Free amino acids (AA) and biogenic

Free amino acids (AA) and biogenic amines (BA) were quantified for the first time in Cannonau and Vermentino wines, the two most popular “Controlled Designation of Origin” wines from Sardinia (Italy). An analytical method for the simultaneous determination of AA and BA was developed, using selective derivatization with dansyl chloride followed by HPLC with fluorescence detection. Thirty-two compounds were identified in the wines analysed. High levels of AA were found, with proline being the most abundant with average levels of 1244 ± 398 and 1008 ± 281 mg/L in Cannonau and Vermentino wines, respectively. BA were detected at average concentrations 99.9%) were obtained from Sigma–Aldrich, Merck and Carlo Erba (Milan, Italy). AA and BA stock standard solutions (ca. 1000 mg/L) were prepared by dilution with 0.1 M HCl/MeOH (1:1, v/v) and stored at 4 ± 1 °C until use. The derivatization agent solution was prepared dissolving 50 mg of dansyl chloride (DCl) in 10 mL of acetone, and was stored at 4 ± 1 °C until use (solution is stable for up to 3 months). Ultrapure water (18.0 MΩ cm, 25 °C) was obtained with a Milli-Q Advantage A10 System apparatus (Millipore, Milan, Italy).

2.2. Wine samples
Eight wine samples of “Cannonau di Sardegna DOC” and seven wine samples of “Vermentino di Sardegna DOC” produced in Sardinia (Italy) from the 2012 harvest were analysed. Samples were commercially available wines supplied directly by nine different wineries with certified origin and made using standard oenological procedures. Five wineries supplied one sample of both Cannonau and Vermentino wines, one winery supplied two samples of Vermentino wines obtained with grapes harvested in different areas, and the other three wineries gifted one sample of Cannonau wine each. These wineries together account for 90% of the production of Cannonau and Vermentino wines in Sardinia.

2.3. Amino acids and biogenic amines derivatization
Determination of AA and BA was carried out after derivatization with DCl. The reaction mixture was prepared in 1.5 mL Eppendorf Safe Lock Tubes™, and consisted of 50–100 μL of sample (wine or standards), 10 μL of 100 mg/L norvaline (internal standard, IS), 100 μL of dansyl chloride solution (derivatization agent) and 0.2 M Na2B4O7·10H2O (pH 9.3) solution up to a final volume of 1000 μL. The mixture was incubated for 30 min at 40 °C in an ultrasonic bath, and centrifuged at 12,000 rpm for 10 min with an Eppendorf® MiniSpin centrifuge (Eppendorf, Milan, Italy). The supernatant was recovered and diluted with MeOH (1:1, v/v) for HPLC-FLD analysis.

2.4. HPLC-FLD analysis
The HPLC determination of the AA and BA dansyl derivatives was performed with an HPLC-FLD Varian system ProStar (Varian Inc., Walnut Creek, CA) fitted with a pump module 230, an autosampler module 410, and a Jasco 821-FP fluorimetric detector (Jasco Europe, Cremella, LC, Italy) with wavelengths set at 293 nm (Ex) and 492 nm (Em). Separation was obtained with a Phenomenex Gemini C18 110A column (150 × 4.60 mm, 3 μm; Chemtek Analitica, Anzola Emilia, Bologna, Italy) thermostated at 25 °C, using pH 4.1 buffer acetate/CH3CN (solvent A; 6.25 mL CH3COOH, 1.97 g CH3COONa, 200 mL CH3CN, water up 1 L) and acetonitrile (solvent B) as mobile phases at constant flow rate of 0.8 mL/min. The gradient (v/v) started with 95% solvent A, decreasing to 80% in 18 min, to 50% in 42 min, to 0%

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

กรดอะมิโนอิสระ (AA) และ biogenic amines (BA) ได้ quantified เป็นครั้งแรกที่ Cannonau และ Vermentino ในไวน์ ไวน์ "ควบคุมกำหนดกำเนิด" แห่งสองจาก Sardinia (อิตาลี) วิธีการวิเคราะห์สำหรับการกำหนดเวลาของ AA และ BA ได้รับการพัฒนา ใช้ derivatization ใช้กับ dansyl คลอไรด์ตาม ด้วย HPLC มี fluorescence ตรวจ สามสิบสองสารมีระบุในไวน์ analysed ระดับสูงของ AA พบ มี proline ถูกที่สุดด้วยระดับเฉลี่ย±± 398 และ 1008 1244 281 mg/L ใน Cannonau และ Vermentino ไวน์ ตามลำดับ BA พบที่ความเข้มข้นเฉลี่ย < 10 mg/L ยกเว้น putrescine ซึ่งถึง 20.5 ± 10.2 mg/L ในไวน์ Cannonau ฮิสตามีนไม่เคยพบในไวน์ Vermentino ใด ๆ กรดγ-Aminobutyric, 4-hydroxyproline, glycine, leucine + isoleucine และ putrescine พิสูจน์ให้เป็นประโยชน์สำหรับขึ้นต้น Cannonau ไวน์จากไวน์ Vermentinoคำสำคัญไวน์ HPLC Fluorescence ตรวจ คลอไรด์ Dansyl กรดอะมิโน Biogenic amines การตรวจสอบ1. บทนำCannonau and Vermentino wines are the most popular wines of Sardinia, protected by the European Union “Controlled Designation of Origin” (E-Bacchus, 2007). They are obtained from red Cannonau and white Vermentino grape varieties. Although some physical–chemical characterisation studies have been reported, no quantitative analysis of free amino acids (AA) and biogenic amines (BA) content in these wines has been described. Free AA in wine have different origins (degradation of grape proteins, yeasts and lactic acid bacteria metabolism) and their content can be affected by grape variety, climate, viticulture practices and winemaking techniques, mainly maceration time, and yeast and lactic acid bacteria strains (Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, Donèche, & Lonvaud, 2006). The composition of the AA fraction is important since these compounds are indispensable for the nitrogen intake and have important biological effects (WHO/FAO/UNU, 2007). The most studied AA are the so-called essential AA (histidine, isoleucine, leucine, lysine, methionine, phenylalanine, threonine, tryptophan, and valine), but other AA have interesting properties. For instance, arginine acts as a precursor for the biosynthesis of nitric oxide (NO) and supports the immune response (Campbell et al., 2006). γ-Aminobutyric acid (GABA), a γ-amino acid derived from glutamic acid decarboxylation and not used in protein formation, regulates blood pressure, has a role in neurotransmission, and has diuretic and anti-stress effects (Diana, Tres, Quílez, Llombart, & Rafecas, 2014). AA are the precursors of BA, basic nitrogenous compounds synthesised in all living organism by metabolic pathways that usually involve AA decarboxylation (Kusano, Berberich, Tateda, & Takahashi, 2008). BA, such as putrescine and cadaverine, have been reported in grapes (Agudelo-Romero et al., 2013 and Vincenzini et al., 2009). Different agricultural practices, such as conventional, organic and biodynamic, and winemaking procedures can greatly affect the final amount of BA in wines (Tassoni et al., 2013, Yañez et al., 2012 and Yildirim et al., 2007) and during the fermentation processes from must to wine, microorganisms can produce histamine and tyramine (Beneduce et al., 2010 and Herbert et al., 2006). Thus, the presence of BA in wine can be a consequence of yeasts primary fermentation and bacteria malolactic fermentation metabolism (García-Marino, Trigueros, & Escribano-Bailón, 2010). BA in food and beverages are of toxicological interest because they can have direct or indirect effects on the human vascular and nervous systems. At high concentrations they may induce headaches, respiratory distress, heart palpitation, hyper- or hypotension. Recent studies have demonstrated that the interaction between ethanol (a monoamine oxidase inhibitor) and amines seems to be synergistic. This is important for wine consumers that are sensitive to such compounds (Ladero et al., 2010 and Smit et al., 2008). Due to these issues, some European countries have identified upper limits for histamine in wine varying from 2 to 10 mg/L, but most of them are waiting for the EU to provide a regulatory framework for biogenic amines. To this end, the European Food Safety Authority (EFSA) has released a document on risk assessment of BA in food (EFSA, 2011), confirming that histamine and tyramine are considered as most toxic and particularly relevant for food safety.แห่ง ระดับ AA และ BA ในไวน์ควรจะ analysed กัน ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญเพื่อให้สามารถศึกษา AA และ BA วิวัฒนาการระหว่างต้องหมัก เปรียบเทียบไวน์ได้ ด้วยวิธีแตกต่างกัน winemaking และ characterise monovarietal ไวน์ อย่างไรก็ตาม AA และ BA จะยากที่จะวิเคราะห์พร้อมกันเนื่องจากความหลากหลายของโครงสร้าง (โครงกระดูก aliphatic หอม และ ๔๒๓ ของกลุ่มที่มีแตกต่างกันคือ) Heterogeneity เช่นสารเคมี complicates แยก chromatographic และเป็นสิ่งที่ท้าทายเมื่อเลือกการตรวจที่เหมาะสมได้รับการเสนอวิธีการต่าง ๆ ที่ทำให้เกิด BA และ AA วิเคราะห์ วิธีการเหล่านี้ทั้งหมดใช้วิเคราะห์ HPLC และใช้ derivatizing ตัวแทนก่อน หรือ หลัง chromatographic แยก (Önal, Tekkeli, & Önal, 2013) Reagents derivatization ที่ใช้บ่อยที่สุดคือ o-phthalaldehyde (OPA) (Kutlán และ Molnár-ภาษาเพิร์ล 2003), 9-fluorenylmethyloxycarbonyl คลอไรด์ (FMOC-Cl) (Bauza et al., 2007 และ Molnár-ภาษาเพิร์ล 2011), dansyl คลอไรด์ (DCl) (Mazzucco et al., 2010 และ Pineda et al., 2012), คลอไรด์ dabsyl (Krause, Bockhardt, Neckermann, Henle, & Klostermeyer, 1995), diethyl ethoxymethylenemalonate (DEEMM) (Cejudo Bastante et al., 2010 วัง et al., 2014 และ Gómez Alonso et al., 2007) , p-N, N, N trimethylammonioanilyl N′-hydroxysuccinimidyl carbamate ไอโอไดด์ (TAHS), และ 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl N-ตรี (pyrrolidino) phosphoranylideneamino carbamate (FOSF) (Rebane, Oldekop, & Herodes, 2012) เครื่องตรวจจับ fluorescence และตรวจจับ UV – VIS หมู่ที่สุดอย่างกว้างขวางใช้ พร้อมกับการใช้เป็นครั้งคราวของ MS จับ fluorescence มีความไวสูงกว่าตรวจจับ UV – Vis และถูกมาก คลอไรด์ Dansyl เป็นหนึ่งของ reagents derivatization ที่ใช้กันอย่างแพร่หลายเนื่องจากความสามารถในการสร้างสารตกค้าง ด้วยหลัก และรอง amines (เจีย โกงกาง พาร์ค ลี และ Kwon, 2011) ซึ่งเป็นสิ่งสำคัญเนื่องจากบาง reagents derivatization เช่น OPA ไม่ทำปฏิกิริยากับ proline (Molnár-ภาษาเพิร์ล 2011), ซึ่งเป็น AA ชุกชุมมากที่สุดในไวน์ ในขณะที่ DEEMM จะไม่เสถียร (Rebane et al., 2012)มุมมองสถานการณ์ในปัจจุบัน มีจุดมุ่งหมายของงานนี้ (i) เพื่อ ปรับปรุงวิธีการวิเคราะห์ HPLC FLD ให้พร้อมวิเคราะห์กรดอะมิโน 22, 13 biogenic amines และแอมโมเนีย ไอออน, (ii) เพื่อตรวจสอบวิธีการนี้ในไวน์ และ (iii) เพื่อใช้วัดปริมาณ AA และ BA ใน Cannonau และ Vermentino ไวน์2. วัสดุและวิธีการ2.1. เคมีและ reagentsสารเคมีที่ใช้ในการศึกษานี้ได้วิเคราะห์เกรด อะซิโตน acetonitrile เมทานอล กรดอะซิติก กรดไฮโดรคลอริก (37%, w/w), Na2B4O7·10H2O, CH3COONa และ dansyl คลอไรด์ซื้อได้จากซิก-Aldrich (มิลาน อิตาลี) มาตรฐานอ้างอิงหลักของ AA และ BA (บริสุทธิ์ > 99.9%) ได้รับมาจากซิกมา-Aldrich เมอร์ค และ Carlo Erba (มิลาน อิตาลี) AA และ BA โซลูชั่นมาตรฐานที่ตลาดหลักทรัพย์ (ca. 1000 mg/L) ถูกเตรียม โดยเจือจางด้วย 0.1 M HCl/ทา นอ (1:1, v/v) และเก็บไว้ที่ 4 ± 1 ° C จนใช้ โซลูชันแทน derivatization ได้เตรียมยุบ 50 มก. dansyl คลอไรด์ (DCl) ใน 10 mL ของอะซิโตน และถูกเก็บไว้ที่ 4 ± 1 ° C จนใช้ (แก้ปัญหาเป็นมีเสถียรภาพ 3 เดือน) น้ำ ultrapure (18.0 MΩ cm, 25 ° C) ถูกรับ ด้วยเครื่องระบบ A10 ประโยชน์ Q (มาก มิลาน อิตาลี)2.2. ตัวอย่างไวน์ตัวอย่างไวน์ 8 "Cannonau di Sardegna DOC" และตัวอย่างไวน์ที่เจ็ดของ "Vermentino di Sardegna DOC" ผลิตจากการเก็บเกี่ยว 2012 ใน Sardinia (อิตาลี) ที่ analysed ตัวอย่างไวน์ที่ใช้ได้ในเชิงพาณิชย์โดยตรงโดยแสวงเก้าแตกต่างกับจุดกำเนิดที่ได้รับการรับรอง และทำโดยใช้กระบวนการ oenological มาตรฐานได้ แสวงห้ามาอย่างหนึ่งของทั้ง Cannonau และ Vermentino ไวน์ ไวน์หนึ่งให้มาทดสอบไวน์ Vermentino รับกับองุ่นที่เก็บเกี่ยวในพื้นที่ต่าง ๆ และที่คุ้มสามมีพรสวรรค์อย่างหนึ่งของแต่ละไวน์ Cannonau เหล่านี้คุ้มกันบัญชีสำหรับ 90% ของการผลิตไวน์ Cannonau และ Vermentino ใน Sardinia2.3. กรดอะมิโนและ biogenic amines derivatizationเรื่องของ AA และ BA ได้ดำเนินหลังจาก derivatization กับ DCl ผสมปฏิกิริยาถูกเตรียมใน™ Eppendorf เซฟล็อคท่อ 1.5 mL และประกอบด้วย 50-100 μL ของตัวอย่าง (ไวน์หรือมาตรฐาน), μL 10 ของ norvaline 100 mg/L (ภายในมาตรฐาน IS), μL 100 dansyl คลอไรด์ solution (แทน derivatization) และ 0.2 M Na2B4O7·10H2O โซลูชั่น (pH 9.3) ได้ปริมาตรสุดท้ายของ 1000 μL ส่วนผสมคือ incubated ใน 30 นาทีที่ 40 ° C ในการอัลตราโซนิก และ centrifuged ที่ 12000 รอบต่อนาทีใน 10 นาที ด้วยเครื่องหมุนเหวี่ยง Eppendorf ® MiniSpin การ (Eppendorf มิลาน อิตาลี) Supernatant ถูกกู้คืน และผสมกับทานอ (1:1, v/v) สำหรับวิเคราะห์ HPLC FLD2.4 การการวิเคราะห์ HPLC FLDกำหนดการ HPLC อนุพันธ์ dansyl AA และ BA ทำ ด้วยแล้วแต่กำหนดเป็น HPLC FLD ระบบ ProStar (แล้วแต่กำหนด Inc. วอลนัตครีก CA) ติดตั้งโมดูลปั๊ม 230 โมดู autosampler 410 และ Jasco จับ fluorimetric 821-FP (Jasco ยุโรป Cremella, LC อิตาลี) กับความยาวคลื่นที่ตั้ง 293 nm (อดีต) และ 492 nm (Em) แยกไม่ได้กับคอลัมน์ C18 เมถุน Phenomenex 110A (150 × 4.60 mm, μm 3 Chemtek Analitica เอมิ เลีย Anzola โลน่า อิตาลี) thermostated ที่ 25 ° C ใช้ค่า pH 4.1 บัฟเฟอร์ acetate/CH3CN (ตัวทำละลาย A; mL 6.25 อะเซติก 1.97 g CH3COONa, CH3CN, 200 mL น้ำค่า 1 L) และ (ตัวทำละลาย B) acetonitrile เป็นระยะเคลื่อนที่อัตราการไหลคงที่ของ 0.8 mL/min ไล่ระดับสี (v/v) เริ่มต้น ด้วยตัวทำละลาย 95% A ลด 80% ใน 18 นาที 50% ในนาทีที่ 42, % 0

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

กรดอะมิโนฟรี (AA) และไบโอจีเอมีน (BA) ได้รับการวัดเป็นครั้งแรกในไวน์ Cannonau และ Vermentino ทั้งสองที่นิยมมากที่สุด "ควบคุมการกำหนดแหล่งกำเนิดสินค้า" ไวน์จากเกาะซาร์ดิเนีย (อิตาลี) วิธีการวิเคราะห์สำหรับความมุ่งมั่นพร้อมกันของ AA และบริติชแอร์เวย์ได้รับการพัฒนาโดยใช้อนุพันธ์เลือกที่มีคลอไรด์ dansyl ตามด้วย HPLC มีการตรวจสอบการเรืองแสง สารประกอบสามสิบสองถูกระบุในไวน์วิเคราะห์ ระดับสูงของเอเอพบกับโพรลีนเป็นมากที่สุดที่มีระดับเฉลี่ย 1,244 ± 398 และ 1,008 ± 281 มิลลิกรัม / ลิตรไวน์ Cannonau และ Vermentino ตามลำดับ บริติชแอร์เวย์ได้รับการตรวจพบที่ระดับความเข้มข้นเฉลี่ย <10 มิลลิกรัม / ลิตรยกเว้น putrescine ถึง 20.5 ± 10.2 มิลลิกรัม / ลิตรไวน์ Cannonau ฮีสตามีไม่เคยตรวจพบในไวน์ Vermentino กรดγ-aminobutyric 4 hydroxyproline, glycine, leucine isoleucine + putrescine และพิสูจน์ให้เห็นว่าจะเป็นประโยชน์สำหรับความแตกต่างของไวน์จากไวน์ Cannonau Vermentino. คำไวน์; HPLC; การตรวจสอบการเรืองแสง; คลอไรด์ Dansyl; กรดอะมิโน; เอมีน biogenic; การตรวจสอบ1 บทนำCannonau และไวน์ Vermentino เป็นไวน์ที่นิยมมากที่สุดของเกาะซาร์ดิเนียป้องกันโดยสหภาพยุโรป "ควบคุมการกำหนดแหล่งกำเนิด" (E-เหล้า 2007) พวกเขาจะได้รับจาก Cannonau สีแดงและ Vermentino พันธุ์องุ่นขาว ถึงแม้ว่าการศึกษาลักษณะทางกายภาพบางสารเคมีที่ได้รับรายงานไม่มีการวิเคราะห์เชิงปริมาณของกรดอะมิโนอิสระ (AA) และไบโอจีเอมีน (BA) เนื้อหาในไวน์เหล่านี้ได้รับการอธิบาย ฟรี AA ในไวน์ที่มีต้นกำเนิดที่แตกต่างกัน (การย่อยสลายของโปรตีนองุ่น, ยีสต์และแบคทีเรียกรดแลคติกการเผาผลาญ) และเนื้อหาของพวกเขาสามารถได้รับผลกระทบจากความหลากหลายองุ่นสภาพภูมิอากาศ, การปฏิบัติและเทคนิคการปลูกองุ่นผลิตไวน์ส่วนใหญ่เวลายุ่ยและยีสต์และสายพันธุ์แบคทีเรียกรดแลคติก ( Ribéreau-Gayon, Dubourdieu, Donècheและ Lonvaud 2006) องค์ประกอบของส่วน AA เป็นสิ่งสำคัญเนื่องจากสารเหล่านี้มีความจำเป็นสำหรับการบริโภคของไนโตรเจนและมีผลกระทบทางชีวภาพที่สำคัญ (WHO / FAO / UNU 2007) AA ศึกษามากที่สุดคือสิ่งที่เรียกว่าจำเป็น AA (ฮิสติดีน, ไอโซลิวซีน, leucine, ไลซีน, methionine, phenylalanine, ธ รีโอนี, โพรไบโอและวาลีน) แต่ AA อื่น ๆ ที่มีคุณสมบัติที่น่าสนใจ ยกตัวอย่างเช่นการกระทำอาร์จินีเป็นสารตั้งต้นในการสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ (NO) และสนับสนุนการตอบสนองของภูมิคุ้มกัน (แคมป์เบล et al., 2006) กรดγ-aminobutyric (GABA) ซึ่งเป็นกรดอะมิโนγมาจาก decarboxylation กรดกลูตามิและไม่ได้ใช้ในการสร้างโปรตีนที่ควบคุมความดันโลหิตมีบทบาทในการ neurotransmission และมียาขับปัสสาวะและผลกระทบที่ต่อต้านความเครียด (ไดอาน่า Tres, Quílez, Llombart และ Rafecas 2014) เอเอเป็นสารตั้งต้นของบริติชแอร์เวย์, สารประกอบไนโตรเจนพื้นฐานสังเคราะห์ในสิ่งมีชีวิตที่อาศัยอยู่โดยเผาผลาญเซลล์ที่มักจะเกี่ยวข้องกับการ decarboxylation AA (Kusano, Berberich, Tateda และทากาฮาชิ, 2008) บริติชแอร์เวย์เช่น putrescine cadaverine และได้รับการรายงานในองุ่น (Agudelo-โรเมโร et al., 2013 และ Vincenzini et al., 2009) การปฏิบัติทางการเกษตรที่แตกต่างกันเช่นเดิมอินทรีย์และ biodynamic และขั้นตอนการผลิตไวน์มากสามารถส่งผลกระทบต่อจำนวนเงินสุดท้ายของปริญญาตรีในไวน์ (Tassoni et al., 2013, Yañez et al., 2012 และ Yildirim et al., 2007) และในช่วง กระบวนการหมักจากไวน์ต้องจุลินทรีย์สามารถผลิตและฮีสตามี tyramine (Beneduce et al., 2010 และเฮอร์เบิร์ et al., 2006) ดังนั้นการปรากฏตัวของบริติชแอร์เวย์ในไวน์อาจจะเป็นผลมาจากการหมักยีสต์และแบคทีเรียหลักการเผาผลาญอาหารหมัก malolactic (การ์เซียมารีโน, Trigueros และ Escribano-Bailon 2010) บริติชแอร์เวย์ในอาหารและเครื่องดื่มที่เป็นที่สนใจของทางพิษวิทยาเพราะพวกเขาสามารถมีผลกระทบโดยตรงหรือโดยอ้อมในหลอดเลือดของมนุษย์และระบบประสาท ที่ความเข้มข้นสูงที่พวกเขาอาจทำให้เกิดอาการปวดศีรษะหายใจลำบากใจสั่นหัวใจ hyper- หรือความดันเลือดต่ำ การศึกษาล่าสุดได้แสดงให้เห็นว่าทำงานร่วมกันระหว่างเอทานอล (monoamine oxidase ยับยั้ง) และเอมีนดูเหมือนว่าจะทำงานร่วมกัน นี้เป็นสิ่งสำคัญสำหรับผู้บริโภคไวน์ที่มีความไวต่อสารดังกล่าว (Ladero et al., 2010 และ Smit et al., 2008) เนื่องจากปัญหาเหล่านี้บางประเทศในยุโรปได้ระบุข้อ จำกัด ที่แตกต่างกันบนสำหรับฮีสตามีในไวน์ 2-10 มิลลิกรัม / ลิตร แต่ส่วนใหญ่ของพวกเขาจะรอให้สหภาพยุโรปที่จะให้กรอบการกำกับดูแลสำหรับไบโอจีเอมีน ด้วยเหตุนี้การความปลอดภัยด้านอาหารยุโรป (EFSA) ได้ออกเอกสารเกี่ยวกับการประเมินความเสี่ยงของบีเอในอาหาร (EFSA 2011) ยืนยันว่าฮีสตามี tyramine และจะถือว่าเป็นพิษมากที่สุดและมีความเกี่ยวข้องโดยเฉพาะอย่างยิ่งสำหรับความปลอดภัยของอาหาร. จะเป็นการดีที่ระดับ ของ AA และปริญญาตรีในไวน์ควรจะวิเคราะห์ไปพร้อม ๆ กัน นี้เป็นสิ่งสำคัญที่จะสามารถที่จะศึกษา AA และวิวัฒนาการของบริติชแอร์เวย์ระหว่างการหมักต้องเพื่อเปรียบเทียบไวน์ได้ด้วยวิธีการที่แตกต่างกันและการผลิตไวน์ที่จะอธิบายลักษณะไวน์ monovarietal อย่างไรก็ตาม AA และบริติชแอร์เวย์เป็นเรื่องยากที่จะวิเคราะห์ไปพร้อม ๆ กันเพราะความหลากหลายของโครงสร้างของพวกเขา (aliphatic โครงกระดูกหอมและ heterocyclic การปรากฏตัวของกลุ่มที่มีเภสัชจลนศาสตร์แตกต่างกัน) ความแตกต่างทางเคมีดังกล่าวมีความซับซ้อนการแยกสารและเป็นความท้าทายในการเลือกเครื่องตรวจจับที่เหมาะสม. หลายวิธีที่ช่วยให้พร้อมกันบริติชแอร์เวย์และการวิเคราะห์ AA ได้รับการเสนอ ทุกวิธีการเหล่านี้ใช้การวิเคราะห์ HPLC และต้อง derivatizing ตัวแทนก่อนหรือหลังการแยกสาร (onal, Tekkeli และ onal 2013) ที่ใช้บ่อยที่สุดน้ำยาอนุพันธ์มี o-phthalaldehyde (OPA) (KutlánและMolnár-Perl, 2003), 9 fluorenylmethyloxycarbonyl คลอไรด์ (Cl-FMOC) (Bauza et al., 2007 และMolnár Perl-2011) คลอไรด์ dansyl ( DCL) (Mazzucco et al., 2010 และ Pineda et al., 2012) คลอไรด์ dabsyl (กรอส Bockhardt, Neckermann, Henle และ Klostermeyer, 1995) diethyl ethoxymethylenemalonate (DEEMM) (Cejudo-Bastante et al., 2010 อลอนโซ่Gómez-et al., 2007 และวัง et al., 2014), PN, N, N-trimethylammonioanilyl N'-hydroxysuccinimidyl ไอโอไดด์คาร์บาเมท (TAHS) และ 2,5-dioxopyrrolidin-1-YL N-ไตร (pyrrolidino) คาร์บาเม phosphoranylideneamino (FOSF) (Rebane, Oldekop และ Herodes 2012) ในบรรดาเครื่องตรวจจับการเรืองแสง, และการตรวจสอบ UV-VIS มีการใช้กันอย่างแพร่หลายพร้อมกับการใช้งานเป็นครั้งคราวของ MS เครื่องตรวจจับแสงที่มีความไวสูงกว่าการตรวจสอบ UV-Vis และเลือกมาก Dansyl คลอไรด์เป็นหนึ่งในที่สุดที่ใช้กันอย่างแพร่หลายสารอนุพันธ์เพราะความสามารถที่จะสร้างสารที่มั่นคงกับเอมีนประถมศึกษาและมัธยมศึกษา (เจี๋ยคังพาร์ค, ลีเทควันโดและ 2011) นี้เป็นสิ่งสำคัญเนื่องจากบางน้ำยาอนุพันธ์เช่น OPA ไม่ทำปฏิกิริยากับโพรลีน (Molnár Perl-2011) ซึ่งเป็น AA ที่มีมากที่สุดในไวน์ในขณะที่สามารถ DEEMM ไม่เสถียร (Rebane et al., 2012). ในมุมมองของปัจจุบัน สถานการณ์จุดมุ่งหมายของงานนี้คือ (i) ในการปรับปรุง HPLC-FLD วิธีการวิเคราะห์ไปพร้อม ๆ กันวิเคราะห์ 22 กรดอะมิโน 13 ไบโอจีเอมีนและแอมโมเนียมไอออน (ii) การตรวจสอบวิธีการในไวน์นี้และ (iii) การ นำไปใช้กับปริมาณเอเอฟรีและปริญญาตรีในไวน์ Cannonau และ Vermentino. 2 วัสดุและวิธีการ2.1 สารเคมีและสารเคมีสารเคมีทั้งหมดที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้มีเกรดการวิเคราะห์ อะซีโตน acetonitrile, เมทานอล, กรดอะซิติกกรดไฮโดรคลอริก (37% w, w /) Na2B4O7 · 10H2O, CH3COONa และคลอไรด์ dansyl ซื้อจาก Sigma-Aldrich (มิลาน, อิตาลี) มาตรฐานอ้างอิงหลักของ AA และปริญญาตรี (ความบริสุทธิ์> 99.9%) ที่ได้รับจาก Sigma-Aldrich เมอร์คและคาร์โลเออร์บา (มิลาน, อิตาลี) AA และสต็อก BA โซลูชั่นมาตรฐาน (แคลิฟอร์เนีย 1000 mg / L) ได้รับการจัดทำขึ้นโดยการลดสัดส่วน 0.1 M HCl / เมธานอล (1: 1, v / v) และเก็บไว้ที่ 4 ± 1 ° C จนถึงการใช้งาน วิธีการแก้ปัญหาตัวแทนอนุพันธ์ได้จัดทำละลาย 50 มิลลิกรัม dansyl คลอไรด์ (DCL) ใน 10 มลอะซีโตนและถูกเก็บไว้ที่ 4 ± 1 ° C จนถึงการใช้งาน (สารละลายที่มีเสถียรภาพได้นานถึง 3 เดือน) น้ำบริสุทธิ์ (18.0 ซมMΩ 25 ° C) ที่ได้รับกับ Milli-Q Advantage อุปกรณ์ระบบ A10 (ค, มิลาน, อิตาลี). 2.2 ตัวอย่างไวน์แปดตัวอย่างไวน์ของ "Cannonau di Sardegna DOC" เจ็ดตัวอย่างไวน์ของ "Vermentino di Sardegna DOC" ผลิตในซาร์ดิเนีย (อิตาลี) จากการเก็บเกี่ยว 2012 ถูกนำมาวิเคราะห์ กลุ่มตัวอย่างเป็นไวน์ที่มีจำหน่ายในท้องตลาดส่งตรงจากแหล่งผลิตไวน์ที่เก้าที่แตกต่างกับต้นกำเนิดได้รับการรับรองและใช้วิธีการ oenological มาตรฐาน ห้าแหล่งผลิตไวน์ที่จัดทำตัวอย่างหนึ่งของไวน์ทั้ง Cannonau และ Vermentino หนึ่งโรงกลั่นเหล้าองุ่นที่ให้มาทั้งสองตัวอย่างของไวน์ Vermentino รับกับองุ่นที่เก็บเกี่ยวในพื้นที่ที่แตกต่างกันและอื่น ๆ สามแหล่งผลิตไวน์ที่มีพรสวรรค์ตัวอย่างหนึ่งของไวน์แต่ละ Cannonau โรงบ่มไวน์เหล่านี้ร่วมกันคิดเป็นสัดส่วน 90% ของการผลิตของ Cannonau และไวน์ Vermentino ในซาร์ดิเนีย. 2.3 กรดอะมิโนเอมีนและไบโอจี derivatization การกำหนด AA และบริติชแอร์เวย์ได้รับการดำเนินการหลังจากที่มีอนุพันธ์ DCL ผสมปฏิกิริยาถูกจัดทำขึ้นใน 1.5 ml Eppendorf ปลอดภัยล็อคท่อ™และประกอบด้วย 50-100 ไมโครลิตรของกลุ่มตัวอย่าง (ไวน์หรือมาตรฐาน) 10 ไมโครลิตร 100 มิลลิกรัม / ลิตร Norvaline (มาตรฐานภายใน IS) 100 ไมโครลิตรของการแก้ปัญหา dansyl คลอไรด์ (ตัวแทนอนุพันธ์) และ 0.2 M Na2B4O7 · 10H2O (pH 9.3) การแก้ปัญหาถึงเล่มสุดท้าย 1000 ไมโครลิตร ส่วนผสมที่ถูกบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 40 ° C ในอ่างอัลตราโซนิกและหมุนเหวี่ยงที่ 12,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 10 นาทีกับการหมุนเหวี่ยงEppendorf® MiniSpin (Eppendorf, มิลาน, อิตาลี) ใสหายและเจือจางด้วยเมธานอล (1: 1, v / v). สำหรับการวิเคราะห์ HPLC-FLD 2.4 การวิเคราะห์ HPLC-FLD ความมุ่งมั่นของ HPLC AA และปริญญาตรีอนุพันธ์ dansyl ได้ดำเนินการกับระบบ HPLC-FLD Varian ProStar (Varian อิงค์ Walnut Creek, CA) ติดตั้งโมดูลปั๊ม 230, โมดูลฉีดตัวอย่างอัตโนมัติ 410 และ 821 Jasco -FP ตรวจจับ fluorimetric (Jasco ยุโรป Cremella, LC, อิตาลี) ที่มีความยาวคลื่นที่ตั้งไว้ที่ 293 นาโนเมตร (อดีต) และ 492 นาโนเมตร (เอ็ม) แยกได้กับคอลัมน์ Phenomenex ราศีเมถุน C18 110A (150 × 4.60 มม 3 ไมครอน; Chemtek Analitica, Anzola Emilia, โบโลญญา, อิตาลี) thermostated ที่ 25 ° C โดยใช้อะซิเตตบัฟเฟอร์ค่า pH 4.1 / CH3CN (ตัวทำละลาย; 6.25 มิลลิลิตร CH3COOH, 1.97 กรัม CH3COONa 200 มิลลิลิตร CH3CN น้ำเพิ่มขึ้น 1 ลิตร) และ acetonitrile (ตัวทำละลาย B) เป็นขั้นตอนที่มือถือในอัตราการไหลคงที่ 0.8 มิลลิลิตร / นาที การไล่ระดับสี (v / v) เริ่มต้นด้วยตัวทำละลาย 95% ลดลงถึง 80% ใน 18 นาที, 50% ใน 42 นาที 0%

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

กรดอะมิโนอิสระ ( AA ) และเอมีน ( BA ) วัดครั้งแรกในคันโนนาอูแวร์เมนติโน่และไวน์ สองที่เป็นที่นิยมมากที่สุด " การควบคุมของประเทศ " ไวน์จากอิตาลี ( อิตาลี ) วิธีการเชิงวิเคราะห์สำหรับการกำหนดพร้อมกันของ AA และบาถูกพัฒนาใช้กับงานที่มี dansyl คลอไรด์ตามด้วย HPLC ที่มีการตรวจจับการเกิดฟลูออเรสเซนซ์สามสิบสองสารประกอบพบในไวน์ มาวิเคราะห์ ระดับ AA พบว่ามีปริมาณโพรลีนถูกมากที่สุดอุดมสมบูรณ์ด้วยเฉลี่ยระดับ 1244 ±แล้วยัง± 0 มก. / ล. ในคันโนนาอู และไวน์ แวร์เมนติโน่ ตามลำดับ BA ตรวจพบความเข้มข้นเฉลี่ยน้อยกว่า 10 มก. / ล. ยกเว้น putrescine ซึ่งถึง 20.5 ± 10.2 มิลลิกรัมต่อลิตรในไวน์คันโนนาอู .มีนเคยตรวจพบในแวร์เมนติโน่ไวน์ γอะมิโนบูทิริก กรด 4-hydroxyproline ไกลซีนและลิวซีนไอโซลิวซีน , putrescine พิสูจน์แล้วว่าเป็นประโยชน์สำหรับทั้งคันโนนาอู ไวน์จากไวน์แวร์เมนติโน่

คำสำคัญ
ไวน์ ; 4 ; การตรวจหาสาร ; dansyl คลอไรด์ ; กรดอะมิโน ; เอมีน ; การตรวจสอบ
1 บทนำ
คันโนนาอู และ แวร์เมนติโน่ไวน์เป็นไวน์ที่นิยมมากที่สุดของอิตาลี ได้รับการคุ้มครองโดยสหภาพยุโรป " ควบคุมตำแหน่งของแหล่งกำเนิด " ( e-bacchus , 2007 ) พวกเขาได้รับจากคันโนนาอูแดง และพันธุ์องุ่นแวร์เมนติโน่สีขาว แม้ว่าบางทางกายภาพและทางเคมีการศึกษาได้รับรายงานไม่มีการวิเคราะห์เชิงปริมาณของกรดอะมิโนฟรี ( AA ) และเอมีน ( BA ) เนื้อหาในไวน์เหล่านี้ได้รับการอธิบาย ฟรี AA ในไวน์มีต้นกำเนิดที่แตกต่างกัน ( การย่อยสลายองุ่นโปรตีน ยีสต์ และแบคทีเรียกรดแลคติกที่การเผาผลาญ ) และเนื้อหาของพวกเขาจะได้รับผลกระทบจากหลากหลายบรรยากาศองุ่น , การปลูกองุ่นทำไวน์เทคนิคการปฏิบัติและระยะเวลา , เวลาส่วนใหญ่ ,ยีสต์และแบคทีเรียกรดแลคติกสายพันธุ์ ( ซี่โครง ) reau กาย่น dubourdieu , ไม่ . เช & lonvaud , 2006 ) องค์ประกอบของส่วน AA เป็นสิ่งสำคัญเนื่องจากสารประกอบเหล่านี้จะขาดไม่ได้สำหรับไนโตรเจนปริมาณและผลกระทบทางชีวภาพที่สำคัญ ( WHO / FAO / ที่ผิดปกติ , 2007 ) ที่สุดเรียน AA จะเรียกว่าเป็น AA ( อกแตก , isoleucine , ลิวซีน , ไลซีน , ฟีนิลอะลานีน , เมทไธโอนีน ,ถ่ายทอดวิชา ทริปโตเฟนและวาลีน ) แต่อื่น ๆ AA มี คุณสมบัติที่น่าสนใจ เช่น อาร์จินีนทำหน้าที่เป็นสารตั้งต้นในการสังเคราะห์ไนตริกออกไซด์ ( NO ) และสนับสนุนการตอบสนองภูมิคุ้มกัน ( Campbell et al . , 2006 ) γอะมิโนบูทิริกแอซิด ( GABA ) , γ - กรดอะมิโนที่ได้จากเงือกกรดกลูตามิค และไม่ได้ใช้ในการสร้างโปรตีน ควบคุมความดันโลหิตมีบทบาทมากในนิวโรทราน ิสชั่น และขับปัสสาวะ และผลต่อต้านความเครียด ( ไดอาน่า เทร คูเมือง lez , llombart & , rafecas 2014 ) AA เป็นสารตั้งต้นของ BA , สารประกอบไนโตรเจนสังเคราะห์พื้นฐานในสิ่งมีชีวิต โดยเส้นทางการเผาผลาญอาหารที่มักจะเกี่ยวข้องกับ AA เงือก ( คุซาโนะ tateda เบอร์เบอริก , , , &ทาคาฮาชิ , 2008 ) บา เช่นคาดาเวอรีนและ putrescine ,มีรายงานในองุ่น ( agudelo Romero et al . , 2013 และ vincenzini et al . , 2009 ) การปฏิบัติทางการเกษตรที่แตกต่างกันเช่นเดิม อินทรีย์ และ biodynamic และ winemaking ขั้นตอนอย่างมากสามารถส่งผลกระทบต่อจำนวนเงินสุดท้ายของ BA ในไวน์ ( tassoni et al . , 2013 , ยา 15 EZ et al . , 2012 และม et al . , 2007 ) และในระหว่างกระบวนการหมักจากต้องไวน์จุลินทรีย์สามารถผลิต histamine และไธรามีน ( beneduce et al . , 2010 และเฮอร์เบิร์ต et al . , 2006 ) ดังนั้นการปรากฏตัวของ BA ในไวน์สามารถผลของยีสต์และแบคทีเรียหมักการเมแทบอลิซึม malolactic ( garc í a-marino trigueros & , , escribano ประกันตัวเลออง , 2010 )ปริญญาตรีด้านอาหารและเครื่องดื่มมีความสนใจผลิตเพราะพวกเขาสามารถ มี ผล โดยตรงหรือโดยอ้อมในระบบของหลอดเลือดและประสาท ที่ความเข้มข้นสูงอาจทำให้ปวดหัว ใจสั่น หายใจลำบาก หัวใจ ไฮเปอร์ หรือ โรคนี้ การศึกษาล่าสุดแสดงให้เห็นว่าปฏิสัมพันธ์ระหว่างเอทานอล ( monoamine oxidase inhibitor ) และเอมีน ดูเหมือนจะเกิดขึ้น .นี้เป็นสิ่งสำคัญสำหรับไวน์ผู้บริโภคที่มีความอ่อนไหวต่อสารดังกล่าว ( ladero et al . , 2010 และ SMIT et al . , 2008 ) เนื่องจากปัญหาเหล่านี้ บางประเทศในยุโรปมีการระบุข้อจำกัดด้านบนสำหรับ histamine ในไวน์ที่แตกต่างจาก 2 ถึง 10 มิลลิกรัมต่อลิตร แต่ส่วนใหญ่ของพวกเขากำลังรอสำหรับสหภาพยุโรปเพื่อให้กรอบกฎระเบียบสำหรับเอมีน . จบเรื่องนี้ความปลอดภัยอาหารยุโรป Authority ( efsa ) ได้ออกเอกสารในการประเมินความเสี่ยงของ BA ในอาหาร ( efsa , 2011 ) , ยืนยันว่า histamine และไธรามีนถือว่าเป็นพิษมากที่สุด และโดยเฉพาะอย่างยิ่งที่เกี่ยวข้องกับความปลอดภัยของอาหาร

ดีระดับ AA และ BA ในไวน์ควรจะวิเคราะห์ได้พร้อมกัน นี้เป็นสิ่งสำคัญที่จะสามารถการศึกษาวิวัฒนาการและ BA ในต้องหมักเปรียบเทียบได้กับขั้นตอนการทำไวน์ไวน์ไวน์ที่แตกต่างกัน และนักศึกษา monovarietal . อย่างไรก็ตาม , AA และ BA จะยากที่จะวิเคราะห์พร้อมกันเนื่องจากความหลากหลายของโครงสร้างของพวกเขา ( แอลิหอมและเฮเทอโรไซคลิกโครงกระดูกตนของกลุ่มที่มี PK )สารเคมีดังกล่าวมีความซับซ้อนและสามารถแยกและความท้าทายเมื่อเลือกเครื่องที่เหมาะสม

หลายวิธี ที่ช่วยให้ บา พร้อมกันและการวิเคราะห์ AA ได้รับการเสนอ ทั้งหมดนี้ใช้วิธีการวิเคราะห์ HPLC และต้อง derivatizing ตัวแทนก่อนหรือหลังจากดิ้นรน ( Öเนล tekkeli &Öนาล , 2013 )ส่วนใหญ่มักใช้กับสารเคมีจะ o-phthalaldehyde ( OPA ) ( kutl n . kgm & moln . kgm r-perl , 2003 ) , 9-fluorenylmethyloxycarbonyl คลอไรด์ ( fmoc CL ) ( bauza et al . , 2007 และ moln . kgm r-perl , 2011 ) , dansyl คลอไรด์ ( 3 . ) ( mazzucco et al . , 2010 และ Pineda et al . , 2012 ) dabsyl , คลอไรด์ ( กรอส bockhardt neckermann เฮนเนิล , , , , & klostermeyer , 1995 )ได ethoxymethylenemalonate ( deemm ) ( cejudo bastante et al . , 2010 , G óแมสอลอนโซ่ et al . , 2007 และ Wang et al . , 2010 ) , p-n , N , N - n-trimethylammonioanilyl นั้น hydroxysuccinimidyl เมตไอโอไดด์ ( tahs ) และ 2,5-dioxopyrrolidin-1-yl n-tri ( pyrrolidino ) phosphoranylideneamino เมต ( fosf ) ( rebane oldekop & , , herodes , 2012 ) ของเครื่องตรวจจับการตรวจหาและ UV –ซึ่งมีใช้กันอย่างแพร่หลาย พร้อมกับใช้เป็นครั้งคราวของนางสาวเรืองแสงเครื่องมีความไวสูงกว่า UV –ซึ่งตรวจจับและมีมากที่เลือก dansyl คลอไรด์เป็นหนึ่งในที่สุดที่ใช้กันอย่างแพร่หลายกับสารเคมี เพราะความสามารถในการสร้างสารประกอบคงตัวกับเอมีนปฐมภูมิและทุติยภูมิ ( เจีย คัง ปาร์ค ลี &ควอน , 2011 )นี้เป็นสิ่งสำคัญเนื่องจากบางเพื่อกับชอบโอปาไม่ตอบสนองกับปริมาณโพรลีน ( moln . kgm r-perl 2011 ) ซึ่งมีมากที่สุดมากมาย AA ในไวน์ ในขณะที่ deemm สามารถสั่นคลอน ( rebane et al . , 2012 ) .

ในมุมมองของสถานการณ์ปัจจุบัน จุดมุ่งหมายของงานนี้คือ ( 2 ) การปรับปรุงวิธีวิเคราะห์เพื่อศึกษา hplc-fld พร้อมกัน 22 กรดอะมิโน , 13 เอมีน และแอมโมเนียมไอออน( 2 ) ตรวจสอบวิธีการนี้ในไวน์และ ( 3 ) เพื่อใช้กับปริมาณฟรี AA และ BA ในคันโนนาอูและไวน์แวร์เมนติโน่

2 วัสดุและวิธีการ
2.1 . เคมีและสารเคมี
ทั้งหมดสารเคมีที่ใช้ในการศึกษาครั้งนี้คือ การวิเคราะห์ในระดับ อะซิโตนไนเมทานอลกรดอะซิติก กรดไฮโดรคลอริค ( 37 % w / w ) na2b4o7 ch3coona , ด้วย , ,dansyl คลอไรด์และซื้อมาจาก Sigma –ดิช ( มิลาน , อิตาลี ) การอ้างอิงมาตรฐานของ AA และ BA ( ความบริสุทธิ์ > 99.9% ) ที่ได้รับจาก ซิกม่า – อัลดริช เมอร์คคาร์โลและมา ( มิลาน , อิตาลี ) AA และ บาโซลูชั่นสินค้ามาตรฐาน ( ประมาณ 1 , 000 มก. / ล. ) เตรียมได้โดยการเจือจางด้วย 0.1 M HCl / เมทิลแอลกอฮอล์ ( 1 : 1 v / v ) และเก็บรักษาที่อุณหภูมิ 4 ± 1 ° C จนใช้ตัวแทนกับสารละลายที่เตรียมละลาย 50 มิลลิกรัม dansyl คลอไรด์ ( 3 . ) 10 ml ของอะซีโตน และถูกเก็บไว้ที่ 4 ± 1 ° C ( จนกว่าจะใช้โซลูชั่นมีเสถียรภาพถึง 3 เดือน ) น้ำบริสุทธิ์มาก ( 18.0 เมตรΩซม. 25 ° C ) ได้ด้วยระบบ A10 ประโยชน์ milli-q เครื่องมือ ( มิลลิ , มิลาน , อิตาลี ) .

. .
ไวน์ตัวอย่างแปดไวน์ตัวอย่าง " คันโนนาอู ดิ sardegna หมอ " และเจ็ดไวน์ตัวอย่างของ " แวร์เมนติโน่ ดิ sardegna หมอ " ที่ผลิตในซาร์ดิเนีย ( อิตาลี ) จาก 2012 อายุเก็บเกี่ยวประมาณ ตัวอย่างในเชิงพาณิชย์ไวน์จัดโดยตรงโดยเก้าอันแตกต่างกับต้นกำเนิดและการใช้กระบวนการ oenological ได้รับการรับรองมาตรฐานห้าไวน์มาหนึ่งตัวอย่างของทั้งสองคันโนนาอู และ แวร์เมนติโน่ ไวน์ , ไวน์มาหนึ่งสองตัวอย่างของแวร์เมนติโน่ไวน์องุ่นที่เก็บเกี่ยวได้ในพื้นที่ที่แตกต่างกันและอีกสามเมืองที่มีหนึ่งตัวอย่างคันโนนาอูไวน์แต่ละ เหล่านี้ที่มีบัญชีสำหรับ 90% ของการผลิตไวน์ในซาร์ดิเนียคันโนนาอู และ แวร์เมนติโน่

2.3กรดอะมิโนและเอมีนกับ
กำหนด AA และ BA ดำเนินการหลังจากซัลกับ 3 . . ปฏิกิริยาที่ผสมเตรียมไว้ใน 1.5 ml หลอดเพนดอร์ฟปลอดภัยล็อค™และจำนวน 50 - 100 μ l ตัวอย่าง ( ไวน์หรือมาตรฐาน ) , 10 μ L 100 mg / l norvaline มาตรฐาน ( ภายใน ) , 100 μล. คลอไรด์ dansyl ( ตัวแทนกับ ) และ 0.2 M ( na2b4o7 ด้วย , พีเอช 93 ) วิธีการแก้ปัญหาถึงเล่มสุดท้ายของ 1000 μลิตร ผสมบ่มเป็นเวลา 30 นาทีที่ 40 ° C ในอ่างอัลตราโซนิก และระดับที่ 12 , 000 รอบต่อนาที เป็นเวลา 10 นาที ด้วยการเหวี่ยงเพนดอร์ฟ® minispin ( เพนดอร์ฟ , มิลาน , อิตาลี ) และน่านถูกกู้คืนและเจือจางด้วยเมทิลแอลกอฮอล์ ( 1 : 1 v / v ) สำหรับการวิเคราะห์ hplc-fld

2.4 . การวิเคราะห์ hplc-fld
พบการเปลี่ยนแปลงของ AA และ BA dansyl อนุพันธ์ได้ด้วยระบบไร้ hplc-fld Prostar ( Varian อิงค์ , วอลนัตครีก , แคลิฟอร์เนีย ) ติดตั้งกับโมดูลปั๊ม 230 , autosampler โมดูล 410 และ jasco 821-fp fluorimetric ตรวจจับ ( jasco ยุโรป เครเมลลา , LC , อิตาลี ) ที่มีความยาวคลื่นตั้งที่ 293 nm ( อดีต ) และ 492 นาโนเมตร ( เอ็ม )แยกได้ด้วย phenomenex ราศีเมถุน c18 110a คอลัมน์ ( 150 × 4.60 mm 3 μ M ; chemtek analitica anzola Emilia , โบโลญญา , อิตาลี ) thermostated ที่ 25 ° C , การใช้บัฟเฟอร์ pH 4.1 / น้ำนม ch3cn ( ตัวทำละลาย ; ส้ม 6.25 ml , ch3coona 1.97 กรัม 200 ml ch3cn น้ำ 1 ลิตร ) และ ไน ( ตัวทำละลาย B ) เป็นเฟสเคลื่อนที่ที่อัตราการไหลคงที่ของ 0.8 มิลลิลิตร / นาที การไล่ระดับสี ( v / v ) เริ่มจาก 95% เป็นตัวทำละลาย ,ที่ลดลงไป 80% ใน 18 นาที ถึง 50% ใน 42 นาที 0 %