2.6. Measurement of antioxidant act

2.6. Measurement of antioxidant activity
The antioxidant activity was measured through the scavenging
activity ofthe stable 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl(DPPH)free
radical (Chen et al., 2012). A stock solution of DPPH (100 M) was
freshly prepared in pure ethanol (97%). The herb extracts at various
concentrations (1 mL) were individually added to ethanol (1 mL)
and the DPPH solution (500 L), and maintained in dark at room
temperature for 1 h. The absorbance of this solution was measured
at 517 nm versus a blank prepared without the herb extracts. The
antioxidant activity or inhibition of the DPPH radical of the test
samples was calculated as follows:
DPPH scavenging activity (%) = (
A0 − A
A0
) × 100,
where A0 = absorbance at 517 nm of the blank (without extract),
and A= absorbance at 517 nm of the test sample; the IC50 of DPPH
was calculated as the percentage of inhibition if required.
2.7. Measurement of reducing power
The reducing power was measured based on Fe(III) to Fe(II)
transformation in the presence of the extracts, as described by
Fejes et al. (2000). The test sample at different concentrations
of the extracts (1 mL) was mixed with 1% potassium ferricyanide
(2.5 mL) and a 0.2 M phosphate buffer (pH 6.7; 2.5 mL). The mixture
was incubated at 50 ◦C for 20 min; 2.5 mL of 10% trichloroacetic
acid was then added to the solution and centrifuged at 3500g for
15 min to collect the upper layer of the solution. Approximately
2 mL of the supernatant was mixed with 2 mL of distilled water
and 0.4 mL of fresh 0.1% ferric chloride. After a 10-min reaction,
absorbance was measured at 700 nm (higher absorbance readings
indicate greater reducing power). The extract concentration providing
0.5 of absorbance (i.e., IC50) was calculated from the graph
of absorbance at 700 nm versus the extract concentration in the
solution.
2.8. Assay of tyrosinase activity in B16F10 murine melanoma cells
The tyrosinase inhibitory activity was measured using the
method developed by Peng et al. (2013). The B16F10 cells were
cultured in culture flasks in a CO2 incubator in a humidified atmosphere
containing 5% CO2 in air at 37 ◦C, and supplemented with
10% fetal bovine serum (Sigma, USA). The cells (106 cells/mL) were
then harvested through trypsinization and washed 3 times with ice
cold phosphate-buffered saline. Next, the cells were disrupted by
sonication at 4 ◦C and separated by centrifugation at 15,000 rpm for 25 min. The reaction mixtures containing the herb extracts,
2 mg/mL l-DOPA, and a 0.1 M sodium phosphate buffer (pH 7.0)
were incubated on a 96-well plate at 37 ◦C for 2 h. After quantifying
protein contents and adjusting concentrations with lysis buffer
until each lysate contained the same amount of protein (40 g). The
activity of mammalian tyrosinase used in the studies was diluted
to 350 units per milliliter, which was the same as that of the mushroom
tyrosinase. The test sample at a concentration of 500 g/mL
was selected to evaluate tyrosinase inhibition in the B16F10 murine
melanoma cells. Absorbance was measured at 450 nm using an
ELISA plate reader.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

2.6 การวัดของอนุมูลกิจกรรมการต้านอนุมูลอิสระโดยวัดผ่านการ scavengingกิจกรรมของเสถียร 2.2 นไดฟีนิลได-1-picrylhydrazyl (DPPH) ฟรีรุนแรง (Chen et al. 2012) สารละลาย DPPH (100m) หุ้นได้สด ๆ ในเอทานอ (97%) สมุนไพรสารสกัดจากที่ต่าง ๆเอทานอล (1 mL) พร้อมเพิ่มความเข้มข้น (1 mL)และโซลูชัน DPPH (500 ลิตร), และมืดเก็บไว้ในห้องอุณหภูมิสำหรับ 1 h โดยวัดค่าการแก้ปัญหานี้ที่ 517 nm เทียบกับว่างเปล่าที่เตรียมไว้ โดยไม่มีสารสกัดจากสมุนไพร การอนุมูลหรือการยับยั้งอนุมูลอิสระ DPPH ของการทดสอบตัวอย่างคำนวณเป็นดังนี้:DPPH scavenging กิจกรรม (%) =(A0 − AA0) × 100ที่ A0 =ค่าที่ 517 nm ของว่าง (ไม่แยก),และ A =ค่าที่ 517 nm ของตัวอย่างทดสอบ IC50 DPPHถูกคำนวณเป็นเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งการ2.7 การวัดการลดพลังงานพลังงานลดลงโดยวัดตาม Fe(III) การ Fe(II)การเปลี่ยนแปลงในสารสกัด ตามที่อธิบายไว้โดยFejes et al. (2000) ตัวอย่างทดสอบที่ความเข้มข้นแตกต่างกันของสารสกัด (1 mL) ถูกผสมกับ 1% โพแทสเซียม ferricyanide(2.5 มิลลิลิตร) และ 0.2 M ฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 6.7; 2.5 mL) ส่วนผสมมี incubated ที่ 50 ◦C 20 นาที 2.5 mL ของ trichloroacetic 10%กรดแล้วเพิ่มเพื่อการแก้ไขปัญหา และจากที่ 3500 กรัมสำหรับ15 นาทีจะเก็บชั้นบนของการแก้ปัญหา ประมาณ2 mL ของ supernatant ถูกผสม ด้วยน้ำกลั่น 2 มิลลิลิตรและ 0.4 mL ของสด 0.1% คคลอไรด์ หลังจาก 10 นาทีปฏิกิริยาโดยวัดค่าที่ 700 นาโนเมตร (สูงกว่าค่าการอ่านค่าระบุใช้พลังงานลดลงมากขึ้น) การให้สารสกัดความเข้มข้นค่า (เช่น IC50) 0.5 คำนวณจากกราฟค่าที่ 700 nm เทียบกับความเข้มข้นของสารสกัดในการการแก้ปัญหา2.8. วิเคราะห์กิจกรรมไทโรซิเนสในเซลล์ murine melanoma B16F10กิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนสซึ่งวัดได้โดยใช้การวิธีพัฒนาโดย Peng et al. (2013) เซลล์ B16F10ล้างในขวดวัฒนธรรมในตู้อบมี CO2 ในบรรยากาศณอุณหภูมิที่ประกอบด้วย 5% CO2 ในอากาศที่ 37 ◦C และเสริมด้วย10% ทารกวัวซีรั่ม (ซิกม่า สหรัฐอเมริกา) เซลล์ (106 เซลล์/มิลลิลิตร)จากนั้นเก็บเกี่ยวผ่าน trypsinization และล้าง 3 ครั้ง ด้วยน้ำแข็งน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์เย็น ถัดไป เซลล์ถูกแทรกแซงด้วยsonication ที่ 4 ◦C และแยก โดยการหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 rpm 25 นาที สารสกัดจากสมุนไพรที่ประกอบด้วยส่วนผสมปฏิกิริยาl 2 mg/mL-DOPA และ 0.1 M โซเดียมฟอสเฟตบัฟเฟอร์ (pH 7.0)ได้รับการกกบนจานหลุม 96 ที่ 37 ◦C สำหรับ 2 h หลังจากเชิงปริมาณโปรตีนเนื้อหาและปรับความเข้มข้นกับ lysis บัฟเฟอร์จนละ lysate อยู่กันของโปรตีน (40 กรัม) การการเลี้ยงลูกด้วยนมเนสมาใช้ในการศึกษาถูกเจือจางหน่วย 350 ต่อมิลลิเมตร ซึ่งเหมือนกับของเห็ดดี ตัวอย่างทดสอบที่ความเข้มข้น 500 กรัม/มล.เลือกการประเมินการยับยั้งไทโรซิเนสใน B16F10 murineมีเซลล์ melanoma โดยวัดค่าที่ 450 nm โดยใช้การอ่านแผ่น ELISA

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

2.6 วัดสารต้านอนุมูลอิสระ
ต้านอนุมูลอิสระวัดผ่านไล่
กิจกรรม ofthe มั่นคง 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) ฟรี
หัวรุนแรง (Chen et al., 2012) วิธีการแก้ปัญหาสต็อกของ DPPH (100 เมตร) คือการ
ปรุงสดใหม่ในเอทานอลบริสุทธิ์ (97%) สารสกัดจากสมุนไพรในหลาย ๆ
ความเข้มข้น (1 มิลลิลิตร) มีการเพิ่มรายบุคคลเพื่อให้เอทานอล (1 มิลลิลิตร)
และวิธีการแก้ปัญหา DPPH นี้ (500 ลิตร) และการบำรุงรักษาในที่มืดที่ห้อง
อุณหภูมิเป็นเวลา 1 ชั่วโมง ค่าการดูดกลืนของการแก้ปัญหานี้ได้รับการวัด
ที่ 517 นาโนเมตรเมื่อเทียบกับเตรียมที่ว่างเปล่าโดยไม่ต้องสารสกัดจากสมุนไพร
ฤทธิ์ต้านอนุมูลอิสระหรือการยับยั้งของ DPPH รุนแรงของการทดสอบ
ตัวอย่างที่คำนวณได้ดังนี้
กิจกรรม DPPH ใน (%) = (
A0 - เป็น
A0
) × 100,
ที่ A0 = การดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตรของว่าง (โดยไม่ต้อง Extract),
และ A = การดูดกลืนแสงที่ 517 นาโนเมตรของตัวอย่างทดสอบ; ค่า IC50 ของ DPPH
ที่คำนวณเป็นเปอร์เซ็นต์ของการยับยั้งถ้าจำเป็น.
2.7 วัดของการลดการใช้พลังงาน
พลังงานลดการวัดขึ้นอยู่กับเฟ (III) เพื่อ Fe (II)
การเปลี่ยนแปลงในการปรากฏตัวของสารสกัดที่เป็นอธิบายโดย
Fejes et al, (2000) ตัวอย่างการทดสอบที่แตกต่างกันที่ระดับความเข้มข้น
ของสารสกัด (1 มิลลิลิตร) ผสมกับโพแทสเซียม ferricyanide 1%
(2.5 มิลลิลิตร) และบัฟเฟอร์ 0.2 M ฟอสเฟต (pH 6.7; 2.5 มิลลิลิตร) ส่วนผสมที่
ถูกบ่มที่ 50 ◦Cเป็นเวลา 20 นาที; 2.5 มลไตรคลอโร 10%
กรดถูกเพิ่มเข้ามาแล้วจะแก้ปัญหาและหมุนเหวี่ยงที่ 3500g สำหรับ
15 นาทีในการเก็บรวบรวมชั้นบนของการแก้ปัญหา ประมาณ
2 มิลลิลิตรใสผสมกับ 2 มิลลิลิตรของน้ำกลั่น
และ 0.4 มิลลิลิตรของสด 0.1% คลอ หลังจากปฏิกิริยา 10 นาที,
การดูดกลืนแสงวัดที่ 700 นาโนเมตร (สูงกว่าการอ่านการดูดกลืนแสง
บ่งบอกถึงพลังลดมากกว่า) ความเข้มข้นของสารสกัดให้
0.5 ของการดูดกลืนแสง (เช่น IC50) ที่คำนวณได้จากกราฟ
ของการดูดกลืนแสงที่ 700 นาโนเมตรเมื่อเทียบกับความเข้มข้นของสารสกัดใน
การแก้ปัญหา.
2.8 การทดสอบของกิจกรรมในไทโรซิเน B16F10 เซลล์เนื้องอกหมา
กิจกรรมการยับยั้งไทโรซิเนวัดโดยใช้
วิธีการพัฒนาโดย Peng, et al (2013) เซลล์ B16F10 ถูก
เพาะเลี้ยงในขวดวัฒนธรรมในศูนย์บ่มเพาะ CO2 ในบรรยากาศความชื้น
ที่มี CO2 ในอากาศ 5% ที่ 37 ◦Cและเสริมด้วย
ซีรั่ม 10% ของทารกในครรภ์วัว (Sigma, สหรัฐอเมริกา) เซลล์ (106 เซลล์ / มิลลิลิตร) ถูก
เก็บเกี่ยวแล้วผ่าน trypsinization และล้าง 3 ครั้งกับน้ำแข็ง
เย็นน้ำเกลือฟอสเฟตบัฟเฟอร์ ถัดไปเซลล์ที่ถูกรบกวนด้วย
sonication ที่ 4 ◦Cและคั่นด้วยการหมุนเหวี่ยงที่ 15,000 รอบต่อนาทีเป็นเวลา 25 นาที ผสมปฏิกิริยาที่มีสารสกัดจากสมุนไพร,
2 mg / ml L-DOPA และฟอสเฟตบัฟเฟอร์ 0.1 M โซเดียม (pH 7.0)
ถูกบ่มบนแผ่น 96 หลุมที่ 37 ◦Cเป็นเวลา 2 ชั่วโมง หลังจากที่ปริมาณ
โปรตีนและการปรับระดับความเข้มข้นที่มีบัฟเฟอร์สลาย
จนแต่ละ lysate มีจำนวนเดียวกันของโปรตีน (40 กรัม)
กิจกรรมของเอนไซม์ tyrosinase เลี้ยงลูกด้วยนมที่ใช้ในการศึกษาได้รับการปรับลด
ถึง 350 หน่วยต่อมิลลิลิตรซึ่งเป็นเช่นเดียวกับที่ของเห็ด
tyrosinase ตัวอย่างการทดสอบที่ความเข้มข้น 500 กรัม / มิลลิลิตร
ได้รับเลือกในการประเมินการยับยั้งเอนไซม์ tyrosinase ใน B16F10 หมา
เซลล์เนื้องอก การดูดกลืนแสงวัดที่ 450 นาโนเมตรโดยใช้
เครื่องอ่านแผ่น ELISA