ้า ( Sigma ) ดิช รุ่น z278181 )สองกรัมของวัสดุพื้นดินถูกสกัดด้วยสารละลายแอลกอฮอล์ไขมันร้อยละ 48 ( 200 ml ) ตลอด 24 ชั่วโมง ( voisine ไมเคิลคอร์ chalier , , , , &โมริน , 1992 ) เอทานอลจะถูกลบออกโดยการระเหยสูญญากาศ ( 150 มิลลิบาร์ , 40 ° C ) และสารละลายขุ่น , โซลูชั่นถ่าย 50 ml ในขวดปริมาตร .การย่อยสลายของกลูโคไซด์ทำโดยการแช่ 10 มิลลิลิตรของสารสกัดด้วย 150 และ 300 μ viscozyme μ l l celluclast 45 ° C 8 H ( inkubator 1000 / Unimax 1010 , heildolph INSTR . ) เอทานอล ( 4.5 ml ) คือการเพิ่มและกระบวนการอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เพื่อให้ผลผลิตไฮโดรไลซ์ เศษส่วน ส่วนที่ไม่ย่อยตามขั้นตอนเดียวกันยกเว้นเอนไซม์นอกจากนี้ปริมาณของทั้งสองตัวอย่างปรับ 15 ml ก่อนการวิเคราะห์ปริมาณซูโครส ผลการทดลองในที่ซ้ำกัน วานิลลาได้ผ่าน 25 มม. PTFE 0.45 μ M เข็มกรองก่อนฉีด ( 10 μ L ) เข้าไปในระบบ 2 . แต่ละสารสกัดจากการประเมินทั้งสามใบ
2.4 .
การวิเคราะห์ HPLCโดยวิเคราะห์ในด้าน 1200 ชุด–พ่อพร้อมกับหน่วยปั๊มไบนารี ( g1312a ) , UV ) ซึ่งตรวจจับ ( g1315d ) degasser ( g13798 ) , เตาอบคอลัมน์ ( g1316a ) 20 คู่มือหัวฉีด ห่วงฉันμ ( g1328b ) ควบคุมโดย chemstation ซอฟต์แวร์ lc3d ( Agilent Technologies , Inc ) คอลัมน์ที่ใช้เป็น cromolith RP – 18e ( 100 × 4.6 มิลลิเมตร เมอร์ค ดาร์มชตัท )และเฟสเคลื่อนที่เป็นส่วนผสมของตัวทำละลาย 2 : ( 1 × 10 − 3 M K - po4 พีเอช 3.1 ) และ B ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) ( เท่ากับร้อยละ 30 ° C มีความลาดชัน 3 – 7 % B ใน 2 นาที ( 1.0 มล. / นาที ) , 7 - 9 % B ใน 10 นาที ( 1.0 - 2.0 มิลลิลิตรต่อนาที ) และ 9 – 19 % B ใน 7 นาที ( 2.0 มิลลิลิตรต่อนาที ) สารประกอบที่ถูกตรวจสอบใน : 230 nm สำหรับ GV VANILLIN , แอลกอฮอล์ , และ 2 , 4 , และ 7 ; 254 nm สำหรับกรดและกรด vanillic 4-hydroxybenzoic ;และ 280 nm สำหรับ 4-hydroxybenzaldehyde . ปริมาณการฉีดได้ 10 μ L และตัวอย่างทั้งหมดจะถูกกรองผ่าน PTFE ( 0.45 μ M เข็มตัวกรอง ( มิลลิ , เยอรมนี ) ก่อนการวิเคราะห์ LC – esi-ms ทดลองในบรูกเกอร์ ดอลโทนิกขาย 6000 ควบคุมโดยเข็มทิศ 1.3 สำหรับ Esquire / Hct ซอฟต์แวร์ ( BRUKER daltonik GmbH ) ระบบ HPLC เป็นตามที่อธิบายไว้ใน hplc-dad .การไล่ระดับสีแยกกระทำที่ 35 ° C โดยใช้เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยตัวทำละลายที่ระเหยได้ ( 4.2 × 10 − 3 M กรดพีเอช 3.1 ) และ B ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) ตามไล่ระดับเดียวกับข้างต้น แต่ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาที หลังจากถึง 19 % B มันถูกจัดขึ้น Isocratic สำหรับ 16 นาที ฉีดปริมาณ 7 μล. esi-ms เงื่อนไข ได้แก่ โหมด ionisation บวกก๊าซแห้ง ( 2 ) ไหล12 ลิตร / นาที แรงดัน ; nebulizer 65 PSI ; การอบแห้งอุณหภูมิแก๊ส 350 องศา C ; C , โหมดการสแกนแรงดันไฟฟ้า V ; m / z , 90 – 800 . esi-ms uv-dad spectra และมาตรฐานจริง 1 – 7 GV , บันทึก และใช้ในการยืนยันตัวตน การทำให้บริสุทธิ์และ semipreparative ดำเนินการกับ cromolith RP – 18e ( 100 × 10 มม.เมอร์ค– Darmstadt ) โดยใช้เงื่อนไขการก่อตั้งและ esi-ms LC ไปแล้ว แต่ด้วยอัตราการไหล 2 มล. / นาที ( 75 มก. ) สารสกัดจากโปรตีนที่ละลายในสารละลายเอทานอล 1.5 ml 30% ถูกฉีดผ่านลูป 2 ml . ส่วนคอลเลกชันนำในและ UV แสงของสารละลาย ( eluate ) .
2.5 วิธีการตรวจสอบ
HPLC วิธีการตรวจสอบตามความต้องการ ( Goal Goal ,1996 ) เส้นโค้งสอบเทียบภายนอกพร้อมด้วยโซลูชั่นที่มีสารประกอบ 1 – 7 ในความเข้มข้นระหว่าง 0.167 และ 992.8 μกรัม / มล. ในกรณีของ GV ช่วงคือ 0.864 – 1035 μกรัม / มิลลิลิตร ถึงถูกตรวจสอบโดยการวิเคราะห์การถดถอยอย่างน้อยหกความเข้มข้นของแต่ละสาร การได้รับการยืนยันโดยการฉีดในวันเดียวกัน ( ภายในวันแน่นอนn = 5 ) ที่ให้ความเข้มข้นของแต่ละสาร ความแม่นยำระดับกลางคำนวณได้มากกว่า 5 วัน แตกต่างกัน ( ระหว่างวัน ) ที่สร้างสมาธิต่อสาร สูงโซลูชั่นของแต่ละสารเจือจางที่ใช้เพื่อให้บรรลุสัญญาณ ( S / N ) เท่ากับ 3 ขีด จำกัด ของการตรวจสอบ , LOD ) และ 10 ( จำกัดปริมาณ loq , )การกู้คืนที่สมบูรณ์ของโปรโตคอลวิเคราะห์ ประเมินโดยการใช้กลิ่นวานิลลา ( 2 กรัม ) กับ 50 mg สารประกอบ 1 , 4 , 7 และ 10 มิลลิกรัมของ 2 , 3 , 5 , และ 6 การกู้คืนจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของยอดเงินกู้ กระบวนการทำซ้ำทั้งสามใบ ผลไม้ที่ใช้ในการศึกษา คือ อายุ 9 เดือน
2.6
สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลสถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล คือ สถิติการใช้ IBM รุ่น 19.0 ( SPSS , อิลลินอยส์ Inc ชิคาโก ) และการวิเคราะห์หลายตัวแปรการใช้ MATLAB ซอฟแวร์รุ่น 7.11 ( matworks , อิงค์ , บริสุทธิ์ใจ , MA ) การวิเคราะห์ระบบมีการใช้ตัวแปรมาตรฐาน
3 ผลและการอภิปราย
3.1 . ความชื้นความชื้นสัมพัทธ์เฉลี่ยของเหมือนเดิม
V pompona ssp . grandiflora ผลไม้ ,สามและครึ่งถึงเก้าเดือน ที่แสดงในตารางที่ 1 วิธีเพิ่มน้ำหนักด้วยการผลไม้ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ด้วยโวลต์ Planifolia ผลไม้ ( brodelius , 1994 ) ขนาดของ 24 ผลไม้ใช้คำนวณความชื้นอยู่ระหว่าง 10 ถึง 25 ซม. ยาว 2 - 4 ซม. ความกว้าง
ดอกไม้ V . pompona ssp . grandiflora ( + + เอื้องสีตาล ) โซโตโดยสิ้นเชิงเป็นมือผสมในเดือนตุลาคม 2008 ที่คัดเลือกพื้นที่ชุ่มน้ำระบบนิเวศของ Madre de Dios เปรู สำหรับรายละเอียดของวิธีวิจัยภาคสนามและที่อยู่อาศัย เห็นเจ้าของบ้าน et al . ( 2010 ) ผลเก็บเกี่ยวในช่วงเดือนสามและครึ่งเก้า หลังการผสมเกสร สมุนไพรใบตัวอย่าง ( mc366 mc684 , ,mc599 mc660 mc296 , , , และ pm865 jj2671 ) ถูกเก็บในชุดซ้ำและฝากใน ซานมาร์คอสอย่างในลิมา , เปรู และ ที่ บริทสมุนไพรในฟอร์ตเวิร์ท , เท็กซัส ตัวอย่างที่ถูกระบุโดยผู้เชี่ยวชาญสาย Neotropical กล้วยไม้ EA คริสตีสัน และมิเกล โซโตโดยสิ้นเชิง ( คฤหัสถ์ et al . , 2010 ) รายละเอียดของคอลเลกชันเหล่านี้จะโพสต์ในห้องโถง ความหลากหลายทางชีวภาพ ข้อมูลระบบโปรแกรมการจัดการที่อังกฤษ ( http : / / ลาน andesamazon . org ) .
สารมาตรฐาน vanillyl VANILLIN , แอลกอฮอล์ , vanillic acid , 4-hydroxybenzyl แอลกอฮอล์ 4-hydroxybenzaldehyde 4-hydroxybenzoic anisyl , กรด และแอลกอฮอล์ รวมทั้ง viscozyme ( v2010 มาก# 085k1587 ) และ celluclast ( c2730 มาก# 074k1156 ) , ซื้อจากซิกม่า – อัลดริช glucovanillin ได้จาก chromadex .เมทานอล ( ป. 2 ) และเอทานอล ( 99.9% ) ซื้อมาจาก J.T . เบเกอร์ จำกัด น้ำที่ใช้ milli-q-purified . การศึกษาจำนวน 3 รายผลต่อเดือนยกเว้นเดือนเก้าในที่ 6 ผล พิจารณา
2.2 . ความชื้น ปริมาณ
เมื่อมาถึงห้องปฏิบัติการ ไม่เกิน 2 วัน หลังจากเก็บเกี่ยวผลไม้ที่ถูกแช่แข็งในไนโตรเจนเหลวและแห้งทันที ( แล็บคอนโก้ , แช่แข็งแห้ง / freezone 4.5 ) 3 – 5 วัน ความชื้นจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ [ ( wwet − wdry / wwet ) × 100 ] .
2.3 การเตรียมตัวอย่างโปรตีนวานิลลา
แต่ละผลไม้พื้นเพื่อผงละเอียดโดยใช้เครื่องบดไฟฟ้า ( Sigma ) ดิช รุ่น z278181 )สองกรัมของวัสดุพื้นดินถูกสกัดด้วยสารละลายแอลกอฮอล์ไขมันร้อยละ 48 ( 200 ml ) ตลอด 24 ชั่วโมง ( voisine ไมเคิลคอร์ chalier , , , , &โมริน , 1992 ) เอทานอลจะถูกลบออกโดยการระเหยสูญญากาศ ( 150 มิลลิบาร์ , 40 ° C ) และสารละลายขุ่น , โซลูชั่นถ่าย 50 ml ในขวดปริมาตร .การย่อยสลายของกลูโคไซด์ทำโดยการแช่ 10 มิลลิลิตรของสารสกัดด้วย 150 และ 300 μ viscozyme μ l l celluclast 45 ° C 8 H ( inkubator 1000 / Unimax 1010 , heildolph INSTR . ) เอทานอล ( 4.5 ml ) คือการเพิ่มและกระบวนการอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 1 ชั่วโมง เพื่อให้ผลผลิตไฮโดรไลซ์ เศษส่วน ส่วนที่ไม่ย่อยตามขั้นตอนเดียวกันยกเว้นเอนไซม์นอกจากนี้ปริมาณของทั้งสองตัวอย่างปรับ 15 ml ก่อนการวิเคราะห์ปริมาณซูโครส ผลการทดลองในที่ซ้ำกัน วานิลลาได้ผ่าน 25 มม. PTFE 0.45 μ M เข็มกรองก่อนฉีด ( 10 μ L ) เข้าไปในระบบ 2 . แต่ละสารสกัดจากการประเมินทั้งสามใบ
2.4 .
การวิเคราะห์ HPLCโดยวิเคราะห์ในด้าน 1200 ชุด–พ่อพร้อมกับหน่วยปั๊มไบนารี ( g1312a ) , UV ) ซึ่งตรวจจับ ( g1315d ) degasser ( g13798 ) , เตาอบคอลัมน์ ( g1316a ) 20 คู่มือหัวฉีด ห่วงฉันμ ( g1328b ) ควบคุมโดย chemstation ซอฟต์แวร์ lc3d ( Agilent Technologies , Inc ) คอลัมน์ที่ใช้เป็น cromolith RP – 18e ( 100 × 4.6 มิลลิเมตร เมอร์ค ดาร์มชตัท )และเฟสเคลื่อนที่เป็นส่วนผสมของตัวทำละลาย 2 : ( 1 × 10 − 3 M K - po4 พีเอช 3.1 ) และ B ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) ( เท่ากับร้อยละ 30 ° C มีความลาดชัน 3 – 7 % B ใน 2 นาที ( 1.0 มล. / นาที ) , 7 - 9 % B ใน 10 นาที ( 1.0 - 2.0 มิลลิลิตรต่อนาที ) และ 9 – 19 % B ใน 7 นาที ( 2.0 มิลลิลิตรต่อนาที ) สารประกอบที่ถูกตรวจสอบใน : 230 nm สำหรับ GV VANILLIN , แอลกอฮอล์ , และ 2 , 4 , และ 7 ; 254 nm สำหรับกรดและกรด vanillic 4-hydroxybenzoic ;และ 280 nm สำหรับ 4-hydroxybenzaldehyde . ปริมาณการฉีดได้ 10 μ L และตัวอย่างทั้งหมดจะถูกกรองผ่าน PTFE ( 0.45 μ M เข็มตัวกรอง ( มิลลิ , เยอรมนี ) ก่อนการวิเคราะห์ LC – esi-ms ทดลองในบรูกเกอร์ ดอลโทนิกขาย 6000 ควบคุมโดยเข็มทิศ 1.3 สำหรับ Esquire / Hct ซอฟต์แวร์ ( BRUKER daltonik GmbH ) ระบบ HPLC เป็นตามที่อธิบายไว้ใน hplc-dad .การไล่ระดับสีแยกกระทำที่ 35 ° C โดยใช้เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยตัวทำละลายที่ระเหยได้ ( 4.2 × 10 − 3 M กรดพีเอช 3.1 ) และ B ( เมทิลแอลกอฮอล์ ) ตามไล่ระดับเดียวกับข้างต้น แต่ที่อัตราการไหล 1 มิลลิลิตร / นาที หลังจากถึง 19 % B มันถูกจัดขึ้น Isocratic สำหรับ 16 นาที ฉีดปริมาณ 7 μล. esi-ms เงื่อนไข ได้แก่ โหมด ionisation บวกก๊าซแห้ง ( 2 ) ไหล12 ลิตร / นาที แรงดัน ; nebulizer 65 PSI ; การอบแห้งอุณหภูมิแก๊ส 350 องศา C ; C , โหมดการสแกนแรงดันไฟฟ้า V ; m / z , 90 – 800 . esi-ms uv-dad spectra และมาตรฐานจริง 1 – 7 GV , บันทึก และใช้ในการยืนยันตัวตน การทำให้บริสุทธิ์และ semipreparative ดำเนินการกับ cromolith RP – 18e ( 100 × 10 มม.เมอร์ค– Darmstadt ) โดยใช้เงื่อนไขการก่อตั้งและ esi-ms LC ไปแล้ว แต่ด้วยอัตราการไหล 2 มล. / นาที ( 75 มก. ) สารสกัดจากโปรตีนที่ละลายในสารละลายเอทานอล 1.5 ml 30% ถูกฉีดผ่านลูป 2 ml . ส่วนคอลเลกชันนำในและ UV แสงของสารละลาย ( eluate ) .
2.5 วิธีการตรวจสอบ
HPLC วิธีการตรวจสอบตามความต้องการ ( Goal Goal ,1996 ) เส้นโค้งสอบเทียบภายนอกพร้อมด้วยโซลูชั่นที่มีสารประกอบ 1 – 7 ในความเข้มข้นระหว่าง 0.167 และ 992.8 μกรัม / มล. ในกรณีของ GV ช่วงคือ 0.864 – 1035 μกรัม / มิลลิลิตร ถึงถูกตรวจสอบโดยการวิเคราะห์การถดถอยอย่างน้อยหกความเข้มข้นของแต่ละสาร การได้รับการยืนยันโดยการฉีดในวันเดียวกัน ( ภายในวันแน่นอนn = 5 ) ที่ให้ความเข้มข้นของแต่ละสาร ความแม่นยำระดับกลางคำนวณได้มากกว่า 5 วัน แตกต่างกัน ( ระหว่างวัน ) ที่สร้างสมาธิต่อสาร สูงโซลูชั่นของแต่ละสารเจือจางที่ใช้เพื่อให้บรรลุสัญญาณ ( S / N ) เท่ากับ 3 ขีด จำกัด ของการตรวจสอบ , LOD ) และ 10 ( จำกัดปริมาณ loq , )การกู้คืนที่สมบูรณ์ของโปรโตคอลวิเคราะห์ ประเมินโดยการใช้กลิ่นวานิลลา ( 2 กรัม ) กับ 50 mg สารประกอบ 1 , 4 , 7 และ 10 มิลลิกรัมของ 2 , 3 , 5 , และ 6 การกู้คืนจะแสดงเป็นเปอร์เซ็นต์ของยอดเงินกู้ กระบวนการทำซ้ำทั้งสามใบ ผลไม้ที่ใช้ในการศึกษา คือ อายุ 9 เดือน
2.6
สถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลสถิติที่ใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูล คือ สถิติการใช้ IBM รุ่น 19.0 ( SPSS , อิลลินอยส์ Inc ชิคาโก ) และการวิเคราะห์หลายตัวแปรการใช้ MATLAB ซอฟแวร์รุ่น 7.11 ( matworks , อิงค์ , บริสุทธิ์ใจ , MA ) การวิเคราะห์ระบบมีการใช้ตัวแปรมาตรฐาน
3 ผลและการอภิปราย
3.1 . ความชื้นความชื้นสัมพัทธ์เฉลี่ยของเหมือนเดิม
V pompona ssp . grandiflora ผลไม้ ,สามและครึ่งถึงเก้าเดือน ที่แสดงในตารางที่ 1 วิธีเพิ่มน้ำหนักด้วยการผลไม้ได้กล่าวไว้ก่อนหน้านี้ด้วยโวลต์ Planifolia ผลไม้ ( brodelius , 1994 ) ขนาดของ 24 ผลไม้ใช้คำนวณความชื้นอยู่ระหว่าง 10 ถึง 25 ซม. ยาว 2 - 4 ซม. ความกว้าง
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- and they will not be discussed here furt
- The author has written about the exodus
- below
- เรื่องวันนี้ผมขอโทษ
- Ich habe kein Auge L ํ der Kerl für eine
- convinced
- ฉันรู้สึกเบื่อกับทุกสิ่งทุกอย่างไม่อยากท
- นี้คือเวลาการผลิตที่เร็วและดีที่สุดสำหรั
- 按照
- นอนอยู่บนเตียงและหลับ
- motto.
- Press and hold the - button. Turn the di
- ผมกับเขาสนิทกันเปรียบเสมือนคนในครอบครัว
- YesSaidTomQuicklyAnywaySaidDannyI'veCome
- ได้รับการอนุมัติ
- บทสนทนา
- ฉันกำลังหาเพื่อนเพื่อมาสอนภาษาให้ฉัน
- ได้รับเงินเดือนที่สูงมาก
- You're Education
- assuring non abandonment; foreshadowing;
- แต่คงไม่มีทางเป็นไปได้
- Please hold the line, wait a minute.
- Hot Swap Hard Drive Replacement and RAID
- กลุ่มตัวอย่างมีความพึงพอใจ
