- ข้อความ
- ประวัติศาสตร์
2. Materials and methods2.1. Chemic
2. Materials and methods
2.1. Chemical reagents
HPLC-grade methanol, 2-propanol, sodium acetate, boric acid,
zinc chloride (ZnCl2), o-phtaldehyde (OPA) and amino acid standards
were obtained from Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA). All
other reagents were of the highest purity available and water was
Milli-Q deionized water.
2.2. Equipment and chromatographic conditions
The HPLC system used in the present work was a Shimadzu
model (LC-10 AD, Tokyo, Japan) with a 20 l injection loop and
a fluorescent detector (RF-10AXL) coupled to an LC-20AT pump.
The system was equipped with a Shimadzu C18 analytical column
(Shim-pack VP-ODS 4.6*250LC, internal diameter 4.6 mm) and a
pre-packed column holder. The column was heated to 29 ◦C with a
thermostat system (CTO-20A). An integrator was also used to analyze
the chromatographic data. The mobile phase was composed of
50 mM sodium acetate, methanol 5% and 2-propanol (pH 5.67) as
phase A and methanol 70% as phase B. These phases were eluted
in a low-pressure gradient as follows: Initially 100% phase A, after
20 min 50%, and back to 100% at 25 min elution time. Mobile phases
were filtered with Millipore 0.22 m Durapore membrane filters
before use. The fluorescent detector was set at 340 nm (excitation
wavelength) and 460 nm (emission wavelength).
2.3. Derivatization procedure and glutamate quantification
The derivatization process was performed by mixing 60 l of
sample or glutamate standard solution, 10 l of freshly prepared
methanolic OPA (13 mg), and 40 l borate buffer (pH 9.5). This final
solution was vortexed and analyzed after 5 min.
2.4. Analytical curves and method validation
The stock solutions of glutamate and internal standard
(homoserine) were dissolved in ultra pure water at 100 g/mL.
The working solutions for glutamate (0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0
and 20.0 g/mL) and homoserine (6 g/mL) were used. Retention
time, linearity, calibration, selectivity, Limit of Detection (LOD) and
Quantification (LOQ), accuracy, precision, recovery and stability
were determined in accordance with Guideline for validation methods
described by Brazilian National Agency of Sanitary Vigilance
(BANVISA) and US Food and Drug administration (US FDA) [24–25].
The selectivity was performed by comparing between matrix with
and without glutamate. Working solution and calibration solution
were used to determine the linearity and calibration curve, respectively.
We used the Hank’s buffer after retinal incubations periods to
perform calibration curve. The values of the curves were calculated
by the ratio between the peak areas corresponding to glutamate
and the internal standard, respectively, utilizing the LC solution
software. Linear regression curve (y = ax + b) was performed to
obtain the correlation coefficient and equation of the line.
The selectivity was analyzed by addition of glutamate into our
matrix solution and posterior association with the free analyte
matrix solution
The LOD was determined utilizing glutamate concentration
below or equal of the last concentration point utilized for the calibration
curve. The glutamate peak considered as LOD was tree
time superior of baseline. The LOQ was evaluated by the relative
standard deviation (RSD) as described in FDA guide. Precision and
accuracy were carried out in quintuplicate in three non-consecutive
days utilizing low (1 g/mL), intermediate (10 g/mL) and high
(20 g/mL) of glutamate. Precision was expressed by the RSD performed
intra and inter assay. The recovery method analysis was
determined from solutions control in three different concentrations
(low, intermediate and high) in the presence of 1% trichloroacetic
acid (TCA) during no consecutive days. The stability of analyte was
determined by measurement of low, intermediate and high glutamate
concentration maintained at room temperature for 24 h.
We also preformed analysis of analyte storage at
−20 ◦C for 48 h
followed by freeze–thaw process of evaluation being the values
determined utilizing calibration curve.
2.5. Animals
Fertilized pathogen-free white leghorn chicken (Gallus domesticus)
eggs were obtained from Makaru LTDA (Ananindeua, PA).
These eggs were incubated at 37.5 ◦C and 60% of humidity and the
stages of the chick embryo were determined according to Hamburger
and Hamilton [26]. All experiments were authorized by the
Institutional Animal Care Committee at Federal University of Pará.
2.6. Experimental procedures
Eyes from 7-day-old chicks were removed and transferred
to a calcium- and magnesium-free salt solution. Retinal tissues
were dissected and maintained in 12-well culture plates containing
Hank’s solution (128 mM NaCl; 4 mM KCl; 1 mM MgCl2;
2 mM CaCl2, 12 mM glucose and 20 mM HEPES). After that, the tissue
was incubated with different concentrations of l-glutamate
(50–2000 M) for 10 min. This incubation time was determined
based in previous experiments with retinal tissues exposed to
50 M for different time periods (tend = 5, 10, 15, 20, 25 and
30 min). All incubation periods were followed by treatment with
1% trichloroacetic acid and centrifugation at 7000 rpm by 5 min.
Glutamate quantification in the extracellular environment was performed
utilizing a mix solution with homoserine (6 g/mL) that
was used as internal standard. The transported glutamate (Glut)
was determined based on the equation,
Glut
=
[glut]t0 −
[glut]tend
where [Glut]t0 and [Glut]tend represent the glutamate concentrations
at the beginning and at the end of the experiment,
respectively.
2.7. Applicability of the method and tissue treatments
To verify the applicability of the method, we evaluated the
uptake of glutamate in retinal tissue in different situations: in
a medium containing sodium or not, different temperatures and
medium contain different concentrations of ZnCl2. Retinal tissue
was incubated in sodium-free Hank’s medium (128 mM LiCl;
4 mM KCl; 1 mM MgCl2; 2 mM CaCl2, 12 mM glucose and 20 mM
HEPES) and medium containing different concentrations ZnCl2
(10−3–10−9 M), an inhibitor of glutamate transporters. We also
evaluated the effect of different temperatures on the glutamate
uptake, for that retinal tissue was exposed to Hank’s solution at
2.1. Chemical reagents
HPLC-grade methanol, 2-propanol, sodium acetate, boric acid,
zinc chloride (ZnCl2), o-phtaldehyde (OPA) and amino acid standards
were obtained from Sigma–Aldrich (St. Louis, MO, USA). All
other reagents were of the highest purity available and water was
Milli-Q deionized water.
2.2. Equipment and chromatographic conditions
The HPLC system used in the present work was a Shimadzu
model (LC-10 AD, Tokyo, Japan) with a 20 l injection loop and
a fluorescent detector (RF-10AXL) coupled to an LC-20AT pump.
The system was equipped with a Shimadzu C18 analytical column
(Shim-pack VP-ODS 4.6*250LC, internal diameter 4.6 mm) and a
pre-packed column holder. The column was heated to 29 ◦C with a
thermostat system (CTO-20A). An integrator was also used to analyze
the chromatographic data. The mobile phase was composed of
50 mM sodium acetate, methanol 5% and 2-propanol (pH 5.67) as
phase A and methanol 70% as phase B. These phases were eluted
in a low-pressure gradient as follows: Initially 100% phase A, after
20 min 50%, and back to 100% at 25 min elution time. Mobile phases
were filtered with Millipore 0.22 m Durapore membrane filters
before use. The fluorescent detector was set at 340 nm (excitation
wavelength) and 460 nm (emission wavelength).
2.3. Derivatization procedure and glutamate quantification
The derivatization process was performed by mixing 60 l of
sample or glutamate standard solution, 10 l of freshly prepared
methanolic OPA (13 mg), and 40 l borate buffer (pH 9.5). This final
solution was vortexed and analyzed after 5 min.
2.4. Analytical curves and method validation
The stock solutions of glutamate and internal standard
(homoserine) were dissolved in ultra pure water at 100 g/mL.
The working solutions for glutamate (0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0
and 20.0 g/mL) and homoserine (6 g/mL) were used. Retention
time, linearity, calibration, selectivity, Limit of Detection (LOD) and
Quantification (LOQ), accuracy, precision, recovery and stability
were determined in accordance with Guideline for validation methods
described by Brazilian National Agency of Sanitary Vigilance
(BANVISA) and US Food and Drug administration (US FDA) [24–25].
The selectivity was performed by comparing between matrix with
and without glutamate. Working solution and calibration solution
were used to determine the linearity and calibration curve, respectively.
We used the Hank’s buffer after retinal incubations periods to
perform calibration curve. The values of the curves were calculated
by the ratio between the peak areas corresponding to glutamate
and the internal standard, respectively, utilizing the LC solution
software. Linear regression curve (y = ax + b) was performed to
obtain the correlation coefficient and equation of the line.
The selectivity was analyzed by addition of glutamate into our
matrix solution and posterior association with the free analyte
matrix solution
The LOD was determined utilizing glutamate concentration
below or equal of the last concentration point utilized for the calibration
curve. The glutamate peak considered as LOD was tree
time superior of baseline. The LOQ was evaluated by the relative
standard deviation (RSD) as described in FDA guide. Precision and
accuracy were carried out in quintuplicate in three non-consecutive
days utilizing low (1 g/mL), intermediate (10 g/mL) and high
(20 g/mL) of glutamate. Precision was expressed by the RSD performed
intra and inter assay. The recovery method analysis was
determined from solutions control in three different concentrations
(low, intermediate and high) in the presence of 1% trichloroacetic
acid (TCA) during no consecutive days. The stability of analyte was
determined by measurement of low, intermediate and high glutamate
concentration maintained at room temperature for 24 h.
We also preformed analysis of analyte storage at
−20 ◦C for 48 h
followed by freeze–thaw process of evaluation being the values
determined utilizing calibration curve.
2.5. Animals
Fertilized pathogen-free white leghorn chicken (Gallus domesticus)
eggs were obtained from Makaru LTDA (Ananindeua, PA).
These eggs were incubated at 37.5 ◦C and 60% of humidity and the
stages of the chick embryo were determined according to Hamburger
and Hamilton [26]. All experiments were authorized by the
Institutional Animal Care Committee at Federal University of Pará.
2.6. Experimental procedures
Eyes from 7-day-old chicks were removed and transferred
to a calcium- and magnesium-free salt solution. Retinal tissues
were dissected and maintained in 12-well culture plates containing
Hank’s solution (128 mM NaCl; 4 mM KCl; 1 mM MgCl2;
2 mM CaCl2, 12 mM glucose and 20 mM HEPES). After that, the tissue
was incubated with different concentrations of l-glutamate
(50–2000 M) for 10 min. This incubation time was determined
based in previous experiments with retinal tissues exposed to
50 M for different time periods (tend = 5, 10, 15, 20, 25 and
30 min). All incubation periods were followed by treatment with
1% trichloroacetic acid and centrifugation at 7000 rpm by 5 min.
Glutamate quantification in the extracellular environment was performed
utilizing a mix solution with homoserine (6 g/mL) that
was used as internal standard. The transported glutamate (Glut)
was determined based on the equation,
Glut
=
[glut]t0 −
[glut]tend
where [Glut]t0 and [Glut]tend represent the glutamate concentrations
at the beginning and at the end of the experiment,
respectively.
2.7. Applicability of the method and tissue treatments
To verify the applicability of the method, we evaluated the
uptake of glutamate in retinal tissue in different situations: in
a medium containing sodium or not, different temperatures and
medium contain different concentrations of ZnCl2. Retinal tissue
was incubated in sodium-free Hank’s medium (128 mM LiCl;
4 mM KCl; 1 mM MgCl2; 2 mM CaCl2, 12 mM glucose and 20 mM
HEPES) and medium containing different concentrations ZnCl2
(10−3–10−9 M), an inhibitor of glutamate transporters. We also
evaluated the effect of different temperatures on the glutamate
uptake, for that retinal tissue was exposed to Hank’s solution at
0/5000
2. วัสดุและวิธีการ2.1. เคมี reagentsHPLC เกรดเมทานอล 2-อย่างไร propanol โซเดียม acetate กรด boricสังกะสีคลอไรด์ (ZnCl2), o-phtaldehyde (OPA) และกรดอะมิโนมาตรฐานได้รับมาจากซิกมา-Aldrich (St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) ทั้งหมดreagents อื่น ๆ ได้มีความบริสุทธิ์สูงสุด และน้ำQ deionized น้ำ2.2. อุปกรณ์และเงื่อนไข chromatographicระบบ HPLC ที่ใช้ในงานนำเสนอถูก Shimadzuแบบจำลอง (LC 10 โฆษณา โตเกียว ญี่ปุ่น) กับวนฉีด 20 l และจับเรืองแสง (RF-10AXL) ควบคู่กับปั๊มมี LC-20ATระบบเพียบพร้อมไป ด้วยคอลัมน์วิเคราะห์ Shimadzu C18(Shim แพ็ค VP ODS 4.6 * 250LC เส้นผ่าศูนย์กลางภายใน 4.6 mm) และคอลัมน์ที่รวบรวมไว้ก่อนใส่ คอลัมน์ถูกอุณหภูมิ ◦C 29 กับการระบบอุณหภูมิ (CTO-20A) ตัวรวมที่ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์ข้อมูล chromatographic เฟสเคลื่อนประกอบด้วยacetate โซเดียม 50 มม. เมทานอล 5% และ 2-อย่างไร propanol (pH 5.67) เป็นเฟส A และเมทานอล 70% เป็นระยะที่เกิด ระยะนี้ถูก elutedในการไล่ระดับสี low-pressure ดัง: เริ่มต้น 100% ระยะ A หลัง20 นาที 50% และกลับไป 100% 25 นาที elution ครั้ง ระยะเคลื่อนถูกกรอง ด้วยแผ่นกรองเมมเบรน Durapore 0.22 m มากก่อนใช้งาน จับเรืองแสงถูกตั้ง 340 nm (ในการกระตุ้นความยาวคลื่น) และ 460 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นปล่อยก๊าซ)2.3. derivatization glutamate และขั้นตอนการนับกระบวนการ derivatization ทำ โดยการผสม 60 ลิตรตัวอย่างหรือ glutamate สารละลายมาตรฐาน l 10 ของลิ้มmethanolic OPA (13 mg), และ 40 l borate บัฟเฟอร์ (pH 9.5) สุดท้ายนี้โซลูชันที่ถูก vortexed และวิเคราะห์หลังจาก 5 นาที2.4 การเส้นโค้งที่วิเคราะห์และตรวจสอบวิธีโซลูชั่นหุ้นของ glutamate และมาตรฐานภายใน(homoserine) ที่ละลายในน้ำบริสุทธิ์ที่ 100 g/mLโซลูชั่นการทำงานสำหรับ glutamate (0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0และ 20.0 g/mL) และ homoserine (6 g/mL) ใช้ เงินวางประกันเวลา แบบดอกไม้ ปรับเทียบ วิธี ข้อจำกัดของการตรวจหารายการ (ลอด) และนับ (LOQ), ความแม่นยำ ความแม่นยำ การกู้คืน และความมั่นคงถูกกำหนดตามหลักเกณฑ์วิธีการตรวจสอบอธิบายโดยบราซิลแห่งชาติหน่วยงานของสุขาภิบาลระมัดระวัง(BANVISA) และการจัดการเราอาหารและยา (เรา FDA) [24-25]วิธีการทำ โดยการเปรียบเทียบระหว่างเมตริกซ์ด้วยโดย glutamate โซลูชั่นการทำงานและการแก้ไขปรับเทียบถูกใช้เพื่อกำหนดเส้นโค้งแบบดอกไม้และปรับเทียบ ตามลำดับเราใช้ของแฮงก์บัฟเฟอร์หลังจากรอบระยะเวลา incubations จอประสาทตาจะดำเนินการเทียบเส้นโค้ง มีคำนวณค่าของเส้นโค้งโดยอัตราส่วนระหว่างพื้นที่สูงสุดที่สอดคล้องกับ glutamateและ มาตรฐานภายใน ตามลำดับ ใช้โซลูชัน LCซอฟต์แวร์ ถดถอยเชิงเส้นโค้ง (y = ax + b) ทำให้หาสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์และสมการของเส้นวิธีที่ถูกวิเคราะห์ โดยเพิ่ม glutamate เป็นของเราโซลูชั่นเมตริกซ์และสมาคมหลังกับ analyte ฟรีโซลูชั่นเมตริกซ์กำหนดลอดใช้ความเข้มข้นของ glutamateต่ำกว่า หรือเท่ากับจุดเข้มข้นสุดท้ายที่ใช้สำหรับการปรับเทียบเส้นโค้ง ค glutamate เป็นลอดเป็นต้นห้องซูพีเรียเวลาของพื้นฐาน LOQ ถูกประเมิน โดยญาติส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน (RSD) ตามที่อธิบายไว้ในคำแนะนำขององค์การอาหารและยา ความแม่นยำ และความถูกต้องถูกดำเนินการใน quintuplicate ในสามไม่อยู่ติดกันใช้น้อย (1 g/mL), กลางวัน (10 g/mL) และสูง(20 g/mL) ของ glutamate ความแม่นยำได้แสดงออก โดย RSD ที่ดำเนินการอินทรา และอินเตอร์วิเคราะห์ การวิเคราะห์วิธีการกู้คืนได้กำหนดจากวิธีควบคุมความเข้มข้นแตกต่างกันสาม(ต่ำ กลาง และสูง) ในต่อหน้าของ trichloroacetic 1%กรด (TCA) ในระหว่างวันไม่ติดต่อกัน มีความมั่นคงของ analyteตามการประเมินของ glutamate ต่ำ ปานกลาง และสูงความเข้มข้นในการเก็บรักษาที่อุณหภูมิห้องใน 24 ชมนอกจากนี้เรายัง preformed วิเคราะห์ของ analyte เก็บที่−20 ◦C สำหรับ 48 hตามกระบวนการประเมินที่เป็นค่าหยุด – thawกำหนดใช้เทียบเส้นโค้ง2.5 การสัตว์ปฏิสนธิไก่ leghorn ศึกษาฟรีขาว (Gallus domesticus)ไข่ได้รับจาก LTDA Makaru (Ananindeua, PA)ไข่เหล่านี้ถูก incubated ที่ 37.5 ◦C และ 60% ของความชื้นและระยะตัวอ่อนเจี๊ยบถูกกำหนดตามแฮมเบอร์เกอร์และฮามิลตัน [26] การทดลองทั้งหมดได้รับอนุญาตโดยการคณะกรรมการดูแลสัตว์สถาบันที่มหาวิทยาลัยกลาง Pará2.6 การตอนที่ทดลองตาจากลูกไก่อายุ 7 วันถูกเอาออก และการโอนย้ายการเพิ่มแคลเซียม และแมกนีเซียมเกลือโซลูชัน เนื้อเยื่อจอประสาทตามีวัฒนธรรมดี 12 dissected และยังคงอยู่ในแผ่นที่ประกอบด้วยโซลูชันของแฮงก์ (128 มม. NaCl; 4 mM KCl, MgCl2; 1 มม.2 มม. CaCl2 กลูโคส 12 มม. และ 20 มม. HEPES) หลังจากนั้น เนื้อเยื่อมี incubated ด้วยความเข้มข้นแตกต่างกันของ l glutamate(50 – 2000 เมตร) สำหรับ 10 นาที ขณะนี้คณะทันตแพทยศาสตร์กำหนดใช้ในการทดลองก่อนหน้านี้กับเนื้อเยื่อจอประสาทตาสัมผัสกับ50 เมตรสำหรับรอบระยะเวลาต่าง ๆ (มัก = 5, 10, 15, 20, 25 และ30 นาที) ระยะฟักตัวทั้งหมดตามการรักษาด้วย1% กรด trichloroacetic และ centrifugation ที่ 7000 รอบต่อนาทีโดย 5 นาทีทำการนับของ Glutamate ในสภาพแวดล้อม extracellularใช้โซลูชั่นผสมกับ homoserine (6 g/mL) ที่ใช้เป็นมาตรฐานภายใน Glutamate ขนย้าย (Glut)กำหนดตามสมการGlut=[glut] t0 −[glut] มักที่ t0 [Glut] และ [Glut] มัก แสดงถึงความเข้มข้น glutamateที่จุดเริ่มต้น และสิ้นสุดการทดลองตามลำดับ2.7. ความเกี่ยวข้องของการรักษาวิธีและเนื้อเยื่อการตรวจสอบความเกี่ยวข้องของวิธีการ เราประเมินการของ glutamate ในเนื้อเยื่อจอประสาทตาในสถานการณ์ต่าง ๆ: ในสื่อที่ประกอบด้วยโซเดียม หรือไม่ อุณหภูมิแตกต่างกัน และขนาดกลางประกอบด้วยความเข้มข้นแตกต่างกันของ ZnCl2 เยื่อจอประสาทตามี incubated ในฟรีโซเดียมแฮงก์ของกลาง (128 มม. LiCl4 mM KCl มม. 1 MgCl2 2 มม. CaCl2 กลูโคส 12 มม. และ 20 มม.HEPES) และขนาดกลางที่ประกอบด้วยความเข้มข้นต่าง ๆ ZnCl2(10−3 – 10−9 M), ผลการของ glutamate ผู้ เรายังประเมินผลของอุณหภูมิที่แตกต่างกัน glutamateดูดซับ การที่เนื้อเยื่อจอประสาทตาได้สัมผัสกับโซลูชันของแฮงก์ที่
การแปล กรุณารอสักครู่..
2. วัสดุและวิธีการ
2.1 สารเคมีเมทานอล HPLC เกรด 2 โพรพานน้ำนมโซเดียมกรดบอริก, สังกะสีคลอไรด์ (ZnCl2) o-phtaldehyde (OPA) และมาตรฐานกรดอะมิโนที่ได้รับจากSigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) ทั้งหมดสารเคมีอื่น ๆ ของความบริสุทธิ์สูงสุดและน้ำเป็นพัน-Q น้ำ deionized. 2.2 อุปกรณ์และเงื่อนไขสารระบบ HPLC เพื่อใช้ในการทำงานในปัจจุบันเป็น Shimadzu รูปแบบ (LC-10 AD, กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) กับ 20 วงฉีดลิตรและเครื่องตรวจจับเรืองแสง (RF-10AXL) คู่กับปั๊ม LC-20AT ระบบได้รับการติดตั้ง Shimadzu C18 คอลัมน์วิเคราะห์(Shim แพ็ค VP-ODS 4.6 * 250LC เส้นผ่าศูนย์กลางภายใน 4.6 มิลลิเมตร) และผู้ถือคอลัมน์ก่อนบรรจุ คอลัมน์ถูกความร้อนถึง 29 ◦Cด้วยระบบเทอร์โม(CTO-20A) รวบรวมยังถูกใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลที่โครมา เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยacetate โซเดียม 50 มิลลิเมทานอล 5% และ 2 โพรพาน (pH 5.67) ขณะที่เฟสA และเมทานอล 70% เป็นระยะ B. ขั้นตอนเหล่านี้ถูกชะในการไล่ระดับความดันต่ำดังนี้ขั้นต้นขั้นตอน100% หลังจาก20 นาที 50% และกลับมาถึง 100% ในเวลา 25 นาทีชะ ขั้นตอนที่มือถือถูกกรองด้วยค 0.22? m กรองเมมเบรน Durapore ก่อนการใช้งาน เครื่องตรวจจับเรืองแสงตั้งอยู่ที่ 340 นาโนเมตร (กระตุ้นความยาวคลื่น) และ 460 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นปล่อยก๊าซเรือนกระจก). 2.3 ขั้นตอนอนุพันธ์และการหาปริมาณกลูตาเมตกระบวนการอนุพันธ์ได้ดำเนินการโดยการผสม 60 ลิตรตัวอย่างหรือกลูตาเมตสารละลายมาตรฐาน, 10 ลิตรที่เตรียมสดใหม่เมทานอลOPA (13 มก.) และ 40 ลิตรบอเรตบัฟเฟอร์ (pH 9.5) สุดท้ายนี้การแก้ปัญหาได้รับการ vortex และวิเคราะห์หลังจาก 5 นาที. 2.4 เส้นโค้งการวิเคราะห์และการตรวจสอบวิธีการแก้ปัญหาสต็อกของกลูตาเมตและมาตรฐานภายใน(homoserine) ถูกละลายในน้ำบริสุทธิ์พิเศษที่ 100 กรัม / มล. โซลูชั่นการทำงานสำหรับกลูตาเมต (0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 และ 20.0? กรัม / มิลลิลิตร) และ homoserine (6 กรัม / มิลลิลิตร) ถูกนำมาใช้ การเก็บรักษาเวลาเป็นเชิงเส้น, การสอบเทียบหัวกะทิ จำกัด ของการตรวจจับ (LOD) และปริมาณ(LOQ) ความถูกต้องแม่นยำการกู้คืนและความมั่นคงได้รับการพิจารณาให้สอดคล้องกับแนวทางการใช้วิธีการตรวจสอบการอธิบายโดยสำนักงานแห่งชาติของบราซิลสุขาภิบาลระมัดระวัง(BANVISA) และสหรัฐอเมริกา อาหารและยา (FDA สหรัฐ) [24-25]. การเลือกดำเนินการโดยการเปรียบเทียบระหว่างเมทริกซ์ที่มีและไม่มีกลูตาเมต วิธีการแก้ปัญหาการทำงานและการแก้ปัญหาการสอบเทียบที่ถูกใช้ในการกำหนดเส้นตรงและเส้นโค้งการสอบเทียบตามลำดับ. เราใช้บัฟเฟอร์ของแฮงค์หลังจากระยะเวลาฟักตัวของเชื้อที่จอประสาทตาที่จะดำเนินการสอบเทียบโค้ง ค่าของเส้นโค้งนี้จะถูกคำนวณจากอัตราส่วนระหว่างพื้นที่สูงสุดที่สอดคล้องกับกลูตาเมตและมาตรฐานภายในตามลำดับการใช้วิธีการแก้ปัญหาLC ซอฟแวร์ เส้นโค้งการถดถอยเชิงเส้น (y ขวาน + = ข) ได้รับการดำเนินการเพื่อให้ได้ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์และสมการของเส้น. การเลือกมาวิเคราะห์โดยนอกเหนือจากกลูตาเมตเข้าของเราแก้ปัญหาเมทริกซ์และสมาคมหลังกับวิเคราะห์ฟรีวิธีการแก้ปัญหาเมทริกซ์ล็อดก็ตัดสินใจใช้กลูตาเมตความเข้มข้นด้านล่างหรือเท่ากับความเข้มข้นของจุดที่ผ่านมาใช้สำหรับการสอบเทียบโค้ง กลูตาเมตสูงสุดถือว่าเป็นล็อดเป็นต้นไม้เวลาที่เหนือกว่าของพื้นฐาน LOQ ถูกประเมินโดยเทียบค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน(RSD) ตามที่อธิบายไว้ในคู่มือองค์การอาหารและยา ความแม่นยำและความถูกต้องถูกดำเนินการใน quintuplicate ในสามที่ไม่ได้ติดต่อกันเป็นวันที่ใช้ต่ำ(1 กรัม / มิลลิลิตร), กลาง (10 กรัม / มิลลิลิตร) และสูง(20 กรัม / มิลลิลิตร) ของกลูตาเมต ความแม่นยำถูกแสดงโดย RSD ดำเนินการทดสอบภายในและระหว่าง การวิเคราะห์วิธีการกู้คืนที่ถูกกำหนดจากการควบคุมของการแก้ปัญหาในระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกันสาม(ต่ำกลางและสูง) ในการปรากฏตัวของ 1% ไตรคลอโรกรด(TCA) ในระหว่างวันติดต่อกันไม่มี ความมั่นคงของวิเคราะห์ที่ได้รับการกำหนดโดยการวัดต่ำกลางและกลูตาเมตสูงความเข้มข้นเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา24 ชม. นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์ preformed ของการจัดเก็บวิเคราะห์ที่-20 ◦Cเป็นเวลา 48 ชั่วโมงตามด้วยกระบวนการแช่แข็งละลายของการประเมินผลเป็นค่ากำหนดใช้กราฟมาตรฐาน. 2.5 สัตว์เพาะเชื้อโรคฟรีไก่ฮอนสีขาว (Gallus domesticus) ไข่ที่ได้รับจาก Makaru LTDA (Ananindeua, PA). ไข่เหล่านี้ถูกบ่มที่ 37.5 ◦Cและ 60% ของความชื้นและขั้นตอนของตัวอ่อนเจี๊ยบได้รับการพิจารณาตามแฮมเบอร์เกอร์และแฮมิลตัน [26] การทดสอบทั้งหมดนี้ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลสัตว์สถาบันที่มหาวิทยาลัยแห่งชาติปารา. 2.6 ขั้นตอนการทดลองตาจากลูกไก่ 7 วันเก่าที่ถูกถอดออกและย้ายไปยังcalcium- และสารละลายเกลือแมกนีเซียมฟรี เนื้อเยื่อม่านตาถูกชำแหละและการบำรุงรักษาใน 12 แผ่นเดียวกับวัฒนธรรมที่มีวิธีการแก้ปัญหาของแฮงค์(128 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 4 มิลลิ KCl 1 มิลลิ MgCl2; 2 มิลลิ CaCl2 กลูโคส 12 มิลลิและ 20 มิลลิ HEPES) หลังจากนั้นเนื้อเยื่อถูกบ่มที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของ l-กลูตาเมต (50-2000? M) เป็นเวลา 10 นาที เวลาฟักตัวนี้ถูกกำหนดอยู่ในการทดลองก่อนหน้านี้ด้วยเนื้อเยื่อที่สัมผัสกับจอประสาทตา50 M สำหรับช่วงเวลาที่แตกต่างกัน (= มีแนวโน้มที่ 5, 10, 15, 20, 25 และ30 นาที) ระยะเวลาการบ่มทั้งหมดตามมาด้วยการรักษาด้วย1% กรดไตรคลอโรและหมุนเหวี่ยงที่ 7,000 รอบต่อนาทีโดย 5 นาที. ปริมาณกลูตาเมตในสภาพแวดล้อมนอกได้ดำเนินการใช้วิธีการแก้ปัญหาด้วยการผสมผสาน homoserine (6 กรัม / มิลลิลิตร) ที่ถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานภายใน รสขนส่ง (เหลือเฟือ) ถูกกำหนดขึ้นอยู่กับสมการเหลือเฟือ? = [เหลือเฟือ] t0 - [เหลือเฟือ] มีแนวโน้มที่[เหลือเฟือ] t0 และ [เหลือเฟือ] มีแนวโน้มที่เป็นตัวแทนของความเข้มข้นของกลูตาเมตที่จุดเริ่มต้นและในตอนท้ายของการทดลอง, ตามลำดับ. 2.7 การบังคับใช้ของวิธีการและการรักษาเนื้อเยื่อในการตรวจสอบการบังคับใช้ของวิธีการที่เราประเมินการดูดซึมของกลูตาเมตในเนื้อเยื่อของจอประสาทตาในสถานการณ์ที่แตกต่างกันในการเป็นสื่อที่มีโซเดียมหรือไม่อุณหภูมิที่แตกต่างกันและขนาดกลางที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของZnCl2 เนื้อเยื่อม่านตาถูกบ่มโซเดียมฟรีกลางของแฮงค์ (128 มิลลิ LiCl; 4 มิลลิ KCl 1 มิลลิ MgCl2 2 มิลลิ CaCl2 12 มิลลิกลูโคสและ 20 มิลลิHEPES) และขนาดกลางที่มีความเข้มข้นแตกต่างกัน ZnCl2 (10-3-10-9 M ) ยับยั้งการขนส่งของกลูตาเมต นอกจากนี้เรายังมีการประเมินผลกระทบของอุณหภูมิที่แตกต่างกันในกลูตาเมตการดูดซึมเพื่อที่เนื้อเยื่อจอประสาทตาได้สัมผัสกับวิธีการแก้ปัญหาของแฮงค์ที่
2.1 สารเคมีเมทานอล HPLC เกรด 2 โพรพานน้ำนมโซเดียมกรดบอริก, สังกะสีคลอไรด์ (ZnCl2) o-phtaldehyde (OPA) และมาตรฐานกรดอะมิโนที่ได้รับจากSigma-Aldrich (เซนต์หลุยส์สหรัฐอเมริกา) ทั้งหมดสารเคมีอื่น ๆ ของความบริสุทธิ์สูงสุดและน้ำเป็นพัน-Q น้ำ deionized. 2.2 อุปกรณ์และเงื่อนไขสารระบบ HPLC เพื่อใช้ในการทำงานในปัจจุบันเป็น Shimadzu รูปแบบ (LC-10 AD, กรุงโตเกียวประเทศญี่ปุ่น) กับ 20 วงฉีดลิตรและเครื่องตรวจจับเรืองแสง (RF-10AXL) คู่กับปั๊ม LC-20AT ระบบได้รับการติดตั้ง Shimadzu C18 คอลัมน์วิเคราะห์(Shim แพ็ค VP-ODS 4.6 * 250LC เส้นผ่าศูนย์กลางภายใน 4.6 มิลลิเมตร) และผู้ถือคอลัมน์ก่อนบรรจุ คอลัมน์ถูกความร้อนถึง 29 ◦Cด้วยระบบเทอร์โม(CTO-20A) รวบรวมยังถูกใช้ในการวิเคราะห์ข้อมูลที่โครมา เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วยacetate โซเดียม 50 มิลลิเมทานอล 5% และ 2 โพรพาน (pH 5.67) ขณะที่เฟสA และเมทานอล 70% เป็นระยะ B. ขั้นตอนเหล่านี้ถูกชะในการไล่ระดับความดันต่ำดังนี้ขั้นต้นขั้นตอน100% หลังจาก20 นาที 50% และกลับมาถึง 100% ในเวลา 25 นาทีชะ ขั้นตอนที่มือถือถูกกรองด้วยค 0.22? m กรองเมมเบรน Durapore ก่อนการใช้งาน เครื่องตรวจจับเรืองแสงตั้งอยู่ที่ 340 นาโนเมตร (กระตุ้นความยาวคลื่น) และ 460 นาโนเมตร (ความยาวคลื่นปล่อยก๊าซเรือนกระจก). 2.3 ขั้นตอนอนุพันธ์และการหาปริมาณกลูตาเมตกระบวนการอนุพันธ์ได้ดำเนินการโดยการผสม 60 ลิตรตัวอย่างหรือกลูตาเมตสารละลายมาตรฐาน, 10 ลิตรที่เตรียมสดใหม่เมทานอลOPA (13 มก.) และ 40 ลิตรบอเรตบัฟเฟอร์ (pH 9.5) สุดท้ายนี้การแก้ปัญหาได้รับการ vortex และวิเคราะห์หลังจาก 5 นาที. 2.4 เส้นโค้งการวิเคราะห์และการตรวจสอบวิธีการแก้ปัญหาสต็อกของกลูตาเมตและมาตรฐานภายใน(homoserine) ถูกละลายในน้ำบริสุทธิ์พิเศษที่ 100 กรัม / มล. โซลูชั่นการทำงานสำหรับกลูตาเมต (0.1, 0.5, 1.0, 2.5, 5.0, 10.0 และ 20.0? กรัม / มิลลิลิตร) และ homoserine (6 กรัม / มิลลิลิตร) ถูกนำมาใช้ การเก็บรักษาเวลาเป็นเชิงเส้น, การสอบเทียบหัวกะทิ จำกัด ของการตรวจจับ (LOD) และปริมาณ(LOQ) ความถูกต้องแม่นยำการกู้คืนและความมั่นคงได้รับการพิจารณาให้สอดคล้องกับแนวทางการใช้วิธีการตรวจสอบการอธิบายโดยสำนักงานแห่งชาติของบราซิลสุขาภิบาลระมัดระวัง(BANVISA) และสหรัฐอเมริกา อาหารและยา (FDA สหรัฐ) [24-25]. การเลือกดำเนินการโดยการเปรียบเทียบระหว่างเมทริกซ์ที่มีและไม่มีกลูตาเมต วิธีการแก้ปัญหาการทำงานและการแก้ปัญหาการสอบเทียบที่ถูกใช้ในการกำหนดเส้นตรงและเส้นโค้งการสอบเทียบตามลำดับ. เราใช้บัฟเฟอร์ของแฮงค์หลังจากระยะเวลาฟักตัวของเชื้อที่จอประสาทตาที่จะดำเนินการสอบเทียบโค้ง ค่าของเส้นโค้งนี้จะถูกคำนวณจากอัตราส่วนระหว่างพื้นที่สูงสุดที่สอดคล้องกับกลูตาเมตและมาตรฐานภายในตามลำดับการใช้วิธีการแก้ปัญหาLC ซอฟแวร์ เส้นโค้งการถดถอยเชิงเส้น (y ขวาน + = ข) ได้รับการดำเนินการเพื่อให้ได้ค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์และสมการของเส้น. การเลือกมาวิเคราะห์โดยนอกเหนือจากกลูตาเมตเข้าของเราแก้ปัญหาเมทริกซ์และสมาคมหลังกับวิเคราะห์ฟรีวิธีการแก้ปัญหาเมทริกซ์ล็อดก็ตัดสินใจใช้กลูตาเมตความเข้มข้นด้านล่างหรือเท่ากับความเข้มข้นของจุดที่ผ่านมาใช้สำหรับการสอบเทียบโค้ง กลูตาเมตสูงสุดถือว่าเป็นล็อดเป็นต้นไม้เวลาที่เหนือกว่าของพื้นฐาน LOQ ถูกประเมินโดยเทียบค่าเบี่ยงเบนมาตรฐาน(RSD) ตามที่อธิบายไว้ในคู่มือองค์การอาหารและยา ความแม่นยำและความถูกต้องถูกดำเนินการใน quintuplicate ในสามที่ไม่ได้ติดต่อกันเป็นวันที่ใช้ต่ำ(1 กรัม / มิลลิลิตร), กลาง (10 กรัม / มิลลิลิตร) และสูง(20 กรัม / มิลลิลิตร) ของกลูตาเมต ความแม่นยำถูกแสดงโดย RSD ดำเนินการทดสอบภายในและระหว่าง การวิเคราะห์วิธีการกู้คืนที่ถูกกำหนดจากการควบคุมของการแก้ปัญหาในระดับความเข้มข้นที่แตกต่างกันสาม(ต่ำกลางและสูง) ในการปรากฏตัวของ 1% ไตรคลอโรกรด(TCA) ในระหว่างวันติดต่อกันไม่มี ความมั่นคงของวิเคราะห์ที่ได้รับการกำหนดโดยการวัดต่ำกลางและกลูตาเมตสูงความเข้มข้นเก็บรักษาไว้ที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา24 ชม. นอกจากนี้เรายังวิเคราะห์ preformed ของการจัดเก็บวิเคราะห์ที่-20 ◦Cเป็นเวลา 48 ชั่วโมงตามด้วยกระบวนการแช่แข็งละลายของการประเมินผลเป็นค่ากำหนดใช้กราฟมาตรฐาน. 2.5 สัตว์เพาะเชื้อโรคฟรีไก่ฮอนสีขาว (Gallus domesticus) ไข่ที่ได้รับจาก Makaru LTDA (Ananindeua, PA). ไข่เหล่านี้ถูกบ่มที่ 37.5 ◦Cและ 60% ของความชื้นและขั้นตอนของตัวอ่อนเจี๊ยบได้รับการพิจารณาตามแฮมเบอร์เกอร์และแฮมิลตัน [26] การทดสอบทั้งหมดนี้ได้รับอนุมัติจากคณะกรรมการการดูแลสัตว์สถาบันที่มหาวิทยาลัยแห่งชาติปารา. 2.6 ขั้นตอนการทดลองตาจากลูกไก่ 7 วันเก่าที่ถูกถอดออกและย้ายไปยังcalcium- และสารละลายเกลือแมกนีเซียมฟรี เนื้อเยื่อม่านตาถูกชำแหละและการบำรุงรักษาใน 12 แผ่นเดียวกับวัฒนธรรมที่มีวิธีการแก้ปัญหาของแฮงค์(128 มิลลิโซเดียมคลอไรด์ 4 มิลลิ KCl 1 มิลลิ MgCl2; 2 มิลลิ CaCl2 กลูโคส 12 มิลลิและ 20 มิลลิ HEPES) หลังจากนั้นเนื้อเยื่อถูกบ่มที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของ l-กลูตาเมต (50-2000? M) เป็นเวลา 10 นาที เวลาฟักตัวนี้ถูกกำหนดอยู่ในการทดลองก่อนหน้านี้ด้วยเนื้อเยื่อที่สัมผัสกับจอประสาทตา50 M สำหรับช่วงเวลาที่แตกต่างกัน (= มีแนวโน้มที่ 5, 10, 15, 20, 25 และ30 นาที) ระยะเวลาการบ่มทั้งหมดตามมาด้วยการรักษาด้วย1% กรดไตรคลอโรและหมุนเหวี่ยงที่ 7,000 รอบต่อนาทีโดย 5 นาที. ปริมาณกลูตาเมตในสภาพแวดล้อมนอกได้ดำเนินการใช้วิธีการแก้ปัญหาด้วยการผสมผสาน homoserine (6 กรัม / มิลลิลิตร) ที่ถูกนำมาใช้เป็นมาตรฐานภายใน รสขนส่ง (เหลือเฟือ) ถูกกำหนดขึ้นอยู่กับสมการเหลือเฟือ? = [เหลือเฟือ] t0 - [เหลือเฟือ] มีแนวโน้มที่[เหลือเฟือ] t0 และ [เหลือเฟือ] มีแนวโน้มที่เป็นตัวแทนของความเข้มข้นของกลูตาเมตที่จุดเริ่มต้นและในตอนท้ายของการทดลอง, ตามลำดับ. 2.7 การบังคับใช้ของวิธีการและการรักษาเนื้อเยื่อในการตรวจสอบการบังคับใช้ของวิธีการที่เราประเมินการดูดซึมของกลูตาเมตในเนื้อเยื่อของจอประสาทตาในสถานการณ์ที่แตกต่างกันในการเป็นสื่อที่มีโซเดียมหรือไม่อุณหภูมิที่แตกต่างกันและขนาดกลางที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของZnCl2 เนื้อเยื่อม่านตาถูกบ่มโซเดียมฟรีกลางของแฮงค์ (128 มิลลิ LiCl; 4 มิลลิ KCl 1 มิลลิ MgCl2 2 มิลลิ CaCl2 12 มิลลิกลูโคสและ 20 มิลลิHEPES) และขนาดกลางที่มีความเข้มข้นแตกต่างกัน ZnCl2 (10-3-10-9 M ) ยับยั้งการขนส่งของกลูตาเมต นอกจากนี้เรายังมีการประเมินผลกระทบของอุณหภูมิที่แตกต่างกันในกลูตาเมตการดูดซึมเพื่อที่เนื้อเยื่อจอประสาทตาได้สัมผัสกับวิธีการแก้ปัญหาของแฮงค์ที่
การแปล กรุณารอสักครู่..
2 . วัสดุและวิธีการ
2.1 . สารเคมี
HPLC เกรดเมทานอล , โพรพานอล , โซเดียมอะซิเตท , boric acid
สังกะสีคลอไรด์ ( zncl2 ) o-phtaldehyde ( OPA ) และกรดอะมิโนมาตรฐาน
ได้จาก Sigma –ดิช ( St . Louis , MO , USA ) สารเคมีอื่น ๆทั้งหมด
ของความบริสุทธิ์ของน้ำสูงสุดและ milli-q คล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ
.
2.2 . อุปกรณ์และเงื่อนไข
โครมาโทกราฟีพบระบบที่ใช้ในงานปัจจุบันเป็น Shimadzu
แบบ ( lc-10 ลงประกาศ , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) กับ 20 ผมฉีดวงและ
เครื่องตรวจจับเรืองแสง ( rf-10axl ) คู่กับ lc-20at ปั๊ม
ระบบติดตั้งกับ Shimadzu c18 วิเคราะห์คอลัมน์
( ชิม แพ็ค vp-ods 4.6 * 250lc ภายในเส้นผ่าศูนย์กลาง 4.6 มม. ) และ
ก่อนบรรจุใส่คอลัมน์ คอลัมน์ให้ความร้อนถึง 29 ◦ C กับ
ระบบเทอร์โมสตัท ( cto-20a )การ ) ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์
ข้อมูลทางโครมาโทกราฟี เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย
โซเดียมอะซีเตท 50 มม. ส่วน 5% และโพรพานอล ( pH 5.67 )
เฟสและเมทานอล 70 % เป็นระยะระยะ พ. เหล่านี้คือตัวอย่าง
ในความดันต่ำ ไล่ระดับ ดังนี้ เริ่มต้น 100% ระยะหลังจากที่
20 นาที 50 % และกลับถึง 100% ที่ 25 นาที ( เวลา ระยะเคลื่อนที่
ถูกกรองด้วยมิลลิ 022 ตัวกรองเมมเบรน M durapore
ก่อนใช้ เครื่องตรวจจับเรืองแสงไว้ที่ 340 nm ( i
ความยาวคลื่น ) และ 460 nm ( ปล่อยความยาวคลื่น ) .
2.3 ขั้นตอน และผงชูรสปริมาณซัลซัล
กระบวนการทำโดยผสม 60 l
ตัวอย่างหรือสารละลายมาตรฐานผงชูรส , 10 ล. เตรียม
สด opa ( 13 มก. ) , เมทานอลและฉัน 40 บอเรตบัฟเฟอร์ pH 9.5 ) สุดท้ายนี้
สารละลายที่ vortexed และวิเคราะห์หลังจาก 5 นาที
2.4 . เส้นโค้งเชิงวิเคราะห์ และวิธีการตรวจสอบหุ้นและโซลูชั่นของผงชูรส
มาตรฐานภายใน ( โฮโมเซอรีน ) ละลายใน อัลตร้า น้ำบริสุทธิ์ที่ 100 กรัม / มล.
โซลูชั่นการทำงานสำหรับกลูตาเมต ( 0.1 , 0.5 , 1.0 , 2.5 , 5.0 และ 10.0 20.0
กรัม / มิลลิลิตร ) และโฮโมเซอรีน ( 6 กรัม / มิลลิลิตร ) สถิติที่ใช้ การเก็บรักษา
เวลาเป็นเส้นตรง , สอบเทียบ , โอกาสในการเลือกขีดจำกัดของการตรวจหา ( LOD ) และปริมาณ (
loq ) , ความแม่นยำความถูกต้อง , การกู้คืนและเสถียรภาพ
ถูกกำหนดตามแนวทางวิธีการตรวจสอบ
อธิบายโดยหน่วยงานแห่งชาติบราซิลของสุขาภิบาลแค้น
( banvisa ) และสำนักงานคณะกรรมการอาหารและยา ( FDA ) [ 24 – 25 ] .
เลือกสรรแสดงโดยการเปรียบเทียบเมทริกซ์กับ
และไม่มีผงชูรสทำงานและแก้ปัญหาการใช้โซลูชั่น
เพื่อกำหนดความถี่รูปโค้ง ตามลำดับ
เราใช้กันชนหลังจอประสาทตา แฮงค์ incubations คาบ
แสดงการปรับเส้นโค้ง ค่าของกราฟคำนวณ
โดยอัตราส่วนระหว่างพื้นที่สูงสุดสอดคล้องกับผงชูรส
และมาตรฐานภายใน ตามลำดับ การใช้โซลูชั่น LC
ซอฟต์แวร์เส้นการถดถอยเชิงเส้น ( y = ax
b ) แสดงให้ หาค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ และสมการของเส้น .
เลือกสรรแบบเติมผงชูรสลงในสารละลายเมทริกซ์ของเรา
แล้วและสมาคมกับครู
เมทริกซ์ฟรีโซลูชั่นแต่ตั้งใจใช้ผงชูรส
ต่ำกว่าหรือเท่ากับความเข้มข้นของความเข้มข้นจุดสุดท้าย ที่ใช้สำหรับการสอบเทียบ
โค้งส่วนผงชูรส พีคถือว่าเป็นลอดต้นไม้
เวลาที่เหนือกว่าของ พื้นฐาน โดย loq ประเมินโดยเทียบ
ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ( RSD ) ตามที่อธิบายไว้ในคู่มือของ FDA ความถูกต้องแม่นยำและ
ทดลองในสำเนา 5 ฉบับใน 3 วันไม่ติดต่อกัน
ใช้น้อย ( 1 g / ml ) , กลาง ( 10 กรัม / มิลลิลิตร ) และสูง
( 20 g / ml ) ของผงชูรส แม่นยำถูกแสดงโดยพิจารณาดำเนินการ
ภายในและระหว่างการทดสอบ การกู้คืนข้อมูลในการวิเคราะห์เป็น
3 พิจารณาจากโซลูชั่นการควบคุมความเข้มข้นต่างๆ
( ต่ำ ปานกลาง และสูง ) ในการแสดงตนของ 1 เปอร์เซ็นต์กรดไตรคลอโรอะซิติก
( TCA ) ในระหว่างวันไม่ติดต่อกัน เสถียรภาพของครูถูกกำหนดโดยการวัด
ต่ำกลางและสูงของผงชูรส
รักษาที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมง
เรายังเหลือการวิเคราะห์ครูกระเป๋าที่
− 20 ◦ C 48 H
ตามด้วยแช่แข็งและละลายกระบวนการประเมินผลการพิจารณาการใช้เส้นโค้งสอบเทียบค่า
.
2.5 มีสีขาวปลอดโรคสัตว์
ไก่ลูกผสม ( gallus เลี้ยง
ไข่ที่ได้จาก makaru Ltda ( Ananindeua , PA )
ไข่เหล่านี้อุณหภูมิ 37.5 ◦ C และ 60% ของความชื้นและ
ขั้นตอนของเจี๊ยบตัวอ่อนถูกกำหนดตามและแฮมเบอร์เกอร์
แฮมิลตัน [ 26 ] การทดลองที่ได้รับ
สถาบันคณะกรรมการที่ดูแลสัตว์ . kgm พาร์ มหาวิทยาลัยสหพันธ์ .
2.6 การทดลองขั้นตอน
สายตาจากสาวๆ 7-day-old ถูกถอดออกและย้าย
ให้แคลเซียมและแมกนีเซียมเกลือฟรีโซลูชั่น เนื้อเยื่อเรติ
ถูกตัด และรักษาวัฒนธรรมใน 12 ดีจานที่มี
แฮงค์ โซลูชั่น ( 128 มม. ขนาด 4 mm . 1 มม. ชุด ;
2 มม. ผลิตกลูโคสและ 20 มม. 12 มม. ฮีเปส ) หลังจากนั้น เนื้อเยื่อ
ถูกบ่มที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของ
( 50 - 2000 M ) นาน 10 นาที ระยะเวลานี้ถูกกำหนดใช้ในการทดลองก่อนหน้านี้ด้วย
เนื้อเยื่อสัมผัสกับจอประสาทตา50 M สำหรับช่วงเวลา ( มัก = 5 , 10 , 15 , 20 , 25 และ
30 นาที ) ระยะเวลาทั้งหมด ตามด้วยการรักษาด้วยกรดไตรคลอโรอะซิติก
1 % และ 7 , 000 รอบต่อนาที ปั่น 5 นาที
ผงชูรสปริมาณในสิ่งแวดล้อมและการใช้โซลูชั่น
ผสมโฮโมเซอรีน ( 6 g / ml )
ถูกใช้เป็นมาตรฐานภายใน การเคลื่อนย้าย ผงชูรส ( glut )
คือพิจารณาจากสมการ ,
เหลือเฟือ
=
[ ]
[ − glut t0 เหลือเฟือ ] มีแนวโน้ม
ที่ไหน [ เหลือเฟือ ] t0 [ จำนวนที่มากเกินไปและมักจะเป็นตัวแทนของกลูตาเมทความเข้มข้น ]
ที่จุดเริ่มต้นและที่สิ้นสุดการทดลอง
2.7 ตามลำดับ . การประยุกต์ใช้วิธีการและการรักษาเนื้อเยื่อ
เพื่อตรวจสอบความเกี่ยวข้องของวิธีการที่เราประเมิน
การดูดซึมของกลูตาเมตในจอประสาทตา เนื้อเยื่อในสถานการณ์ที่แตกต่างกันใน
อาหารที่มีโซเดียม หรือ ไม่ อุณหภูมิที่แตกต่างกันและมีความเข้มข้นแตกต่างกันของ zncl2
ขนาดกลาง .
เนื้อเยื่อเรติคือ ) โซเดียมฟรีแฮงค์กลาง ( 128 มม. 20 . ;
4 mm . 1 มม. ผลิตไอโซโทป 2 มม. 12 มม. และ 20 มม. กลูโคส
ฮีเปส ) และอาหารที่มีความเข้มข้นต่างๆ zncl2
( 10 − 3 – 10 − 9 M ) เป็นการยับยั้งของผงชูรสขนส่ง .
เรายังประเมิน ผลกระทบของอุณหภูมิที่แตกต่างกันในผงชูรส
การดูดซึมที่จอประสาทตา ทิชชู่ถูกโซลูชั่นที่แฮงค์
2.1 . สารเคมี
HPLC เกรดเมทานอล , โพรพานอล , โซเดียมอะซิเตท , boric acid
สังกะสีคลอไรด์ ( zncl2 ) o-phtaldehyde ( OPA ) และกรดอะมิโนมาตรฐาน
ได้จาก Sigma –ดิช ( St . Louis , MO , USA ) สารเคมีอื่น ๆทั้งหมด
ของความบริสุทธิ์ของน้ำสูงสุดและ milli-q คล้ายเนื้อเยื่อประสานน้ำ
.
2.2 . อุปกรณ์และเงื่อนไข
โครมาโทกราฟีพบระบบที่ใช้ในงานปัจจุบันเป็น Shimadzu
แบบ ( lc-10 ลงประกาศ , โตเกียว , ญี่ปุ่น ) กับ 20 ผมฉีดวงและ
เครื่องตรวจจับเรืองแสง ( rf-10axl ) คู่กับ lc-20at ปั๊ม
ระบบติดตั้งกับ Shimadzu c18 วิเคราะห์คอลัมน์
( ชิม แพ็ค vp-ods 4.6 * 250lc ภายในเส้นผ่าศูนย์กลาง 4.6 มม. ) และ
ก่อนบรรจุใส่คอลัมน์ คอลัมน์ให้ความร้อนถึง 29 ◦ C กับ
ระบบเทอร์โมสตัท ( cto-20a )การ ) ถูกใช้เพื่อวิเคราะห์
ข้อมูลทางโครมาโทกราฟี เฟสเคลื่อนที่ประกอบด้วย
โซเดียมอะซีเตท 50 มม. ส่วน 5% และโพรพานอล ( pH 5.67 )
เฟสและเมทานอล 70 % เป็นระยะระยะ พ. เหล่านี้คือตัวอย่าง
ในความดันต่ำ ไล่ระดับ ดังนี้ เริ่มต้น 100% ระยะหลังจากที่
20 นาที 50 % และกลับถึง 100% ที่ 25 นาที ( เวลา ระยะเคลื่อนที่
ถูกกรองด้วยมิลลิ 022 ตัวกรองเมมเบรน M durapore
ก่อนใช้ เครื่องตรวจจับเรืองแสงไว้ที่ 340 nm ( i
ความยาวคลื่น ) และ 460 nm ( ปล่อยความยาวคลื่น ) .
2.3 ขั้นตอน และผงชูรสปริมาณซัลซัล
กระบวนการทำโดยผสม 60 l
ตัวอย่างหรือสารละลายมาตรฐานผงชูรส , 10 ล. เตรียม
สด opa ( 13 มก. ) , เมทานอลและฉัน 40 บอเรตบัฟเฟอร์ pH 9.5 ) สุดท้ายนี้
สารละลายที่ vortexed และวิเคราะห์หลังจาก 5 นาที
2.4 . เส้นโค้งเชิงวิเคราะห์ และวิธีการตรวจสอบหุ้นและโซลูชั่นของผงชูรส
มาตรฐานภายใน ( โฮโมเซอรีน ) ละลายใน อัลตร้า น้ำบริสุทธิ์ที่ 100 กรัม / มล.
โซลูชั่นการทำงานสำหรับกลูตาเมต ( 0.1 , 0.5 , 1.0 , 2.5 , 5.0 และ 10.0 20.0
กรัม / มิลลิลิตร ) และโฮโมเซอรีน ( 6 กรัม / มิลลิลิตร ) สถิติที่ใช้ การเก็บรักษา
เวลาเป็นเส้นตรง , สอบเทียบ , โอกาสในการเลือกขีดจำกัดของการตรวจหา ( LOD ) และปริมาณ (
loq ) , ความแม่นยำความถูกต้อง , การกู้คืนและเสถียรภาพ
ถูกกำหนดตามแนวทางวิธีการตรวจสอบ
อธิบายโดยหน่วยงานแห่งชาติบราซิลของสุขาภิบาลแค้น
( banvisa ) และสำนักงานคณะกรรมการอาหารและยา ( FDA ) [ 24 – 25 ] .
เลือกสรรแสดงโดยการเปรียบเทียบเมทริกซ์กับ
และไม่มีผงชูรสทำงานและแก้ปัญหาการใช้โซลูชั่น
เพื่อกำหนดความถี่รูปโค้ง ตามลำดับ
เราใช้กันชนหลังจอประสาทตา แฮงค์ incubations คาบ
แสดงการปรับเส้นโค้ง ค่าของกราฟคำนวณ
โดยอัตราส่วนระหว่างพื้นที่สูงสุดสอดคล้องกับผงชูรส
และมาตรฐานภายใน ตามลำดับ การใช้โซลูชั่น LC
ซอฟต์แวร์เส้นการถดถอยเชิงเส้น ( y = ax
b ) แสดงให้ หาค่าสัมประสิทธิ์สหสัมพันธ์ และสมการของเส้น .
เลือกสรรแบบเติมผงชูรสลงในสารละลายเมทริกซ์ของเรา
แล้วและสมาคมกับครู
เมทริกซ์ฟรีโซลูชั่นแต่ตั้งใจใช้ผงชูรส
ต่ำกว่าหรือเท่ากับความเข้มข้นของความเข้มข้นจุดสุดท้าย ที่ใช้สำหรับการสอบเทียบ
โค้งส่วนผงชูรส พีคถือว่าเป็นลอดต้นไม้
เวลาที่เหนือกว่าของ พื้นฐาน โดย loq ประเมินโดยเทียบ
ส่วนเบี่ยงเบนมาตรฐาน ( RSD ) ตามที่อธิบายไว้ในคู่มือของ FDA ความถูกต้องแม่นยำและ
ทดลองในสำเนา 5 ฉบับใน 3 วันไม่ติดต่อกัน
ใช้น้อย ( 1 g / ml ) , กลาง ( 10 กรัม / มิลลิลิตร ) และสูง
( 20 g / ml ) ของผงชูรส แม่นยำถูกแสดงโดยพิจารณาดำเนินการ
ภายในและระหว่างการทดสอบ การกู้คืนข้อมูลในการวิเคราะห์เป็น
3 พิจารณาจากโซลูชั่นการควบคุมความเข้มข้นต่างๆ
( ต่ำ ปานกลาง และสูง ) ในการแสดงตนของ 1 เปอร์เซ็นต์กรดไตรคลอโรอะซิติก
( TCA ) ในระหว่างวันไม่ติดต่อกัน เสถียรภาพของครูถูกกำหนดโดยการวัด
ต่ำกลางและสูงของผงชูรส
รักษาที่อุณหภูมิห้องเป็นเวลา 24 ชั่วโมง
เรายังเหลือการวิเคราะห์ครูกระเป๋าที่
− 20 ◦ C 48 H
ตามด้วยแช่แข็งและละลายกระบวนการประเมินผลการพิจารณาการใช้เส้นโค้งสอบเทียบค่า
.
2.5 มีสีขาวปลอดโรคสัตว์
ไก่ลูกผสม ( gallus เลี้ยง
ไข่ที่ได้จาก makaru Ltda ( Ananindeua , PA )
ไข่เหล่านี้อุณหภูมิ 37.5 ◦ C และ 60% ของความชื้นและ
ขั้นตอนของเจี๊ยบตัวอ่อนถูกกำหนดตามและแฮมเบอร์เกอร์
แฮมิลตัน [ 26 ] การทดลองที่ได้รับ
สถาบันคณะกรรมการที่ดูแลสัตว์ . kgm พาร์ มหาวิทยาลัยสหพันธ์ .
2.6 การทดลองขั้นตอน
สายตาจากสาวๆ 7-day-old ถูกถอดออกและย้าย
ให้แคลเซียมและแมกนีเซียมเกลือฟรีโซลูชั่น เนื้อเยื่อเรติ
ถูกตัด และรักษาวัฒนธรรมใน 12 ดีจานที่มี
แฮงค์ โซลูชั่น ( 128 มม. ขนาด 4 mm . 1 มม. ชุด ;
2 มม. ผลิตกลูโคสและ 20 มม. 12 มม. ฮีเปส ) หลังจากนั้น เนื้อเยื่อ
ถูกบ่มที่มีความเข้มข้นแตกต่างกันของ
( 50 - 2000 M ) นาน 10 นาที ระยะเวลานี้ถูกกำหนดใช้ในการทดลองก่อนหน้านี้ด้วย
เนื้อเยื่อสัมผัสกับจอประสาทตา50 M สำหรับช่วงเวลา ( มัก = 5 , 10 , 15 , 20 , 25 และ
30 นาที ) ระยะเวลาทั้งหมด ตามด้วยการรักษาด้วยกรดไตรคลอโรอะซิติก
1 % และ 7 , 000 รอบต่อนาที ปั่น 5 นาที
ผงชูรสปริมาณในสิ่งแวดล้อมและการใช้โซลูชั่น
ผสมโฮโมเซอรีน ( 6 g / ml )
ถูกใช้เป็นมาตรฐานภายใน การเคลื่อนย้าย ผงชูรส ( glut )
คือพิจารณาจากสมการ ,
เหลือเฟือ
=
[ ]
[ − glut t0 เหลือเฟือ ] มีแนวโน้ม
ที่ไหน [ เหลือเฟือ ] t0 [ จำนวนที่มากเกินไปและมักจะเป็นตัวแทนของกลูตาเมทความเข้มข้น ]
ที่จุดเริ่มต้นและที่สิ้นสุดการทดลอง
2.7 ตามลำดับ . การประยุกต์ใช้วิธีการและการรักษาเนื้อเยื่อ
เพื่อตรวจสอบความเกี่ยวข้องของวิธีการที่เราประเมิน
การดูดซึมของกลูตาเมตในจอประสาทตา เนื้อเยื่อในสถานการณ์ที่แตกต่างกันใน
อาหารที่มีโซเดียม หรือ ไม่ อุณหภูมิที่แตกต่างกันและมีความเข้มข้นแตกต่างกันของ zncl2
ขนาดกลาง .
เนื้อเยื่อเรติคือ ) โซเดียมฟรีแฮงค์กลาง ( 128 มม. 20 . ;
4 mm . 1 มม. ผลิตไอโซโทป 2 มม. 12 มม. และ 20 มม. กลูโคส
ฮีเปส ) และอาหารที่มีความเข้มข้นต่างๆ zncl2
( 10 − 3 – 10 − 9 M ) เป็นการยับยั้งของผงชูรสขนส่ง .
เรายังประเมิน ผลกระทบของอุณหภูมิที่แตกต่างกันในผงชูรส
การดูดซึมที่จอประสาทตา ทิชชู่ถูกโซลูชั่นที่แฮงค์
การแปล กรุณารอสักครู่..
ภาษาอื่น ๆ
การสนับสนุนเครื่องมือแปลภาษา: กรีก, กันนาดา, กาลิเชียน, คลิงออน, คอร์สิกา, คาซัค, คาตาลัน, คินยารวันดา, คีร์กิซ, คุชราต, จอร์เจีย, จีน, จีนดั้งเดิม, ชวา, ชิเชวา, ซามัว, ซีบัวโน, ซุนดา, ซูลู, ญี่ปุ่น, ดัตช์, ตรวจหาภาษา, ตุรกี, ทมิฬ, ทาจิก, ทาทาร์, นอร์เวย์, บอสเนีย, บัลแกเรีย, บาสก์, ปัญจาป, ฝรั่งเศส, พาชตู, ฟริเชียน, ฟินแลนด์, ฟิลิปปินส์, ภาษาอินโดนีเซี, มองโกเลีย, มัลทีส, มาซีโดเนีย, มาราฐี, มาลากาซี, มาลายาลัม, มาเลย์, ม้ง, ยิดดิช, ยูเครน, รัสเซีย, ละติน, ลักเซมเบิร์ก, ลัตเวีย, ลาว, ลิทัวเนีย, สวาฮิลี, สวีเดน, สิงหล, สินธี, สเปน, สโลวัก, สโลวีเนีย, อังกฤษ, อัมฮาริก, อาร์เซอร์ไบจัน, อาร์เมเนีย, อาหรับ, อิกโบ, อิตาลี, อุยกูร์, อุสเบกิสถาน, อูรดู, ฮังการี, ฮัวซา, ฮาวาย, ฮินดี, ฮีบรู, เกลิกสกอต, เกาหลี, เขมร, เคิร์ด, เช็ก, เซอร์เบียน, เซโซโท, เดนมาร์ก, เตลูกู, เติร์กเมน, เนปาล, เบงกอล, เบลารุส, เปอร์เซีย, เมารี, เมียนมา (พม่า), เยอรมัน, เวลส์, เวียดนาม, เอสเปอแรนโต, เอสโทเนีย, เฮติครีโอล, แอฟริกา, แอลเบเนีย, โคซา, โครเอเชีย, โชนา, โซมาลี, โปรตุเกส, โปแลนด์, โยรูบา, โรมาเนีย, โอเดีย (โอริยา), ไทย, ไอซ์แลนด์, ไอร์แลนด์, การแปลภาษา.
- Инструкция по активации:----------------
- ระว่ังแตก
- ฉันจะไม่มีเงินกลับบ้าน
- in this expression,
- ลูกแก้ว
- Many doctor today believe that smoking c
- （跟代理收）
- นลละวัชท์
- ขอรักเธอได้ไหม
- You are my happiness
- （跟代理收）
- และทำลายป่าไม้
- I welcome you in my life
- North america is a continent wholly with
- คุณเป็นคนเก่ง มีความสามารถ
- okay, i will now start to plan myself to
- North america is a continent wholly with
- view
- ฉันเป็นคนเรียนร้อย พูดน้อย แต่ถ้าได้รู้จ
- the opportunity to make use of Informati
- ฉันเป็นคนเรียนร้อย พูดน้อย แต่ถ้าได้รู้จ
- การทำสบู่แฟนซี
- ฉันจะไม่มีเงินกลับบ้าน
- ตอนนี้ฉันเป็นหนี้เยอะมาก
