qPCR. Sugarcane seedlings inoculate

qPCR. Sugarcane seedlings inoculated either with or without 33.1::
pNKGFP were sampled, and the roots and aerial parts of these plants were
separated. To separate the bacterial cells from the sugarcane surface, the
root was incubated in 2 ml of PBS buffer at 28°C for 2 h, and the bacterial
cells were harvested by centrifugation. Total bacterial DNA was extracted
as described by Araújo et al. (1). After this surface sterilization, the total
DNA of the root and aerial plant parts was extracted by the cetyltrimethylammonium
bromide method, according to Doyle and Doyle (22).
The qPCR analysis was performed in a 25-l final volume, which
contained 12.5 l of the master mix of Platinum SYBR green qPCR
SuperMix-UDG (Invitrogen) and the PPNKF and PPNKRII primers (10
Meach). Aliquots of the master mix (20 l) were dispensed in the wells,
and 5 g of DNA (50 ng/l) was added as a PCR template. The qPCR
cycles consisted of a denaturation step at 94°C for 5 min, 40 cycles at 94°C
for 30 s, and a final step at 61°C for 15 s. The plasmid fragment quantification
was performed using an iCycler iQ real-time PCR instrument (Bio-
Rad Laboratories Inc.). Four replicates in duplicate were used, and a standard
curve was obtained for every run using a known copy number (105 to
108) of the linearized plasmid pNKGFP.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

qPCR การ กล้าไม้อ้อย inoculated มี หรือ ไม่ 33.1::มีความ pNKGFP และรากและส่วนทางอากาศของพืชเหล่านี้ได้แยกออก การแยกเซลล์แบคทีเรียจากผิวอ้อย การรากถูก incubated ใน 2 ml ของ PBS บัฟเฟอร์ที่ 28° C 2 h และแบคทีเรียเซลล์เก็บเกี่ยว โดย centrifugation มีสกัดดีเอ็นเอจากแบคทีเรียรวมตามที่อธิบายไว้โดย Araújo et al. (1) หลังจากนี้ฆ่าเชื้อพื้นผิว รวมดีเอ็นเอของรากและส่วนต่าง ๆ ของพืชทางอากาศถูกสกัด ด้วยการ cetyltrimethylammoniumวิธีโบรไมด์ ตามดอยล์และดอยล์ (22)ดำเนินการวิเคราะห์ qPCR ใน volume สุดท้าย 25 l ที่ประกอบด้วยการผสมผสานหลัก qPCR SYBR แพลทินัมสีเขียว 12.5 lSuperMix UDG (Invitrogen) และที่ PPNKF และ PPNKRII ไพรเมอร์ (10Meach) Aliquots ผสมหลัก (20 l) ได้คำในบ่อและ g 5 ของดีเอ็นเอ (50 ng / l) ถูกเพิ่มเป็นแบบ PCR QPCR การวงจรประกอบด้วยขั้นตอน denaturation ที่ 94° C สำหรับ 5 นาที 40 รอบที่ 94° Cสำหรับ 30 s และขั้นตอนสุดท้ายที่ 61° C 15 s นับส่วน plasmidทำโดยใช้ iCycler iQ แบบ real-time PCR เครื่องดนตรี (ไบโอ-Rad Laboratories Inc.) เหมือนกับสี่ในซ้ำถูก ใช้ และมาตรฐานเส้นโค้งที่ได้รันทุกใช้สำเนาชื่อดัง (105 การ108) ของ pNKGFP plasmid เป็นเส้นตรง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

qPCR ต้นกล้าอ้อยเชื้อทั้งที่มีหรือไม่มี 33.1 ::
pNKGFP ทำการเก็บตัวอย่างและรากอากาศและชิ้นส่วนของพืชเหล่านี้ถูก
แยกออกจากกัน เพื่อแยกเซลล์แบคทีเรียจากพื้นผิวอ้อย,
รากถูกบ่มใน 2 มิลลิลิตรของบัฟเฟอร์พีบีเอสวันที่ 28 ° C เป็นเวลา 2 ชั่วโมงและแบคทีเรีย
เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง ดีเอ็นเอของแบคทีเรียทั้งหมดถูกสกัด
ตามที่อธิบายไว้โดยAraújoและคณะ (1) หลังจากที่ฆ่าเชื้อที่พื้นผิวนี้รวม
ดีเอ็นเอของรากและส่วนต่างๆของพืชทางอากาศถูกสกัดโดย cetyltrimethylammonium
วิธีโบรไมด์ตามดอยล์และดอยล์ (22).
การวิเคราะห์ qPCR ถูกดำเนินการใน 25? ลิตรปริมาณสุดท้ายซึ่ง
มีอยู่ 12.5? ลิตรผสมต้นแบบของลาตินั่มสีเขียว SYBR qPCR
Supermix-UDG (Invitrogen) และ PPNKF และไพร PPNKRII (10
? Meach) ส่วนลงตัวของการผสมผสานต้นแบบ (20? ลิตร) ถูกจ่ายในหลุม,
และ 5? กรัมของดีเอ็นเอ (50 ng /? ลิตร) ถูกบันทึกเป็นแม่แบบ PCR qPCR
รอบประกอบด้วยขั้นตอนที่สูญเสียสภาพธรรมชาติที่ 94 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 5 นาที, 40 รอบที่ 94 ° C
เป็นเวลา 30 วินาที, และขั้นตอนสุดท้ายที่ 61 ° C เป็นเวลา 15 วินาที ปริมาณส่วนพลาสมิด
ที่ถูกดำเนินการโดยใช้ปฏิทินสาธารณะ iQ แบบ real-time PCR ตราสาร (Bio-
Rad Laboratories Inc. ) สี่ซ้ำในที่ซ้ำกันถูกนำมาใช้และมาตรฐาน
เส้นโค้งที่ได้รับสำหรับการดำเนินการทุกใช้จำนวนสำเนาที่รู้จักกัน (105
108) ของพลาสมิด linearized pNKGFP

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

qpcr . ต้นกล้าที่ปลูกอ้อยมีหรือไม่มี 33.1 : :
pnkgfp จำนวนและรากและส่วนทางอากาศของพืชเหล่านี้
แยกกัน การแยกเซลล์แบคทีเรียจากผิวอ้อย
ราก ) 2 ml ของ PBS buffer ที่ 28 ° C 2 H , และเซลล์แบคทีเรีย
ถูกเก็บเกี่ยวโดยการปั่นเหวี่ยง จำนวนแบคทีเรียดีเอ็นเอ
ตามที่อธิบายไว้โดยอาราúโจ et al . ( 1 )หลังนี้ผิวฆ่าเชื้อ ดีเอ็นเอทั้งหมด
ของรากพืชจากส่วนสกัดจาก cetyltrimethylammonium
bromide ) และตามดอยล์ดอยล์ ( 22 ) .
การวิเคราะห์ qpcr แสดงใน 25 -  L สุดท้ายระดับเสียงซึ่งมี 12.5 ลิตร
 ต้นแบบผสมของทองคำขาว qpcr SYBR กรีน
supermix udg ( Invitrogen ) และ ppnkf ppnkrii และไพรเมอร์ ( 10
 meach )เฉยๆของต้นแบบผสม ( 20  L ) ถูกจ่ายในบ่อ
5  กรัมของ DNA ( 50 กรัม /  L ) คือเป็นดีเอ็นเอแม่แบบ การ qpcr
วงจรชีวิตประกอบด้วยขั้นตอนที่ ( 94 ° C เป็นเวลา 5 นาทีที่ 94 ° C
40 รอบ 30 วินาที และขั้นตอนสุดท้ายที่ 61 ° C เป็นเวลา 15 วินาที ส่วนปริมาณการใช้พลาสมิด
เป็น icycler ไอคิวเรียลไทม์ pcr เครื่องดนตรี ( ไบโอ -
ราดห้องปฏิบัติการ Inc . )สี่นาทีในที่ซ้ำกันใช้และเส้นโค้งมาตรฐาน
ได้ทุกวิ่งใช้จักคัดลอกหมายเลข ( 105 108 ช่วง

) ของพลาสมิด pnkgfp .