The full-length sequence of OsMAX1e

The full-length sequence of OsMAX1e was acquired
through the amplification of Nipponbare DNA. The
coding regions of OsMAX1a were also acquired
through the amplification of Nipponbare cDNA. Then
the DNA fragments of OsMAX1e and OsMAX1a were
connected to pEASYTM-T1 Simple-Cloning Vector
(TransGene), respectively. The correct recombinant
plasmids T1-OsMAX1a and T1-OsMAX1e were
confirmed by sequencing. T1-OsMAX1a and pHB were
connected after being digested by Xba I and Sac I
restriction endonucleases. Meanwhile, T1-OsMAX1e
and pHB were digested by Xba I and Hind III
restriction endonucleases before connecting. Ultimately,
we constructed the vectors pHB-OsMAX1a and
pHB-OsMAX1e driven by the 35S promoter.
The 400 bp mRNA sequences were used to construct
the RNA interference vectors RNAi-OsMAX1a and
RNAi-OsMAX1e. Because OsMAX1 has multiple
copies, the conservative sequence of OsMAX1a was
also selected to design another RNAi fragment, i.e.,
RNAi-OsMAX1CON. All RNAi-OsMAX1-sense
sequences were acquired through the amplification of
Nipponbare cDNA (the primer sequences are shown in
Table 2). RNAi-OsMAX1-sense was digested by Sal I
and Hind III restriction endonucleases and then
connected with the vector pSK-int to generate
intermediate vector pSK-Sense. RNAi-antisense was
digested by CoR I/Sac I restriction endonucleases and
then connected with the pSK-Sense vector to construct
pSK-RNAi. Two pSK-RNAi vectors pSK-OsMAX1a
-RNAi and pSK-OsMAX1e-RNAi were generated.
The reconstructed plasmid pSK-RNAi was digested
with Sal I and Sac I restriction endonucleases and the
1 kb segments were recycled for RNAi. Connecting
the purified RNAi clips with pOsAct2-1-nos, we got
the recombinant plasmids OsMAX1a-RNAi and
OsMAX1e-RNAi, and further validated with Sal I and
Sac I restriction endonucleases. The construction of
interference vector and the structure of pHB-OsMAX1
are showed in Supplemental Fig. 3.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ลำดับที่เต็มตัวของ OsMAX1e มาผ่านการขยายสัญญาณของดีเอ็นเอ Nipponbare การรหัสภูมิภาคของ OsMAX1a ได้รับมายังผ่านการขยายสัญญาณของ Nipponbare cDNA แล้วมีชิ้นส่วนดีเอ็นเอของ OsMAX1e และ OsMAX1aเชื่อมต่อกับ T1 ง่าย pEASYTM ลนเวกเตอร์(TransGene), ตามลำดับ การควบรวมที่ถูกต้องplasmids T1 OsMAX1a และ T1-OsMAX1eยืนยัน โดยลำดับ T1 OsMAX1a และ pHBเชื่อมต่อหลังจากถูกย่อย โดย Xba ฉันและท้องฉันendonucleases จำกัด ในขณะเดียวกัน T1-OsMAX1eและ pHB ย่อย โดย Xba ฉันและ III การรักษาendonucleases ข้อจำกัดก่อนการเชื่อมต่อ ในที่สุดเราสร้างเวกเตอร์ pHB-OsMAX1a และpHB-OsMAX1e ขับเคลื่อน โดยโปรโมเตอร์ 35Sใช้สร้าง mRNA ลำดับ 400 ของ bpรบกวน RNA เวกเตอร์ RNAi OsMAX1a และRNAi-OsMAX1e เนื่องจาก OsMAX1 มีหลายสำเนา ลำดับที่อนุรักษ์ของ OsMAX1a ได้เลือกการออกแบบส่วนอื่นของ RNAi เช่นRNAi-OsMAX1CON RNAi-OsMAX1-ความลำดับที่ได้รับมาผ่านการขยายสัญญาณNipponbare cDNA (ลำดับรองพื้นแสดงในตาราง 2) RNAi-OsMAX1-ความรู้สึกที่ถูกย่อยสลาย โดย Sal ฉันและ endonucleases จำกัดไฮนด์ III แล้วเชื่อมต่อกับ pSK int เวกเตอร์เพื่อสร้างpSK เวกเตอร์กลางความรู้สึก มี RNAi antisenseย่อย โดย CoR ฉัน / Sac ฉัน endonucleases จำกัด และจากนั้น เชื่อมต่อกับเวกเตอร์สัมผัส pSK เพื่อสร้างpSK RNAi เวกเตอร์สอง pSK-RNAi pSK-OsMAX1aสร้าง - RNAi และ pSK-OsMAX1e-RNAiสร้างขึ้นใหม่ plasmid pSK-RNAi ถูกย่อยสลายมีสาละฉันและ Sac ฉัน endonucleases จำกัดและ1 kb ส่วนรีไซเคิลสำหรับ RNAi การเชื่อมต่อคลิป RNAi ที่บริสุทธิ์กับ pOsAct2-1-ชุดหมายเลข ที่เราได้plasmids recombinant OsMAX1a RNAi และOsMAX1e-RNAi และการ ตรวจสอบกับ Sal ฉัน และท้องฉัน endonucleases จำกัด การก่อสร้างรบกวนเวกเตอร์และโครงสร้างของ pHB OsMAX1จะแสดงในรูปเพิ่มเติม 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ลำดับยาวเต็มรูปแบบของ OsMAX1e ถูกซื้อ
ผ่านการขยายของ Nipponbare ดีเอ็นเอ
ภูมิภาคเข้ารหัสของ OsMAX1a ยังได้รับมา
ผ่านการขยายของ Nipponbare cDNA จากนั้น
ชิ้นส่วนดีเอ็นเอของ OsMAX1e และ OsMAX1a ถูก
เชื่อมต่อกับ pEASYTM-T1 ง่ายโคลนเวกเตอร์
(ยีน) ตามลำดับ ที่ถูกต้อง recombinant
พลาสมิด T1-OsMAX1a และ T1-OsMAX1e ถูก
ยืนยันโดยลำดับ T1-OsMAX1a และ PHB ถูก
เชื่อมต่อหลังจากที่ถูกย่อยโดย XBA ฉันและฉัน Sac
endonucleases ข้อ จำกัด ในขณะเดียวกัน T1-OsMAX1e
และ PHB ถูกย่อยโดย XBA I และ III หลัง
endonucleases ข้อ จำกัด ก่อนการเชื่อมต่อ ในท้ายที่สุด
เราสร้างเวกเตอร์ PHB-OsMAX1a และ
PHB-OsMAX1e ขับเคลื่อนโดยโปรโมเตอร์ 35S.
400 bp mRNA ลำดับถูกนำมาใช้ในการสร้าง
กระบวนการ RNA interference เวกเตอร์ RNAi-OsMAX1a และ
RNAi-OsMAX1e เพราะ OsMAX1 มีหลาย
เล่มลำดับอนุรักษ์นิยมของ OsMAX1a ถูก
ยังเลือกที่จะออกแบบชิ้นส่วนอื่น RNAi คือ
RNAi-OsMAX1CON ทั้งหมด RNAi-OsMAX1 ความรู้สึก
ลำดับที่ได้มาผ่านเครื่องขยายเสียงของ
Nipponbare ยีน (ลำดับไพรเมอร์จะแสดงใน
ตารางที่ 2) RNAi-OsMAX1 ความรู้สึกที่ถูกย่อยโดยพะยอม
และหลัง III endonucleases ข้อ จำกัด และจากนั้น
เชื่อมต่อกับเวกเตอร์ PSK-int เพื่อสร้าง
กลางเวกเตอร์ PSK-Sense RNAi-antisense ถูก
ย่อยโดย COR I / Sac ฉัน endonucleases ข้อ จำกัด และ
การเชื่อมต่อกับเวกเตอร์ PSK-Sense ที่จะสร้างแล้ว
PSK-RNAi สอง PSK-RNAi เวกเตอร์ PSK-OsMAX1a
-RNAi และ PSK-OsMAX1e-RNAi ถูกสร้างขึ้น.
สร้างขึ้นใหม่พลาสมิด PSK-RNAi ถูกย่อย
ด้วย Sal ฉันและฉัน Sac endonucleases ข้อ จำกัด และ
1 กลุ่ม KB ถูกนำกลับมาใช้ RNAi การเชื่อมต่อ
บริสุทธิ์คลิป RNAi กับ pOsAct2-1-Nos เรามี
พลาสมิด recombinant OsMAX1a-RNAi และ
OsMAX1e-RNAi และการตรวจสอบต่อไปด้วย Sal I และ
Sac ฉัน endonucleases ข้อ จำกัด การก่อสร้าง
รบกวนเวกเตอร์และโครงสร้างของ PHB-OsMAX1
จะแสดงให้เห็นในรูปเพิ่มเติม 3

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ลำดับเต็มตัวของ osmax1e ได้รับมาผ่านแบบ nipponbare ดีเอ็นเอ ที่รหัสภูมิภาคของ osmax1a ยังได้รับผ่านการเพิ่มปริมาณของยีน nipponbare . จากนั้นมีดีเอ็นเอของ osmax1e osmax1a เป็นและเชื่อมต่อกับ peasytm-t1 เวกเตอร์โคลนง่าย( ยีน ) ตามลำดับ คอมที่ถูกต้องและมี t1-osmax1a t1-osmax1e พลาสมิดยืนยันโดยลำดับ . t1-osmax1a PHB ) และที่เชื่อมต่อหลังจากถูกย่อยโดย xba ผมและถุงฉันจำกัดสงบเงียบ . ขณะเดียวกัน t1-osmax1eและ ถูกย่อยโดย xba PHB และเอนไซม์ Hind IIIจำกัดสงบเงียบก่อนเชื่อมต่อ ในที่สุดเราสร้าง phb-osmax1a เวกเตอร์และphb-osmax1e ขับเคลื่อนด้วย 35s โปรโมเตอร์400 BP mRNA ลำดับถูกใช้เพื่อสร้างรบกวน rnai-osmax1a ยีนและเวกเตอร์rnai-osmax1e เพราะ osmax1 มีหลายชุด , ลำดับ osmax1a คืออนุรักษ์ของยังเลือกที่จะออกแบบหาชิ้นส่วนอื่น เช่นrnai-osmax1con . rnai-osmax1-sense ทั้งหมดลำดับได้มาผ่านการขยายของnipponbare cDNA ( ไพรเมอร์ ) จะแสดงในตารางที่ 2 ) rnai-osmax1-sense ถูกย่อยแบบฉันสงบเงียบและจำกัด 3 หลังแล้วที่เกี่ยวข้องกับเวกเตอร์ psk int เพื่อสร้างเวกเตอร์ psk กลางความรู้สึก antisense ถูกโอนิกส์ย่อยสินค้าผม / ถุงผมจำกัดสงบเงียบและแล้วเชื่อมต่อกับ psk ความรู้สึกเวกเตอร์สร้างpsk RNAi . หา psk-osmax1a psk สองเวกเตอร์- หา และ psk-osmax1e-rnai ขึ้น .การสร้างพลาสมิด psk RNAi ก็เข้าใจกับเกลือและถุงผมสงบเงียบและข้อ จำกัดกลุ่ม 1 กิโลได้กลับมาหา . เชื่อมต่อบริสุทธิ์ที่หาคลิปกับ posact2-1-nos , เราได้การรีคอมบิแนนท์พลาสมิด osmax1a RNAi และosmax1e RNAi และเพิ่มเติมการตรวจสอบกับเกลือและในถุงผมจำกัดสงบเงียบ . การก่อสร้างของเวกเตอร์ phb-osmax1 สัญญาณรบกวนและโครงสร้างของจะแสดงในรูปที่ 3 เสริม .