2.7. Antimicrobial activity determi

2.7. Antimicrobial activity determination and inhibition spectrum
The spot-on-lawn method (Fujita et al., 2007) was used to
determine the inhibitory spectrum of culture supernatant, whereas
the microplate assay method (Floriano, Ruiz-Barba, & Jimenez-
Diaz, 1998) was used to determine the antimicrobial activity of
purified antimicrobial agents. For the spot-on-lawn method, 10 ml
of each indicator culture (109 CFU/ml) was seeded in 10 ml soft agar
and was poured onto basal tryptose agar. Culture supernatants
(10 ml, each), which presumably contain antimicrobial agents, were
then spotted onto these indicator lawns. Inoculated plates were
incubated at 37 _C overnight to manifest any antimicrobial activity.
For antifungal test, Rhizopus arrhizuswas inoculated in the centre of
antibiotic-containing plate count agar (APCA; Table 1) and held at
25 _C for 48 h. Culture supernatant (10 ml) was spotted at the edge
of the fungal mycelium and the plate was held at 25 _C for one day
before the antifungal activity was observed. For microplate assay,
L. innocua was diluted to 106 CFU/ml and an aliquot of 100 ml was
dispensed into each well of the microplate. Purified antimicrobial
agents were then added into the wells to a final volume of 200 ml,
whereas distilled water was used as negative control. The microplate
was incubated at 37 _C for 8 h and cell density was recorded
by a spectrophotometric microplate reader (Vmax Kinetic Microplate
Reader, Molecular Devices Corp., Menlo Park, CA) at wavelength
of 600 nm. Fractions producing lower cell density, compared
to negative control, were considered inhibitory. The activity was
presented in arbitrary unit per millilitre (AU/ml) which is the
reciprocal of the highest dilution exhibiting antimicrobial activity corresponding to 1 ml of non-diluted supernatant.

2.8. Amplification of subtilosin gene
A single colony of OSY-7LA was inoculated in 10 ml tryptic soy
broth supplemented with 0.6% yeast extract (TSBYE) and incubated
overnight at 30 _C. Cells were harvested by centrifugation of 1.5 ml
culture at 16,100 _ g for 5 min. Genomic DNAwas extracted using a
commercial kit (DNeasy Blood & Tissue kit, QIAGEN). Polymerase
chain reaction was performed to amplify the subtilosin gene from
genomic DNA using two primers as described previously (Zheng,
Yan, Vederas, & Zuber, 1999). Amplification was conducted as follows:
(A) an initial incubation for 3 min at 94 _C; (B) 30 cycles of
denaturation (1 min at 94 _C), annealing (1 min at 55 _C) and
elongation (2 min at 72 _C); (C) final extension at 72 _C for 10 min.
Resulting products were purified using a commercial DNA extraction
kit (QIA quick gel extraction kit, QIAGEN). The amplified DNA
was sequenced by an automated DNA analyzer (Applied Biosystems)
at the Plant-Microbe Genomics Facility, The Ohio State
University.

2.9. MALDI-TOF, Quadrupole-time of flight MS/MS and LC/MS/MS
analyses
Fractions purified from HPLC were subjected to MALDI-TOF and
Quadrupole-time of flight MS/MS analyses. LC/MS/MS was
employed for investigation of known antifungal agent in culture
supernatant since OSY-7LA showed antifungal activity. Details of
these tests were described elsewhere (Guo, Huang, Yuan, Zhang, &
Yousef, 2012).

2.10. Inhibition of L. innocua in Vienna sausage
A piece of sterile Vienna sausage (~15 g) was placed in a sterile
stomacher bag. An aliquot of 0.5 ml diluted (500 times) overnight
L. innocua culture was inoculated onto the surface of the sausage.
Crude extract of OSY-7LA was inoculated at a final concentration of
125 AU/sausage (~30 ml) on the same sausage samples. The samples
were then mixed and incubated at room temperature (25 _C).
Samples were taken at 1, 12 and 24 h for enumeration and results
were compared between the crude extract group and control
group.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.7 การกิจกรรมต้านจุลชีพและการยับยั้งการสเปกตรัมใช้วิธี spot-on-สนามหญ้า (ฟูจิตะ et al., 2007)กำหนดจำนวนมากวัฒนธรรม supernatant ลิปกลอสไขในขณะที่วิธีการทดสอบ microplate (Floriano, Ruiz Barba และ Jimenez-ดิแอซ 1998) ถูกใช้เพื่อกำหนดกิจกรรมของจุลินทรีย์หน้าที่จุลินทรีย์บริสุทธิ์ สำหรับวิธีการ spot-on-สนามหญ้า 10 mlของแต่ละตัวบ่งชี้ วัฒนธรรม (109 CFU/ml) ถูก seeded ใน agar อ่อน 10 mlและมี poured บน tryptose โรค agar Supernatants วัฒนธรรม(10 ml แต่ละ), ซึ่งสันนิษฐานว่าประกอบด้วยตัวแทนจุลินทรีย์ ถูกแล้ว ด่างบนสนามหญ้าตัวบ่งชี้เหล่านี้ มีแผ่น inoculatedincubated ที่ _C ที่ 37 ค้างคืนสาสนากิจกรรมจุลินทรีย์ใด ๆสำหรับการทดสอบต้านเชื้อรา Rhizopus arrhizuswas inoculated ในยาปฏิชีวนะประกอบด้วยจานนับ agar (APCA ตารางที่ 1) และจัดขึ้นที่_C 25 สำหรับ 48 h. วัฒนธรรม supernatant (10 ml) ถูกพบที่ขอบmycelium เชื้อราและจานถูกจัดขึ้นที่ 25 _C วันหนึ่งก่อนมีสังเกตกิจกรรมต้านเชื้อรา สำหรับทดสอบ microplateL. innocua ถูกผสมกับ 106 CFU/ml และได้มีส่วนลงตัวของ 100 มลคำในแต่ละดี microplate จุลินทรีย์บริสุทธิ์ตัวแทนถูกเพิ่มลงในบ่อที่ไปเสียงสุดท้ายของ 200 mlในขณะที่กลั่นน้ำ ถูกใช้เป็นตัวควบคุมค่าลบ การ microplateincubated ที่ 37 _C สำหรับบันทึกความหนาแน่น 8 h และเซลล์โดยผู้อ่าน spectrophotometric microplate (Vmax เดิม ๆ Microplateอ่าน CA Corp. พาร์ก อุปกรณ์โมเลกุล) ที่ความยาวคลื่นของ 600 nm ผลิตเซลล์ความหนาแน่นน้อย การเปรียบเทียบเศษส่วนการควบคุมค่าลบ ได้ถือลิปกลอสไข กิจกรรมที่มีนำเสนอในหน่วยกำหนดต่อ millilitre (AU/ml) ซึ่งเป็นการส่วนกลับของการเจือจางสูงสุดที่จุลินทรีย์กิจกรรมที่สอดคล้องกับ ml 1 ของ supernatant ไม่ผสมอย่างมีระดับ2.8 การขยายของยีน subtilosinโคโลนีเดี่ยวของ OSY 7LA ที่ inoculated ในถั่วเหลือง tryptic 10 mlเสริม ด้วยยีสต์ 0.6% ซุปแยก (TSBYE) และ incubatedค้างคืนที่ 30 _C เซลล์เก็บเกี่ยว โดย centrifugation 1.5 mlวัฒนธรรมที่ 16,100 _ g สำหรับ 5 นาที DNAwas Genomic สกัดโดยใช้การเชิงพาณิชย์ชุด (DNeasy เลือดและเนื้อเยื่อชุด QIAGEN) พอลิเมอเรสดำเนินการขยายยีน subtilosin จากปฏิกิริยาลูกโซ่genomic DNA โดยใช้ไพรเมอร์ทั้งสองตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ (เจิ้งยาน Vederas และ Zuber, 1999) วิธีการขยายเป็นดังนี้:(A) คณะทันตแพทยศาสตร์การเริ่มต้นสำหรับ 3 นาทีที่ 94 _C (ข) 30 รอบของdenaturation (1 นาทีที่ 94 _C), การอบเหนียว (1 นาทีที่ 55 _C) และelongation (2 นาทีที่ 72 _C); (C) ส่วนขยายขั้นสุดท้ายที่ _C 72 สำหรับ 10 นาทีผลิตภัณฑ์ผลลัพธ์ได้บริสุทธิ์ที่ใช้สกัดดีเอ็นเอการค้าชุด (QIA เจด่วนแยกชุด QIAGEN) ดีเอ็นเอเอาต์มีการเรียงลำดับตามการวิเคราะห์ดีเอ็นเออัตโนมัติ (Biosystems ใช้)ที่สินเชื่อพืช Microbe Genomics รัฐโอไฮโอมหาวิทยาลัย2.9. MALDI TOF, Quadrupole-เวลาบิน MS/MS และ LC/MS/MSวิเคราะห์ถูกต้องบริสุทธิ์จาก HPLC ส่วน MALDI TOF และQuadrupole-เวลาของเที่ยวบิน MS/MS วิเคราะห์ มี LC/MS/MSงานสำหรับการตรวจสอบตัวแทนต้านเชื้อราที่รู้จักกันในวัฒนธรรมsupernatant ตั้งแต่ OSY-7LA พบกิจกรรมต้านเชื้อรา รายละเอียดของทดสอบเหล่านี้ถูกอธิบายอื่น ๆ (โกว หวง หยวน จาง &ยูซุฟบิน 2012)2.10 การยับยั้ง L. innocua ในไส้กรอกเวียนนาชิ้นส่วนของกอซไส้กรอกเวียนนา (~ 15 g) ถูกวางในการฆ่าเชื้อกระเป๋าแผงประดับหน้าอก เป็นส่วนลงตัวของ 0.5 ml ผสม (500 ครั้ง) ค้างคืนวัฒนธรรม innocua L. มี inoculated บนพื้นผิวของไส้กรอกสารสกัดหยาบของ OSY 7LA ที่ inoculated ที่ความเข้มข้นสุดท้ายของ125 AU/ไส้กรอก (~ 30 ml) บนตัวไส้กรอกอย่างเดียว ตัวอย่างผสมแล้ว และ incubated ที่อุณหภูมิห้อง (25 _C)ตัวอย่างที่ถ่ายที่ 1, 12 และ 24 h สำหรับการแจงนับและผลลัพธ์มีการเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มสารสกัดหยาบและควบคุมกลุ่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.7 ความมุ่งมั่นฤทธิ์ต้านจุลชีพและสเปกตรัมยับยั้งจุดบนสนามหญ้าวิธี (ฟูจิ et al., 2007) ถูกใช้ในการตรวจสอบคลื่นใสยับยั้งของวัฒนธรรมในขณะที่วิธีการทดสอบไมโคร(ที่ Floriano, รุยซ์-Barba และ Jimenez- Diaz, 1998 ) ถูกนำมาใช้เพื่อตรวจสอบฤทธิ์ต้านจุลชีพของยาต้านจุลชีพบริสุทธิ์ สำหรับวิธีการจุดบนสนามหญ้า 10 มล. ของวัฒนธรรมแต่ละตัวบ่งชี้ (109 CFU / ml) เป็นเมล็ดในอาหารเลี้ยงเชื้ออ่อน 10 มล. และถูกเทลงบนอาหารเลี้ยงเชื้อ tryptose ฐาน supernatants วัฒนธรรม(10 มล. แต่ละ) ซึ่งน่าจะมียาต้านจุลชีพได้เห็นแล้วบนสนามหญ้าตัวบ่งชี้เหล่านี้ แผ่น Inoculated ถูกบ่มที่ 37 _C ค้างคืนจะประจักษ์ฤทธิ์ต้านจุลชีพใด ๆ . สำหรับการทดสอบเชื้อรา Rhizopus arrhizuswas เชื้อในใจกลางของยาปฏิชีวนะที่มีแผ่นวุ้นนับ(APCA; ตารางที่ 1) และจัดขึ้นที่25 _C เป็นเวลา 48 ชั่วโมง วัฒนธรรมใส (10 มล.) เป็นด่างที่ขอบของเส้นใยเชื้อราและแผ่นถูกจัดขึ้นที่25 _C หนึ่งวันก่อนที่กิจกรรมต้านเชื้อราได้สังเกต สำหรับการทดสอบไมโคร, แอล innocua ถูกเจือจาง 106 CFU / ml และหาร 100 มล. เป็นการจ่ายในแต่ละดีmicroplate ยาต้านจุลชีพบริสุทธิ์ตัวแทนแล้วถูกเพิ่มเข้าไปในหลุมปริมาณสุดท้ายของ 200 มล, ในขณะที่น้ำกลั่นถูกนำมาใช้เป็นตัวควบคุมเชิงลบ microplate ถูกบ่มที่ 37 _C เป็นเวลา 8 ชั่วโมงและความหนาแน่นของเซลล์ได้รับการบันทึกโดยผู้อ่านmicroplate สเปก (Vmax Kinetic ไมโครReader, อุปกรณ์โมเลกุลคอร์ป Menlo Park, CA) ที่ความยาวคลื่น600 นาโนเมตร เศษส่วนความหนาแน่นของเซลล์ผลิตที่ต่ำกว่าเมื่อเทียบกับการควบคุมเชิงลบได้รับการพิจารณาในการยับยั้ง กิจกรรมที่ถูกนำเสนอโดยพลในหน่วยต่อมิลลิลิตร (AU / ml) ซึ่งเป็นซึ่งกันและกันของการลดสัดส่วนที่สูงที่สุดแสดงฤทธิ์ต้านจุลชีพที่สอดคล้องกับ1 มิลลิลิตรของสารละลายที่ไม่เจือจาง. 2.8 การขยายของยีน subtilosin อาณานิคมเดียวของOsý-7LA ได้รับเชื้อใน 10 มลถั่วเหลือง tryptic น้ำซุปเสริมด้วยสารสกัดจากยีสต์ 0.6% (TSBYE) และบ่มในชั่วข้ามคืนวันที่30 _C เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยการหมุนเหวี่ยง 1.5 มล. วัฒนธรรมที่ 16,100 _ กรัมเป็นเวลา 5 นาที DNAwas จีโนมที่สกัดโดยใช้ชุดการค้า(DNeasy เลือดและชุดเนื้อเยื่อ QIAGEN) โพลีเมอปฏิกิริยาลูกโซ่ได้ดำเนินการเพื่อขยายยีน subtilosin จากดีเอ็นเอโดยใช้สองไพรเมอร์ตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้(เจิ้งเหอยัน Vederas และ Zuber, 1999) ขยายได้ดำเนินการดังต่อไปนี้(ก) การบ่มเริ่มต้นสำหรับ 3 นาทีที่ 94 _C; (B) 30 รอบของการสูญเสียสภาพธรรมชาติ(1 นาทีที่ 94 _C) หลอม (1 นาทีที่ 55 _C) และการยืดตัว(2 นาทีที่ 72 _C); (C) นามสกุลสุดท้ายที่ 72 _C เป็นเวลา 10 นาที. ผลิตภัณฑ์ส่งผลให้บริสุทธิ์โดยใช้การสกัดดีเอ็นเอพาณิชย์ชุด (ชุด QIA สกัดเจลอย่างรวดเร็ว QIAGEN) ดีเอ็นเอขยายได้รับการจัดลำดับโดยวิเคราะห์ดีเอ็นเออัตโนมัติ (Applied Biosystems) ที่สิ่งอำนวยความสะดวกพืชจุลินทรีย์ฟังก์ชั่นที่รัฐโอไฮโอมหาวิทยาลัย. 2.9 MALDI-TOF, Quadrupole เวลาของเที่ยวบิน MS / MS และ LC / MS / MS วิเคราะห์เศษส่วนบริสุทธิ์จาก HPLC ถูกยัดเยียดให้ MALDI-TOF และ Quadrupole เวลาของเที่ยวบิน MS / MS วิเคราะห์ LC / MS / MS ถูกใช้สำหรับการตรวจสอบตัวแทนต้านเชื้อราที่รู้จักกันในวัฒนธรรมใสตั้งแต่Osý-7LA มีฤทธิ์ต้านเชื้อรา รายละเอียดของการทดสอบเหล่านี้ถูกอธิบายอื่น ๆ (Guo หวางหยวนจางและ Yousef 2012). 2.10 ยับยั้งการ innocua ลิตรในเวียนนาไส้กรอกชิ้นส่วนของไส้กรอกเวียนนาผ่านการฆ่าเชื้อA (~ 15 กรัม) ถูกวางไว้ในการฆ่าเชื้อถุงStomacher aliquot 0.5 มล. เจือจาง (500 ครั้ง) ค้างคืนลิตร วัฒนธรรม innocua ได้รับเชื้อลงบนพื้นผิวของไส้กรอก. สารสกัดจากน้ำมันดิบของOsý-7LA ได้รับเชื้อที่มีความเข้มข้นสุดท้ายของ125 AU / ไส้กรอก (~ 30 มล.) ในตัวอย่างไส้กรอกเดียวกัน กลุ่มตัวอย่างที่เป็นแล้วผสมและบ่มที่อุณหภูมิห้อง (25 _C). ตัวอย่างที่ถูกนำมาที่ 1, 12 และ 24 ชั่วโมงสำหรับการแจงนับและผลที่ได้มาเปรียบเทียบระหว่างกลุ่มสารสกัดหยาบและการควบคุมกลุ่ม

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

2.7 . กิจกรรมการยับยั้งการเกิดสเปกตรัม
จุดบนสนามหญ้าวิธี ( ฟูจิตะ et al . , 2007 ) ใช้ศึกษาสเปกตรัมอาหาร

นำวัฒนธรรม ส่วนพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยโดยวิธี ( floriano รุยซ์ , บาร์บา& Jimenez , -
Diaz , 1998 ) ถูกใช้เพื่อศึกษากิจกรรมการต้านจุลชีพของยาต้านจุลชีพ
บริสุทธิ์ . สำหรับจุดบนวิธีการที่สนามหญ้า , 10 ml
ของแต่ละตัวบ่งชี้วัฒนธรรม ( 109 CFU / ml ) คือเมล็ดใน 10 ml นุ่มวุ้น
และเทลงบนฐาน tryptose วุ้น วัฒนธรรม supernatants
( 10 ml แต่ละ ) ซึ่งสันนิษฐานว่าประกอบด้วยสารต่อต้านจุลชีพเป็นด่างบนสนามหญ้า
แล้วตัวบ่งชี้เหล่านี้ ที่ใส่แผ่นอยู่
บ่มที่ 37 _c ค้างคืนเพื่อแสดงฤทธิ์ต้านจุลชีพใด ๆ .
ทดสอบเชื้อราarrhizuswas เชื้อ Rhizopus ในศูนย์ของ
ยาปฏิชีวนะที่มี Planetmath reference ( apca ตารางที่ 1 ) และคณะ
25 _c 48 ชั่วโมง ( 10 ml ) วัฒนธรรมนำตัวที่ขอบ
ของเส้นใยของเชื้อราและจานที่จัดขึ้นที่ 25 _c หนึ่งวัน
ก่อนกิจกรรมการเจริญของเชื้อรา ) สำหรับพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทยโดย
L innocua เจือจาง 106 cfu / ml และเป็นส่วนลงตัวของถูก
100 มล.จ่ายในแต่ละดีของพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย . บริสุทธิ์ต้าน
ตัวแทนแล้วเพิ่มลงในบ่อเป็นเล่มสุดท้ายของ 200 ml
ส่วนน้ำกลั่นที่ใช้ควบคุมลบ ในพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย
ถูกบ่มที่ 37 _c 8 H และความหนาแน่นเซลล์ถูกบันทึก
โดยพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( 4 ) อ่านถึงพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย
อ่านโมเลกุล , อุปกรณ์ Corp . , เมนโล พาร์ค ( CA ) ที่ความยาวคลื่น
600 นาโนเมตร ส่วนการผลิต ลดปริมาณความหนาแน่นเซลล์เทียบ
ควบคุมลบ ถูกพิจารณาว่า . กิจกรรมที่นำเสนอในหน่วยต่อมิลลิลิตร
พล ( AU / ml ) ซึ่งเป็นส่วนกลับของ dilution สูงสุด
จัดแสดงกิจกรรมที่สอดคล้องกับ 1 มิลลิลิตร ไม่เจือจาง นำยา

2.8 . การเพิ่มปริมาณของยีน
subtilosinอาณานิคมเดียวของ osy-7la เป็นเชื้อ 10 มิลลิลิตรในอาหารถั่วเหลือง
ซุปเติมยีสต์สกัด 0.6% ( tsbye ) และบ่ม
ค้างคืนที่ 30 _c เซลล์ที่ถูกเก็บเกี่ยวโดยปั่น 1.5 ml
วัฒนธรรมใน 2549 มีจํ _ G สำหรับ 5 นาที พบ dnawas สกัดโดยใช้
ชุดพาณิชย์ ( dneasy เลือด&เนื้อเยื่อเพิ่มชุด ) ปฏิกิริยาลูกโซ่
ได้ขยาย subtilosin
ยีนจากดีเอ็นเอโดยใช้สองวิธีตามที่อธิบายไว้ก่อนหน้านี้ ( เจิ้ง
ยัน vederas &ซูเบอร์ , 1999 ) แบบมีวัตถุประสงค์ดังนี้ :
( ) เริ่มต้นบ่มเป็นเวลา 3 นาทีที่ 94 _c ; ( b )
( 30 รอบ ( 1 นาทีที่ 94 _c ) การอบ ( 1 นาทีที่ 55 _c ) และการยืดตัว (
2 นาทีที่ 72 _c ) ; ( c ) ขยายสุดท้ายที่ 72 _c สำหรับ 10 นาที
เป็นผลผลิตภัณฑ์บริสุทธิ์ใช้ดีเอ็นเอที่สกัด
พาณิชย์ชุด ( มั่นเจลสกัดด่วนชุดเพิ่ม ) มีแถบดีเอ็นเอนี้โดยอัตโนมัติ
เป็นดีเอ็นเอวิเคราะห์ ( Applied Biosystems )
ที่จุลินทรีย์พืชในสถานที่ , รัฐโอไฮโอมหาวิทยาลัย


2.9 . maldi-tof คำ , เวลาของเที่ยวบิน MS / MS และ LC / MS / MS

เศษส่วน HPLC วิเคราะห์วิธีถูก maldi-tof
คำและเวลาของเที่ยวบิน MS / MS วิเคราะห์ข้อมูล LC / MS / MS คือ
ที่ใช้สำหรับตรวจสอบว่าตัวแทนนำเชื้อราในวัฒนธรรม
ตั้งแต่ osy-7la แสดงฤทธิ์ต้านรา . รายละเอียดของการทดสอบเหล่านี้ได้ถูกอธิบายไว้ในที่อื่น (
กั้ว หวง หยวน จาง &
Yousef 2012 ) .

2.10 . การยับยั้งของ L . innocua ในไส้กรอกเวียนนา
ชิ้นไส้กรอกเวียนนาที่เป็นหมัน ( ~ 15 กรัม ) ใส่ในถุงแผงประดับหน้าอกเป็นหมัน

เป็นส่วนลงตัวของ 0.5 มล. เจือจาง ( 500 ครั้ง ) ค้างคืน
Lวัฒนธรรม innocua เป็นเชื้อลงบนพื้นผิวของไส้กรอก
สารสกัด osy-7la เป็นเชื้อที่ความเข้มข้นสุดท้าย
125 AU / ไส้กรอก ( ~ 30 ml ) ในตัวอย่างไส้กรอกเหมือนกัน ตัวอย่าง
แล้วผสมบ่มที่อุณหภูมิห้อง ( 25 _c ) .
ตัวอย่างถ่ายที่ 1 , 12 และ 24 ชั่วโมง สำหรับผลการนับและ
เปรียบเทียบระหว่างกลุ่มควบคุมและกลุ่มสกัด
.