Immunohistochemical AnalysisBiopsy

Immunohistochemical Analysis
Biopsy specimens were washed three times with iced phosphate-
buffered saline for 5 minutes to remove any exogenous
SP-A that may have migrated from the lower airways. After
thawing to 20°C and overnight decalcification, followed by
fixation in 4% paraformaldehyde, 4-μm-thick sectionswere cut
fromparaffin blocks containing representative tissue samples.
Paraffin sections were dewaxed in xylene, rehydrated through
a graded alcohol series, placed in 10 mmol/L of citrate buffer,
and submitted to heat retrieval using a vapor lock for 40
minutes. After heating, the slides were allowed to cool to
room temperature and briefly washed with Tris (hydroxymethyl)
amino methane-buffered saline. Endogenous peroxidase
activity was blocked with 3% hydrogen peroxide in
methanol for 5 minutes. Normal serum (Novo stain Super
ABC kit, Novocastra, Newcastle upon Tyne, England) was used
for 30 minutes to block nonspecific immunostaining. Immunohistochemical
staining was performed using a standard
avidin-biotin peroxidase system (Novo stain Super ABC kit).
The monoclonal antibody SP-A (isotype; immunoglobulin [Ig]
G2a purchased from Abcam) were used in concentration of 1/
200. Two slides for SP-A antibodies and isotypic control (mouse
monoclonal IgG2a as negative control) were incubated overnight
at room temperature. Following washing in phosphatebuffered
saline, biotinylated universal secondary antibody
(Novo stain Super ABC kit) was applied for 30 minutes. The
sections then were incubated with the avidin-biotin complex
reagent (Novo stain Super ABC kit) for 30 minutes and developed
with 3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride in phosphate-
buffered saline (pH 7.5) containing 0.036% hydrogen
peroxide for 5 minutes. Light Mayer hematoxylin was applied
as a counterstain. The slides thenwere dehydrated in a series of
ethanol and mounted with permount. Cytoplasmic or membranous
staining was considered as positive. Two negative
control sections were used in each case; one was incubated
with the secondary antibody only, the other with the primary
antibody only. Sections of human lung stained with anti SP-A
antibodies were used for positive control. Cells were considered
positive for anti SP-A antibodieswhen at least 10% of cells
show diffuse cytoplasmic or membranous staining.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

น่าตัวอย่างการตรวจชิ้นเนื้อถูกล้าง 3 ครั้ง ด้วยเย็นฟอสเฟต-เกลือบัฟเฟอร์ 5 นาทีการเอาภายนอกใด ๆSP-A ที่อาจได้ย้ายจากการบินต่ำกว่า หลังจากที่ละลาย 20° C และค้างคืน decalcification ตามด้วยมีขนาด 4% paraformaldehyde ตัด 4 ไมครอนหนา sectionswereบล็อก fromparaffin ที่ประกอบด้วยตัวอย่างเนื้อเยื่อแทนพาราฟินมี dewaxed ในพารา rehydrated ผ่านชุดจัดระดับแอลกอฮอล์ วาง 10 mmol/L ของซิเตรตบัฟเฟอร์และส่งไปเรียกความร้อนที่ใช้ล็อคไอ 40นาที หลังจากเครื่องทำความร้อน ภาพนิ่งถูกปล่อยให้เย็นเพื่ออุณหภูมิห้อง และสั้น ๆ ล้าง ด้วยทริส (hydroxymethyl)เกลือบัฟเฟอร์มีเทนกรดอะมิโน ฮอสภายนอกกิจกรรมถูกบล็อก ด้วย 3% ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ในเมทานอล 5 นาที ปกติในซีรั่ม (สีย้อม Novo ซูเปอร์ใช้ ABC ชุด Novocastra ท่องเที่ยว อังกฤษ)30 นาทีการบล็อก immunostaining เจาะจง น่าการย้อมสีทำโดยใช้มาตรฐานโบโอติน-avidin ฮอสระบบ (Novo ย้อมชุดซูเปอร์ ABC)แอนติบอดี monoclonal SP-A (isotype เฉพาะส่วน [Ig]G2a ซื้อจาก Abcam) ใช้ในความเข้มข้น 1 /200. สองภาพนิ่งการแอนตี้ SP-A และ isotypic (เมาส์IgG2a โมโนเป็นตัวควบคุมค่าลบ) ได้รับการกกค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง ซักผ้าต่อไปนี้ใน phosphatebufferedbiotinylated เกลือ แอนติบอดีรองสากลมีใช้ (Novo ย้อมชุดซูเปอร์ ABC) 30 นาที การส่วนนั้นถูกได้รับการกกกับคอมเพล็กซ์ avidin-โบโอตินรีเอเจนต์ (Novo ย้อมชุดซูเปอร์ ABC) 30 นาที และพัฒนากับ 3, 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride ฟอสเฟต-เกลือบัฟเฟอร์ (pH 7.5) ที่มี 0.036% ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 5 นาที ใช้แสงเมเยอร์ hematoxylinเป็น counterstain Thenwere ภาพนิ่งที่อบแห้งในชุดของเอทานอล และยึด permount รายการเลือก หรือ membranousการย้อมสีถูกถือว่าเป็นบวก ลบสองใช้ส่วนควบคุมในแต่ละกรณี หนึ่งไม่ได้รับการกกด้วยการเติมแอนติบอดี้รองเท่านั้น อื่น ๆ ที่ มีหลักแอนติบอดี ส่วนของปอดมนุษย์ย้อมด้วยป้องกัน SP Aแอนตี้ถูกใช้สำหรับการควบคุมที่ดี พิจารณาว่าเซลล์ค่าบวกสำหรับการป้องกัน antibodieswhen SP A น้อย 10% ของเซลล์แสดงการกระจายรายการเลือก หรือ membranous ย้อมสี

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

Immunohistochemical วิเคราะห์
ตัวอย่าง Biopsy ถูกล้างสามครั้งด้วยฟอสฟอรัสเย็น
น้ำเกลือบัฟเฟอร์เป็นเวลา 5 นาทีในการลบใด ๆ จากภายนอก
SP-A ที่อาจมีการอพยพมาจากที่ต่ำกว่าสายการบิน หลังจาก
ละลายไป 20 องศาเซลเซียสและ decalcification ค้างคืนตามด้วย
การตรึงใน 4% paraformaldehyde, sectionswere 4 ไมครอนหนาตัด
บล็อก fromparaffin มีตัวอย่างเนื้อเยื่อตัวแทน.
ส่วนพาราฟินถูก dewaxed ในไซลีน, rehydrated ผ่าน
ชุดเครื่องดื่มแอลกอฮอล์อย่างช้า ๆ ที่วางไว้ใน 10 มิลลิโมล / ลิตรของบัฟเฟอร์รต
และส่งไปให้ความร้อนโดยใช้การดึงล็อคไอ 40
นาที หลังจากทำความร้อน, ภาพนิ่งได้รับอนุญาตให้เย็น
อุณหภูมิห้องและในเวลาสั้น ๆ ล้างด้วย Tris (hydroxymethyl)
อะมิโนมีเทนบัฟเฟอร์น้ำเกลือ peroxidase ภายนอก
กิจกรรมถูกปิดกั้นด้วยไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ 3% ใน
เมทานอลเป็นเวลา 5 นาที ปกติซีรั่ม (Novo คราบซูเปอร์
ชุด ABC, Novocastra, Newcastle upon Tyne, อังกฤษ) ถูกนำมาใช้
เป็นเวลา 30 นาทีเพื่อป้องกันการ immunostaining เชิญชม Immunohistochemical
ย้อมสีได้รับการดำเนินการโดยใช้มาตรฐาน
ระบบ avidin-ไบโอติน peroxidase (Novo คราบชุดซูเปอร์เอบีซี).
โมโนโคลนอลแอนติบอดี SP-A (isotype; อิมมูโน [Ig]
G2a ซื้อจาก Abcam) ถูกนำมาใช้ในความเข้มข้น 1/
200 สองสไลด์สำหรับแอนติบอดี SP-A และควบคุม isotypic (เมาส์
โมโนโคลนอล IgG2a การควบคุมลบ) ถูกบ่มค้างคืน
ที่อุณหภูมิห้อง ต่อไปนี้การซักผ้าใน phosphatebuffered
น้ำเกลือ biotinylated สากลรองแอนติบอดี
(Novo คราบซูเปอร์เอบีซีชุด) ถูกนำมาใช้เป็นเวลา 30 นาที
ส่วนนั้นถูกบ่มกับความซับซ้อน avidin-ไบโอติน
สาร (Novo คราบชุดซูเปอร์เอบีซี) เป็นเวลา 30 นาทีและการพัฒนา
ที่มี 3 แบบ 3 diaminobenzidine tetrahydrochloride ในฟอสฟอรัส
บัฟเฟอร์น้ำเกลือ (pH 7.5) ที่มี 0.036% ไฮโดรเจน
เปอร์ออกไซด์เป็นเวลา 5 นาที แสงเมเยอร์ hematoxylin ถูกนำมาใช้
เป็น counterstain สไลด์ thenwere แห้งในซีรีส์ของ
เอทานอลและติดตั้งที่มี permount นิวเคลียสหรือเยื่อ
ย้อมสีได้รับการพิจารณาเป็นบวก สองเชิงลบ
ส่วนควบคุมถูกนำมาใช้ในแต่ละกรณี; หนึ่งถูกบ่ม
กับแอนติบอดีรองเท่านั้นอื่น ๆ ที่มีหลัก
แอนติบอดีเท่านั้น ในส่วนของปอดของมนุษย์ย้อมด้วยสีป้องกัน SP-A
แอนติบอดีถูกนำมาใช้สำหรับการควบคุมในเชิงบวก เซลล์ได้รับการพิจารณา
ในเชิงบวกสำหรับการป้องกัน SP-A antibodieswhen อย่างน้อย 10% ของเซลล์
แสดงกระจายการย้อมสีนิวเคลียสหรือพังผืด

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

สำหรับการวิเคราะห์ตัวอย่างเนื้อเยื่อมีซักครั้งที่สามกับฟอสเฟต - ไอซ์ในน้ำเกลือประมาณ 5 นาทีเพื่อลบใด ๆจากภายนอกsp-a ที่อาจต้องอพยพจากการบินต่ำ หลังจากละลาย 20 ° C และค้างคืนล้างบันทึกย่อ ตามด้วยการตรึงด้วย 4% พาราฟอร์มาลดิไฮด์ , 4 - μตัด m-thick sectionswerefromparaffin บล็อกที่มีเนื้อเยื่อตัวอย่างตัวแทนส่วนพาราฟินเป็น dewaxed ในไซลีนได้ทำการ รีไฮเดรทม , ผ่านระดับแอลกอฮอล์ชุดอยู่ใน 10 mmol / L ของซิเตรทบัฟเฟอร์และส่งความร้อนการใช้ไอล็อคสำหรับ 40นาที หลังเครื่อง สไลด์ ได้รับอนุญาตให้เย็นอุณหภูมิห้อง และสั้น ๆล้างด้วย ( ซี ) ทั้งนี้มีก๊าซมีเทนในน้ำเกลือ การเปลี่ยนแปลงภายในกิจกรรมที่ถูกบล็อกด้วย 3% ไฮโดรเจนเปอร์ออกไซด์ในเมทานอลเป็นเวลา 5 นาที ซีรั่มปกติ ( Novo คราบซูเปอร์ชุด novocastra ABC , Newcastle upon Tyne , อังกฤษ ) ถูกใช้30 นาที เพื่อป้องกันการติดเชื้อ immunostaining . สำหรับย้อมโดยใช้มาตรฐานระบบมีไบโอตินวิดิน ( Novo คราบซูเปอร์ชุด ABC )ส่วนโมโนโคลนอลแอนติบอดี sp-a และอิมมูโนโกลบูลิน ( ; [ iG ]g2a ซื้อจาก ABCAM ) ถูกใช้ในความเข้มข้นของ 1 /200 สองภาพนิ่งสำหรับแอนติบอดี sp-a isotypic ( เมาส์และการควบคุมโมโนโคลนอล igg2a ควบคุมเชิงลบ ) บ่มค้างคืนที่อุณหภูมิห้อง ล้าง phosphatebuffered ดังต่อไปนี้( ไลระดับแอนติบอดี , สากล( Novo คราบซูเปอร์ ABC Kit ) ใช้ 30 นาที ที่ส่วน แล้วบ่มด้วยวิดินไบโอตินที่ซับซ้อนรีเอเจนต์ ( Novo คราบซูเปอร์ ABC Kit ) เป็นเวลา 30 นาที และพัฒนา3 , 3-diaminobenzidine tetrahydrochloride ฟอสเฟต - ในในน้ำเกลือ ( pH 7.5 % ไฮโดรเจน 0.036 ) ที่มีเปอร์ออกไซด์สำหรับ 5 นาที ใช้ย้อมแสง เมเยอร์เป็นปริมาณฐาน . ภาพนิ่งค่าอบแห้งในชุดของเอทานอลและติดตั้งกับ permount . นี้หรือด้านหลังการเป็นบวก 2 ลบส่วนจำนวนที่ใช้ในแต่ละกรณี หนึ่ง คือ เชื้อกับแอนติบอดีทุติยภูมิ , อื่น ๆ ด้วยหลัก) เท่านั้น ส่วนของปอดมนุษย์ sp-a เปื้อนต่อต้านแอนติบอดีที่ถูกใช้สำหรับการควบคุมที่ดี เซลล์มีการพิจารณาบวกสำหรับป้องกัน sp-a antibodieswhen อย่างน้อย 10% ของเซลล์พบการแสดงกระจายหรือด้านหลัง staining