EXAMPLESThe standard molecular biol

EXAMPLES
The standard molecular biology techniques described by J. Sambrook et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York, 1989) were used in the experiments.


Example 1 HRM analysis of IBV
A total of 56 samples from different farms and locations were submitted to Vet Food
Agro Diagnostics (M) Sdn. Bhd. for routine IBV diagnosis in 2011. The organ samples received ranged from lungs, kidney, caecal tonsils, trachea and pooled organs. These samples were
suspected to harbor the IB virus and were sent for detection of the specified virus and
confirmation. All these samples were homogenized and tested by รีเวิร์ส transcriptase PCR and real time PCR in this study.
Nucleic acid extraction was carried out using Trizol LS reagent (Invitrogen, USA) according to the standard manufacturer's protocol.
Multiplex รีเวิร์ส Transcriptase (RT) PCR for the detection of Mass and 793/B
A multiplex, based on Si gene sequences, from a previously described วิธี
(Cavanagh et al., Avian Pathology, 28:593-605, 1999) was employed for the detection and
differentiation of two types of IBV: 793/B and Massachusetts. The oligoนิวคลีโอไทด์ (primer)
sequences were as follow: XCE2-a: CTCTATAAACACCCTTACA (SEQ ID NO:1); XCE2-b: CACTGGTAATTTTTCAGATGG (SEQ ID NO:2) (RT PCR step); XCE3-:
CAGATTGCTTACAACCACC (SEQ ID NO:3); BCE1+: AGTAGTTTTGTGTATAAACCA (SEQ ID NO:4); DCE1+: ATACAATTATATCAAACCAGC (SEQ ID NO:5); MCE1+:



AATACTACTTTTACGTTACAC (SEQ ID NO:6) (Nested step) (Adzhar et al., Avian
Pathology, 25:817-836, 1996; Cavanagh et al., Avian Pathology, 28:593-605,1999). The reaction conditions were รีเวิร์ส Transciptase step at 45°C เป็นเวลา 1 hour, 72°C เป็นเวลา 10 minutes, followed by ขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้น at 94°C เป็นเวลา 5 minutes. The amplification steps were 94°C เป็นเวลา 1 minute, 50°C เป็นเวลา 1.5 minutes, 72°C เป็นเวลา 2 minutes repeated for 30 times, followed by final extension at 72°C เป็นเวลา 2 minutes. The nested step was carried out with the following conditions: Initial
Denaturation at 94°C เป็นเวลา 5 minutes, Amplification at 94°C เป็นเวลา 1 minute, 50°C เป็นเวลา 1.5 minutes and 72°C เป็นเวลา 2 minutes for a total of 30 times, followed by final extension at 72°C เป็นเวลา 10
minutes and hold at 4°C.
One-Step RT-qPCR for the detection of IB-QX
Real time PCR was carried out with a reaction volume of 104 of SensiFAST SYBR green master mix, 0.84 of 20 pmol ฟอร์เวิร์ด primer (CTTATGCAGTAGTCAA) (SEQ ID
NO:29) and รีเวิร์ส primer (CACGTGGAATCATGCCTGTTAT) (SEQ ID NO:30) , 0.41 of รีเวิร์ส transcriptase enzyme, 0.44 of RNAse inhibitor, 4uL of template and 3.41 of ddH20. The real time PCR reactions were carried out in a LightCycler 480 real time PCR instrument (Roche, Germany). The reaction conditions were รีเวิร์ส Transciptase step at 45°C เป็นเวลา 10 นาที followed by ขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้น at 94°C เป็นเวลา 2 minutes. The amplification steps were 94°C เป็นเวลา 5 วินาที, 50°C เป็นเวลา 10 วินาที and elongation at 72°C เป็นเวลา 5 วินาที. The melting curve analysis profile were 95°C เป็นเวลา 3 sec, 58°C เป็นเวลา 1 นาที and 95°C continuous, followed by cooling at 45°C เป็นเวลา 30 วินาที.
HRM assay to differentiate IBN-C90 and I0-()X
The assay was established by using the same primer pair as described above (SEQ ID
NO:29 and SEQ ID NO:30) that amplify the hyper-variable region of the S1 gene of IB. The
assay consisted of of the highly saturated fluorescent dye (EvaGreen), 12.5u1 master mix
(Sensimix, Bioline), 2p1 of 25mM MgC12, 0.50 of the primer pair, template and PCR grade
water. The samples were loaded into the 384-well microwell plate and subjected to PCR
amplification in a real time PCR machine (LightCycler 480, Roche). The thermal cycling
reactions consisted of an initial denaturation (3 sec at 95°C). The amplification consisted of
denaturation (1 นาทีที่ 95°C), annealing (1 นาทีที่ 48°C) and extension (1 นาทีที่ 72°C). The PCR was immediately followed by วีวีing curve analysis. The differentiations of the samples were achieved by using the known positive controls and in comparison with their melting profiles.
Validation
Sensitivity of the RT real time PCR
All concentrations of reference materials were measured by a UV Spectrophotometer.
Concentrations were standardized to 10pg/ul. An end-point dilution (ten-fold serial dilution) was used until the assay could no longer detect the target organism (no detection signals).
Specificity
The specificity of the test was conducted by testing the protocol against 5 other organisms (IBV 793/B, IBV Mass, IBD, NDV, CAV, Reovirus).
Sequencing
Samples for sequencing (direct sequencing) were sent to a commercial sequencing
facility. PCR clean up and gel purification was done based on manufacturer's protocol (Analytik Jena, Germany). Results obtained were analyzed by BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) for confirmation of the reference material.
Results
Fifteen out of the fifty-six (26.8%) samples tested were positive for 793/B สายพันธุ์, nine out of fifty-six (16%) were positive for Massachusetts สายพันธุ์; thirty-two out of fifty-six (57%) were positive for QX-like สายพันธุ์; eighteen out of the fifty-six cases (32%) which were previously
reported as negative for IB were found to be positive for IB-QX when re-tested.
Validation of the real time PCR assay for the specific detection of IB-QX
Sensitivity
รูป 2 illustrates the sensitivity of the assay with an initial concentration of 10 ng/pL. Based on the threshold derived at 18.48 at the final dilution level, it is estimated that the test is highly sensitive and may be able to detect the virus at concentrations as low as 100ag.
Amplification Curve — IB-QX (Specificity)
The specificity of the assay was tested with other closely related organisms such as IB-
Massachusetts, IB-793/B, NDV, IBV and Avian PneumoVirus (APV). รูป 3 illustrates the amplification curves derived from the specificity assay.
Melting peak (Tm) - IB-QX (Specificity)
The specificity of the assay was tested with other closely related organisms such as IB-
Massachusetts, IB-793/B, NDV, IBV and APV. รูป 4 illustrates the melting peak derived from the specificity assay.
Confirmation by Sequencing Analysis
The PCR product representing S1 gene of IB-QX สายพันธุ์ was sequenced and the sequence is shown in รูป 5 (SEQ ID NO:7). The sequence was used to BLAST against GenBank
database (NCBI). The screen shot of the BLAST results and tabulated นิวคลีโอไทด์ sequence
scores as determined by the BLAST analysis are shown in รูป 5. The BLAST analysis
confirms that the melting peaks and bands obtained from the PCR analysis is IB-QX.
Comparison of the previously reported nepropathogenic IB (MH5365/95) with sequences in Genbank was done and the screen shot of the BLAST results and tabulated นิวคลีโอไทด์
sequence scores as determined by the BLAST analysis are shown in รูป 6. The BLAST
analysis confirms that the nephropathogenic สายพันธุ์ isolated in 1995 is closely related to recent IB สายพันธุ์ found in Thailand. รูป 7 shows the ความเหมือนกันของลำดับ matrix of the 7 closely related sequences to the previously isolated IB case in Malaysia (MH5365/95 and v9/04).
รูป 8 illustrates the HRM analysis to compare IB-QX, IBnC90, Mass and 793/B.
รูป 9 depicts the HRM analysis to compare/detect IB-QX and IBnC90.
IB-QX was successfully detected from the retained archived samples. 26.8% samples tested were positive for the รูปแปรผัน สายพันธุ์ - 793/B สายพันธุ์, 16% were positive for the classic IB -
Massachusetts; while 57% tested were positive for the new QX-like สายพันธุ์ that has been
circulating since 2004. 18 out of the 56 cases (32%) which were previously reported as negative for IB were found to be positive for IB-QX when re-tested. Due to lack of controls and lack of detection วิธี for the QX สายพันธุ์, some of the 2011 IB cases were falsely reported as negative. Springing from there, a วิธี was successfully modified from a previously published paper to accurately detect IB-QX (H. J. Geerligs et al., Avian Pathology, 40(1):93-102, 2011). The
changes were made to modify the วิธี from 3 hours conventional PCR to a 54 minutes real time PCR assay that could detect nucleic acid as little as 100ag/pl. However, although the
วิธี is highly sensitive and specific, it is foreseen that the new QX detection assay has its limitations as it would not be able to detect other สายพันธุ์ that may be present in poultry
specimens, not be able to detect several different types of IB สายพันธุ์ simultaneously






As the results show, a วีวี assay (HRM) that employs gene scanning
software is able to distinguish single นิวคลีโอไทด์ differences based on the hyper variable region of the Si gene to concurrently detect 4 สายพันธุ์ (793/B, Mass, QX and IBnC90) as shown in รูป 8. The possibility of conducting the assay to compare two สายพันธุ์ (QX and IBnC90) is also shown in รูป 9.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ตัวอย่างเทคนิคมาตรฐานอณูชีววิทยาอธิบายโดย J. Sambrook et al. (โคลน: คู่มือปฏิบัติการ A รุ่น 2 เย็นสปริงท่าปฏิบัติ ท่าเย็นฤดูใบไม้ผลิ นิวยอร์ก 1989) ใช้ในการทดลองตัวอย่างที่ 1 HRM วิเคราะห์ IBVจำนวน 56 ตัวอย่างจากฟาร์มต่าง ๆ และสถานส่งมาที่อาหารเรื่องน่ารู้เกษตรการวินิจฉัย (M) Sdn. bhd.ในการวินิจฉัย IBV ประจำปี 2554 ตัวอย่างอวัยวะรับแสก ๆ จากปอด ไต ทอนซิล caecal หลอดลม และอวัยวะรวม ตัวอย่างเหล่านี้ได้ สงสัยว่า harbor ไวรัส IB และส่งตรวจระบุไวรัส และ ยืนยัน ตัวอย่างเหล่านี้ทั้งหมด homogenized เป็นกลุ่ม และทดสอบ โดยรีเวิร์ส transcriptase PCR และเวลาจริง PCR ในการศึกษานี้ทำการสกัดกรดนิวคลีอิกออกใช้ Trizol LS รีเอเจนต์ (Invitrogen สหรัฐอเมริกา) ตามมาตรฐานของบริษัทผู้ผลิตโพรโทคอลรีเวิร์ส multiplex PCR Transcriptase (RT) ตรวจมวลและ 793/Bล็กแบบ ตามลำดับยีนซี จากวิธีการอธิบายไว้ก่อนหน้านี้(Al. et Cavanagh นกพยาธิ 28:593-605, 1999) ถูกว่าจ้างในการตรวจพบ และสร้างความแตกต่างของสองชนิด IBV: 793/B และแมสซาชูเซตส์ Oligoนิวคลีโอไทด์ (รองพื้น)ลำดับได้ดังต่อไปนี้: a: XCE2 CTCTATAAACACCCTTACA (ลำดับ ID ไม่: 1); XCE2-b: CACTGGTAATTTTTCAGATGG (ลำดับ ID ไม่: 2) (RT PCR ขั้น); XCE3-: CAGATTGCTTACAACCACC (ลำดับรหัสไม่มี: 3); BCE1 +: AGTAGTTTTGTGTATAAACCA (ลำดับรหัส NO: 4); DCE1 +: ATACAATTATATCAAACCAGC (ลำดับรหัส NO: 5); MCE1 +:AATACTACTTTTACGTTACAC (ลำดับ ID ไม่: 6) (Nested ขั้น) (Adzhar et al., Avianพยาธิวิทยา 25:817-836, 1996 Al. ร้อยเอ็ด Cavanagh นกพยาธิ 28:593-605,1999) เงื่อนไขปฏิกิริยาได้รีเวิร์ส Transciptase ขั้นที่ 45° C เป็นเวลานาที เป็นเวลา 72° C 10 นาที ตาม ด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่เป็นเวลา 94° C 5 นาที ขั้นตอนการขยายได้ 94° C เป็นเวลา 1 นาที 50° C เป็นเวลา 1.5 นาที เป็นเวลา 72 องศาเซลเซียส 2 นาทีทำซ้ำสำหรับ 30 ครั้ง ตาม ด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่เป็นเวลา 72° C 2 นาที ขั้นตอนซ้อนกันถูกดำเนินการ ด้วยเงื่อนไขต่อไปนี้: เริ่มต้น Denaturation ที่เป็นเวลา 94° C 5 นาที ขยายที่ 94° C เป็นเวลา 1 นาที 50° C เป็นเวลา 1.5 นาที และเป็นเวลา 72 องศาเซลเซียส 2 นาทีจำนวน 30 ครั้ง ตาม ด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่เป็นเวลา 72° C 10 นาทีและพักไว้ที่ 4 องศาเซลเซียสขั้นตอนเดียว RT qPCR ตรวจ IB QXReal time PCR ถูกดำเนินการ ด้วยปฏิกิริยา 104 SYBR SensiFAST สีเขียวหลักผสม 0.84 พื้นฟอร์เวิร์ด pmol 20 (CTTATGCAGTAGTCAA) (รหัสลำดับ NO:29) และรองพื้นรีเวิร์ส (CACGTGGAATCATGCCTGTTAT) (ลำดับ ID ไม่: 30), 0.41 ของเอ็นไซม์ transcriptase รีเวิร์ส 0.44 RNAse ผล 3.41 ของ ddH20 และ 4uL ของแม่ ปฏิกิริยา PCR เวลาจริงถูกดำเนินในเครื่อง LightCycler 480 เวลาจริง PCR มือ (Roche เยอรมนี) เงื่อนไขปฏิกิริยาขั้นตอน Transciptase รีเวิร์สที่ 45° C เป็นเวลา 10 นาทีตาม ด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่ 94° C เป็นเวลา 2 นาทีได้ ขั้นตอนการขยายถูกวินาทีเป็นเวลา 5 94° C, 50° C เป็นเวลา 10 วินาที และ elongation ที่ 72° C เป็นเวลา 5 วินาที การละลายเส้นโค้งโพรไฟล์วิเคราะห์ได้ 95° C เป็นเวลา sec 3, 58 ° C เป็นเวลา 1 นาทีและ 95° C ต่อเนื่อง ตาม ด้วยการทำความเย็นที่ 45° C เป็นเวลา 30 วินาทีHRM วิเคราะห์เพื่อแยกแยะ()อิบ-C90 และ I0 Xวิเคราะห์การก่อตั้งขึ้นโดยคู่พื้นเดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น (รหัสลำดับNO: 29 และลำดับ ID ไม่: 30) ที่ขยายเขตไฮเปอร์ตัวแปรของยีน S1 ของ IB.ทดสอบประกอบด้วยของการอิ่มตัวสูงฟลูออเรสย้อม (EvaGreen), 12.5u1 ส่วนผสมหลัก(Sensimix นำ), 1 p 2 25 มม. MgC12, 0.50 รองพื้นคู่ แม่แบบ และเกรด PCRwater. The samples were loaded into the 384-well microwell plate and subjected to PCRamplification in a real time PCR machine (LightCycler 480, Roche). The thermal cyclingreactions consisted of an initial denaturation (3 sec at 95°C). The amplification consisted ofdenaturation (1 นาทีที่ 95°C), annealing (1 นาทีที่ 48°C) and extension (1 นาทีที่ 72°C). The PCR was immediately followed by วีวีing curve analysis. The differentiations of the samples were achieved by using the known positive controls and in comparison with their melting profiles.ValidationSensitivity of the RT real time PCRAll concentrations of reference materials were measured by a UV Spectrophotometer.Concentrations were standardized to 10pg/ul. An end-point dilution (ten-fold serial dilution) was used until the assay could no longer detect the target organism (no detection signals).SpecificityThe specificity of the test was conducted by testing the protocol against 5 other organisms (IBV 793/B, IBV Mass, IBD, NDV, CAV, Reovirus).SequencingSamples for sequencing (direct sequencing) were sent to a commercial sequencingfacility. PCR clean up and gel purification was done based on manufacturer's protocol (Analytik Jena, Germany). Results obtained were analyzed by BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) for confirmation of the reference material.ResultsFifteen out of the fifty-six (26.8%) samples tested were positive for 793/B สายพันธุ์, nine out of fifty-six (16%) were positive for Massachusetts สายพันธุ์; thirty-two out of fifty-six (57%) were positive for QX-like สายพันธุ์; eighteen out of the fifty-six cases (32%) which were previously reported as negative for IB were found to be positive for IB-QX when re-tested.Validation of the real time PCR assay for the specific detection of IB-QXSensitivityรูป 2 illustrates the sensitivity of the assay with an initial concentration of 10 ng/pL. Based on the threshold derived at 18.48 at the final dilution level, it is estimated that the test is highly sensitive and may be able to detect the virus at concentrations as low as 100ag.Amplification Curve — IB-QX (Specificity)The specificity of the assay was tested with other closely related organisms such as IB-Massachusetts, IB-793/B, NDV, IBV and Avian PneumoVirus (APV). รูป 3 illustrates the amplification curves derived from the specificity assay.Melting peak (Tm) - IB-QX (Specificity) The specificity of the assay was tested with other closely related organisms such as IB-Massachusetts, IB-793/B, NDV, IBV and APV. รูป 4 illustrates the melting peak derived from the specificity assay.Confirmation by Sequencing AnalysisThe PCR product representing S1 gene of IB-QX สายพันธุ์ was sequenced and the sequence is shown in รูป 5 (SEQ ID NO:7). The sequence was used to BLAST against GenBank database (NCBI). The screen shot of the BLAST results and tabulated นิวคลีโอไทด์ sequence scores as determined by the BLAST analysis are shown in รูป 5. The BLAST analysis confirms that the melting peaks and bands obtained from the PCR analysis is IB-QX. Comparison of the previously reported nepropathogenic IB (MH5365/95) with sequences in Genbank was done and the screen shot of the BLAST results and tabulated นิวคลีโอไทด์ sequence scores as determined by the BLAST analysis are shown in รูป 6. The BLAST analysis confirms that the nephropathogenic สายพันธุ์ isolated in 1995 is closely related to recent IB สายพันธุ์ found in Thailand. รูป 7 shows the ความเหมือนกันของลำดับ matrix of the 7 closely related sequences to the previously isolated IB case in Malaysia (MH5365/95 and v9/04). รูป 8 illustrates the HRM analysis to compare IB-QX, IBnC90, Mass and 793/B. รูป 9 depicts the HRM analysis to compare/detect IB-QX and IBnC90. IB-QX was successfully detected from the retained archived samples. 26.8% samples tested were positive for the รูปแปรผัน สายพันธุ์ - 793/B สายพันธุ์, 16% were positive for the classic IB -Massachusetts; while 57% tested were positive for the new QX-like สายพันธุ์ that has been circulating since 2004. 18 out of the 56 cases (32%) which were previously reported as negative for IB were found to be positive for IB-QX when re-tested. Due to lack of controls and lack of detection วิธี for the QX สายพันธุ์, some of the 2011 IB cases were falsely reported as negative. Springing from there, a วิธี was successfully modified from a previously published paper to accurately detect IB-QX (H. J. Geerligs et al., Avian Pathology, 40(1):93-102, 2011). The
changes were made to modify the วิธี from 3 hours conventional PCR to a 54 minutes real time PCR assay that could detect nucleic acid as little as 100ag/pl. However, although the
วิธี is highly sensitive and specific, it is foreseen that the new QX detection assay has its limitations as it would not be able to detect other สายพันธุ์ that may be present in poultry
specimens, not be able to detect several different types of IB สายพันธุ์ simultaneously






As the results show, a วีวี assay (HRM) that employs gene scanning
software is able to distinguish single นิวคลีโอไทด์ differences based on the hyper variable region of the Si gene to concurrently detect 4 สายพันธุ์ (793/B, Mass, QX and IBnC90) as shown in รูป 8. The possibility of conducting the assay to compare two สายพันธุ์ (QX and IBnC90) is also shown in รูป 9.

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ตัวอย่าง
มาตรฐานอณูชีววิทยาเทคนิคที่อธิบายไว้โดย sambrook et al . ( การโคลน : คู่มือปฏิบัติการ 2 ฉบับฤดูใบไม้ผลิเย็นท่าเรือห้องปฏิบัติการ เจ้าท่าหนาวฤดูใบไม้ผลินิวยอร์ก , 1989 ) ถูกใช้ในการทดลอง


ตัวอย่าง 1 . การวิเคราะห์ IBV
รวมเป็น 56 คน จากฟาร์มที่แตกต่างกันและสถานที่ที่ถูกส่งไปยังสัตวแพทย์เกษตรอาหาร
( M ) Sdn . Bhd . การวินิจฉัยสำหรับการวินิจฉัย IBV รูทีนใน 2011 อวัยวะอย่างที่ได้รับระหว่างปอด ไต caecal ต่อมทอนซิล ขยายหลอดลม และ pooled อวัยวะ ตัวอย่างเหล่านี้ถูก
สงสัยว่าท่าเรือ IB ไวรัสและถูกส่งไปตรวจหาไวรัสที่ระบุและ
ยืนยัน ตัวอย่างเหล่านี้เป็นโฮโม และทดสอบ โดยรีเวิร์ส transcriptase PCR แบบเรียลไทม์พีซีอาร์ในการศึกษา .
การสกัดกรดนิวคลีอิกพบว่าใช้ trizol LS Reagent ( Invitrogen , USA ) ตามขั้นตอนมาตรฐานของผู้ผลิต .
เพี้ยงรีเวิร์ส transcriptase ( RT ) PCR เพื่อตรวจหามวลและ 793 / b
multiplex ตามจังหวัด ยีน ลำดับ จากที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้วิธี
( แคเวินแน็ก et al . , นกวิทยา 28:593-605 , 1999 ) เป็นเครื่องมือในการตรวจหาและ
ความแตกต่างของทั้งสองประเภทของ IBV : 793 / B และแมสซาชูเซต ( ไพรเมอร์ ) และ โอลิโกนิวคลีโอไทด์
ลำดับดังนี้ xce2-a : ctctataaacacccttaca ( seq id : 1 ) ; xce2-b : cactggtaatttttcagatgg ( seq id : 2 ) ( RT PCR ขั้นตอน ) xce3 - :
cagattgcttacaaccacc ( seq id : 3 ) ; bce1 : agtagttttgtgtataaacca ( seq id ไม่ dce1 : 4 ) : atacaattatatcaaaccagc ( seq id : 5 ) mce1 :



;aatactacttttacgttacac ( seq id : 6 ) ( อยู่ขั้นตอน ) ( adzhar et al . , นก
พยาธิวิทยา 25:817-836 , 1996 ; แคเวินแน็ก et al . , นกพยาธิวิทยา 28:593-6051999 ) เงื่อนไขปฏิกิริยาเป็นรีเวิร์ส transciptase ขั้นตอนที่ 45 ° C เป็นเวลา 1 ชั่วโมง 72 ° C เป็นเวลา 10 นาที ตามด้วยขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่ 94 ° C เป็นเวลา 5 นาทีขั้นตอนการเพิ่มปริมาณเท่ากับ 94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 50 ° C เป็นเวลา 1.5 นาที 72 ° C เป็นเวลา 2 นาที ซ้ำ 30 ครั้ง ตามด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 2 นาที ที่ซ้อนกันขั้นตอนดำเนินการกับเงื่อนไขต่อไปนี้ : เริ่มต้นที่ 94 ° C (
เป็นเวลา 5 นาทีที่ 94 ° C ( เป็นเวลา 1 นาที50 ° C เป็นเวลา 1.5 นาที 72 ° C เป็นเวลา 2 นาที รวม 30 ครั้ง ตามด้วยส่วนขยายสุดท้ายที่ 72 ° C เป็นเวลา 10
นาทีค้างไว้ที่ 4 องศา qpcr RT
ขั้นตอนการตรวจหา ib-qx
เวลาจริงสามารถดำเนินการกับปฏิกิริยา ปริมาณ 104 ของ sensifast SYBR สีเขียวต้นแบบผสม 0.84 ไพรเมอร์ฟอร์เวิร์ด 20 pmol ( cttatgcagtagtcaa ) ( seq id
:29 ) และรีเวิร์สรองพื้น ( cacgtggaatcatgcctgttat ) ( seq id : 30 ) 0.41 ของรีเวิร์ส transcriptase เอนไซม์ , 0.44 ของเลสซึ่ง 4ul ของแม่แบบและ 3.41 ของ ddh20 . เวลาจริงปฏิกิริยา PCR พบว่าใน lightcycler 480 เวลาจริง ) เครื่องดนตรี ( โรช , เยอรมัน )เงื่อนไขปฏิกิริยาเป็นรีเวิร์ส transciptase ขั้นตอนที่ 45 ° C เป็นเวลา 10 นาทีตามขั้นตอนการทำให้เสียสภาพเบื้องต้นที่ 94 ° C เป็นเวลา 2 นาที ขั้นตอนการเพิ่มปริมาณเท่ากับ 94 ° C เป็นเวลา 5 วินาที 50 ° C เป็นเวลา 10 วินาที 72 ° C และการแพร่เป็นเวลา 5 วินาที .ละลายโค้งการวิเคราะห์โปรไฟล์เป็น 95 องศา C เป็นเวลา 3 วินาที , 58 องศา C เป็นเวลา 1 นาที 95 องศา C และต่อเนื่อง ตามด้วย 45 ° C เป็นเวลาเย็น 30 วินาที .
. วิเคราะห์แยกแยะและ ibn-c90 . - ( x
( ก่อตั้งขึ้นโดยใช้คู่ไพรเมอร์ ( seq เดียวกันตามที่อธิบายไว้ข้างต้น ID
: 29 : 30 หมายเลข seq ) ที่ขยาย hyper ตัวแปรเขตของ S1 ยีน .
วิเคราะห์จำนวนของไขมันอิ่มตัวสูง หลอดสี ( evagreen ) 12.5u1 Master Mix
( sensimix bioline , ) , 2p1 25mm mgc12 0.50 ของไพรเมอร์คู่ แม่แบบและน้ำเกรด
PCR จำนวนโหลดลงเครื่องก็ microwell จาน และต้องตรวจแบบ PCR
ในเวลาจริงที่เครื่อง ( lightcycler 480 , โรช )
จักรยานความร้อนปฏิกิริยาประกอบด้วย ( เริ่มต้น ( 3 วินาทีที่ 95 องศา C ) การเพิ่มปริมาณประกอบด้วย
( ( 1 นาทีที่ 95 องศา C ) อบ ( 1 นาทีที่ 48 องศา C ) และนามสกุล ( 1 นาทีที่ 72 ° C ) pcr ได้ทันทีตามด้วยวีวีไอเอ็นจีกราฟการวิเคราะห์การ differentiations ของกลุ่มตัวอย่าง โดยการใช้จักบวกการควบคุมและในการเปรียบเทียบกับละลาย

โปรไฟล์ การตรวจสอบความไวของ RT PCR
เวลาจริงที่เข้มข้นของวัสดุอ้างอิงถูกวัดโดย UV Spectrophotometer .
ความเข้มข้นมาตรฐาน 10pg / ULความหมาย : การเจือจาง ( สิบพับอุทิศถวาย ) คือใช้จนกว่าการทดสอบไม่สามารถตรวจจับสิ่งมีชีวิตเป้าหมาย ( ไม่มีสัญญาณตรวจจับ )

ต่อความจำเพาะของการทดสอบดำเนินการโดยการทดสอบโปรโตคอลกับสิ่งมีชีวิตอื่น ๆ 5 ( IBV 793 / B IBV มวล , IBD ndv CAV รีโอไวรัส
, , ) ตัวอย่างการเรียงลำดับ
( จัดลำดับโดยตรง ) ถูกส่งไปเป็นลำดับ
พาณิชย์สิ่งอำนวยความสะดวก