MethodsSample collection and DNA ex

Methods
Sample collection and DNA extraction
Samples of C. harmani were collected from the Nagqu
area in Tibet, China, and voucher specimen was deposited
in Institute of Zoology, Shaanxi Normal University;
C. mantchuricum and C. crossoptilon were collected
from the Beijing Zoo, and samples were obtained from
bird specimen collections of the National Zoological
Museum, Institute of Zoology, Chinese Academy of
Sciences. The collection was under the permit from
Forestry Department and conformed to the National
Wildlife Conservation Law in China. No living animal
experiments were conducted in the current research.
All the samples were preserved in 100% ethanol and
stored at −20°C. The total genomic DNA was extracted
from the liver/muscle tissue using the standard phenol/
chloroform method [16].
PCR amplification and sequencing
The PCRs were performed under the following conditions,
2 min initial denaturation at 93°C, 40 cycles of:
10 s denaturation at 92°C, 30 s annealing at 58–53°C,
10 min elongation at 68°C in the preliminary 20 cycles,
and 10 s denaturation at 92°C, 30 s annealing at 53°C,
and 10 min elongation at 68°C with 20 s per cycle added
to the elongation step in the succeeding 20 cycles, and
finally an extension for 7 min at 68°C. The amplifications
were performed in 15 μL reactions containing
2.4 μL of 2.5 mM dNTPs, 2.1 μL of each primer at 10
μΜ, 1.5 μl of 10× LA PCR Buffer I (Mg2+-free), 1.5 μL
of 25 mM MgCl2, 1 μL of DNA template, 0.18 μL of 5
U/μl LA Taq polymerase (Takara, Dalian, China) and
4.22 μL ddH2O.
The sequences of the primers used for PCR amplification
and sequencing of the mitochondrial genes were
obtained from Sorenson (2003) [17] with minor changes
(Additional file 1). The mitogenome of C. harmani was
amplified in seven parts and the gaps were bridged using
other adjacent primers. The PCR products were purified
using the DNA Agarose Gel Extraction Kit (Bioteke,
Beijing, China) after separation by electrophoresis on a
0.8% agarose gel. After separation and purification, the
PCR products were sequenced by Sangon Biotech
(Shanghai) Co., LTD. using the Primer-Walking method.
The C. mantchuricum and C. crossoptilon mitogenomes
were amplified in 12 or 13 fragments, and sequencing was
performed using the Illumina Hiseq2000 high-throughput
sequencing system of Shenzhen Huada Gene Technology
Co., LTD. The gaps in the assembly after high-throughput
sequencing were filled in by direct sequencing using the
ABI 3730 DNA sequencer by Sangon Biotech (Shanghai)
Co., LTD., using adjacent PCR primers.
Gene identification and genome analyses
The Staden sequence analysis package [18] was used
for sequence assembly and annotation of C. harmani
mitogenome. The complete genome assemblies for the
mitogenomes of C. mantchuricum and C. crossoptilon
were performed using the SOAP de novo software.
Most tRNA genes were identified using tRNAscan-SE
1.21 [19] under the ‘tRNAscan only’ search mode, with
the vertebrate mitochondrial genetic code and ‘mito/
chloroplast’ source. The protein-coding genes (PCGs),
rRNA genes and the remaining putative tRNA genes
that were not identified by tRNAscan-SE were identified
by sequence comparison with other Galliformes
species. The rrnS secondary structure of Crossoptilon
was predicted based on the structure of Gallus gallus
and Anas platyrhynchos obtained from the Comparative
RNA Web (CRW) [20], and Pseudopodoces humilis
(now as Parus humilis) structure [16]. The rrnL secondary
structure was predicted based on the structure
of Xenopus laevis obtained from the CRW database,
Bos taurus [21] and P. humilis structures [16]. The
RNAstructure software was used to identify and draw
potential secondary structures in the single-stranded
control region. The nucleotide compositions of the
mitogenomes and amino acid information were analysed
using MEGA 4.1 [22].Sequence alignments
Along with the entire mitogenomes obtained in this
study, 42 Galliformes sequences were used in the phylogenetic
analysis, including two outgroups (Numida
meleagris and Alectura lathami). The DNA sequences of
the other species used in the phylogenetic analyses were
downloaded from GenBank (the accession numbers and
key information are shown in Additional file 2). The
tRNA and rRNA genes and the CR were individually
aligned using ClustalX 1.83 [23] with the default settings.
All 13 protein-coding genes were translated into
amino acids, and then aligned using MEGA 4.1 [22] with
default parameters for each gene, and finally retranslated
into nucleotide sequences.
Phylogenetic analyses of Phasianidae
Datasets containing 13 protein-coding genes (PCG) and
all 37 genes plus the control region (mitogenome) were
used to study the phylogenetic relationships within
Phasianidae. Phylogenetic analysis based on nucleotide
sequences was performed using PAUP*4.0b10 for the
Maximum parsimony (MP) method [24], RAxML-7.0.3
for maximum likelihood (ML) [25] and MrBayes 3.1.2
for Bayesian inference (BI) [26]. For ML and BI analyses,
models of the concatenated nucleotide sequences datasets
were assessed independently using AICc in MrModeltest2.2
[27]. The best fit model GTR + I + G was
chosen for the likelihood and Bayesian analyses. A consensus
tree was generated for MP analysis under the majority
rule. The reliability of the clades in the phylogenetic trees
was assessed by bootstrap probabilities (BSP) computed
using 1000 replicates, with random addition for each bootstrap
replicate. The 1000 replicates bootstrap support was
also performed in the ML analysis. Bayesian analysis with
Markov Chain Monte Carlo sampling was run for
1000000 generations saving a tree every 100 generations,
with one cold and three heated chains, and the burn-in
time was determined by the time to convergence of the
likelihood scores. The Bayesian posterior probabilities
(BPP) were estimated on a 50% majority rule consensus
tree of the remaining trees.
We examined the performance of individual genes and
datasets based on nucleotides; PBS analyses were performed
in the program combining TreeRot.v3 [28] and
PAUP*4.0b10 [24]. The following datasets were used for
analysis: 13 protein-coding genes, rrnS, rrnL, CR partitions,
the first, second and third codons of PCG, the
three tRNA gene cluster (IQM, WANCY and HSL), ATP
(atp6 + atp8), COX (cox1 + cox2 + cox3) and NADH
(nad1 + nad2 + nad3 + nad4 + nad4L + nad5 + nad6).
The MEGA 4.1 [22] was used to calculate the pairwise
genetic distance for four Crossoptilon species with default
parameters. The mitogenome aligned data and four
single genes (nad2, CR, cytb and rrnS) obtained from
GenBank (Additional file 3) were used to calculate the
genetic distances. These genes were aligned singly, and
be adjusted to consistent sequence lengths manually.
Divergence time estimates focused on Crossoptilon
Along with the PCG dataset obtained in this study, 42
Galliformes sequences were used to estimate the divergence
time of the Crossoptilon species. The divergence
time of Crossoptilon species was calculated using the
Bayesian procedure implemented in BEAST v. 1.7.2
[29,30]. A relaxed clock was used with rates complying
with a log-normal distribution [31]. The GTR + I + G
model and a Yule prior were used in the analysis. The
calibration points were based on the fossil records showing
that stem Numididae-Phasianidae split at 50–54
Mya (million years ago) [32]; Arborophila rufipectus diverged
from the other lineages in the Galliformes around
39 Mya [33]; Coturnix-Gallus split at 35 Mya [34-36].
The results of runs of 10 million generations were used
after a burn-in of 100.
Ka and Ks analysis
To better understand the evolution at the DNA level
and the role of selection in the four Crossoptilon species,
we calculated the nonsynonymous and synonymous substitution
rates using Kaks_calculator 2.0 [37] for six
groups [C. harmani-C. mantchuricum (C.har-C.man),
C. mantchuricum-C. crossoptilon (C.man-C.cro), C. harmani-
C. crossoptilon (C.har-C.cro), C. harmani-C. auritum
(C.har-C.aur), C. mantchuricum-C. auritum (C.
man-C.aur), and C. crossoptilon-C. auritum (C.cro-C.
aur)]. The ratio of nonsynonymous substitution rate
(Ka) to synonymous substitution rate (Ks) is widely used
as an indicator of selective pressure at the sequence level
among different species. It is commonly accepted that
Ka > Ks, Ka = Ks, and Ka < Ks generally indicate positive
selection, neutral mutation, and negative selection, respectively
[38,39]. To calculate Ka, Ks and Ka/Ks, a
model averaging method was selected. This method includes
14 different models for calculation and derived
the average values for Ka, Ks, and Ka/Ks [37]. The genetic
code selected was the ‘vertebrate mitochondrial
code’. To further study the selective pressure acted on
each protein-coding gene in the genus Crossoptilon,
CodeML in PAMLX software [40] was used to find sites
under strong selective pressure. The secondary structure
analysis of amino acid was performed by using an online
software TOPCONS [4

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วิธีการเก็บตัวอย่างและการสกัดดีเอ็นเอตัวอย่างของซี harmani ได้รวบรวมจาก Nagqu ในพื้นที่ในธิเบต จีน และตัวอย่างใบสำคัญถูกฝากในสถาบันสัตววิทยา มหาวิทยาลัยส่านซีทีวีC. mantchuricum และ C. crossoptilon ถูกเก็บรวบรวมจากสวนสัตว์ปักกิ่ง และตัวอย่างได้รับจากคอลเลกชันตัวอย่างนกของชาติสัตว์สถาบันพิพิธภัณฑ์ สถาบันสัตววิทยา จีนวิทยาศาสตร์ คอลเลกชันที่อยู่ภายใต้ใบอนุญาตจากกรมป่าไม้ และตามชาติกฎหมายอนุรักษ์สัตว์ป่าในประเทศจีน สัตว์ไม่มีชีวิตได้ดำเนินการทดลองในงานวิจัยปัจจุบันตัวอย่างทั้งหมดถูกเก็บรักษาไว้ในเอทานอล 100% และเก็บไว้ที่ −20 องศาเซลเซียส รวม genomic DNA ที่สกัดจากเนื้อเยื่อกล้ามเนื้อ/ตับใช้วางมาตรฐาน /คลอโรฟอร์มวิธี [16]ขยาย PCR และลำดับPCRs ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขต่อไปนี้2 นาที denaturation เริ่มต้นที่ 93° C, 40 รอบของ:denaturation s 10 ที่ 92° C, 30 s การอบเหนียวที่ 58-53° Celongation 10 นาทีที่ 68° C ในเบื้องต้นรอบ 20denaturation s 10 ที่ 92° C และ 30 s การอบเหนียวที่ 53° Cและ elongation 10 นาทีที่ 68° C ด้วย 20 s ต่อวงจรเพิ่มขั้นตอน elongation ในรอบ 20 แผ่น และสุดท้ายเบอร์ 7 นาทีที่ 68 องศาเซลเซียส Amplifications ที่ได้ดำเนินการใน 15 μL ปฏิกิริยาประกอบด้วยΜL 2.4 ของ dNTPs 2.5 mM, μL 2.1 แต่ละพื้นที่ 10ΜΜ μl 1.5 ของ PCR ใน LA 10 กันชนผม (Mg2 + -ฟรี), 1.5 μL25 มม. MgCl2, 0.18 μL 5, μL 1 ของดีเอ็นเอต้นแบบU/μl ลา Taq พอลิเมอเรส (Takara ต้าเหลียน จีน) และDdH2O 4.22 μLลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับขยาย PCRและลำดับของยีน mitochondrialได้ มีการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อยจาก Sorenson (2003) [17](เพิ่มเติมแฟ้ม 1) มี mitogenome ของ C. harmaniขยายในเจ็ดส่วนและช่องว่างอยู่ระหว่างกาลใช้ไพรเมอร์อื่นติด ผลิตภัณฑ์ PCR ได้บริสุทธิ์ใช้ชุดอุปกรณ์สกัดเจลของ Agarose DNA (Biotekeปักกิ่ง จีน) หลังจากคัดแยกโดย electrophoresis ในการ0.8% agarose เจ หลังจากการแยกและทำให้บริสุทธิ์ การผลิตภัณฑ์ PCR ถูกเรียงลำดับ โดย Sangon เทคโนโลยีชีวภาพ(เซี่ยงไฮ้) Co., LTD. โดยใช้วิธีการเดินพื้นC. mantchuricum และ C. crossoptilon mitogenomesได้ขยายเป็น 12 หรือ 13 ชิ้นส่วนเล็ก ๆ และจัดลำดับใช้ Illumina Hiseq2000 สูงสูงเซินเจิ้น Huada ยีนเทคโนโลยีระบบการจัดลำดับCo., ltd ช่องว่างในการชุมนุมหลังจากอัตราความเร็วสูงลำดับที่กรอกโดยลำดับโดยตรงลักชัวรี่ 3730 DNA sequencer โดย Sangon ชีวภาพ (เซี่ยงไฮ้)Co., LTD. ใช้ไพรเมอร์ PCR อยู่ติดกันวิเคราะห์รหัสและกลุ่มยีนใช้ชุดวิเคราะห์ลำดับ Staden [18]ลำดับประกอบและคำอธิบายของ C. harmanimitogenome แอสเซมบลีจีโนมที่สมบูรณ์สำหรับการmitogenomes C. mantchuricum และ C. crossoptilonได้ดำเนินการโดยใช้ซอฟต์แวร์สบู่ de novoระบุยีน tRNA ที่ส่วนใหญ่ใช้ tRNAscan SE1.21 [19] ภายใต้โหมดการค้นหา 'เท่านั้น tRNAscan' ด้วยรหัสพันธุกรรม mitochondrial หลอด และ ' มิโตะ /คลอโรพลาสต์ ' แหล่งที่มา รหัสโปรตีนยีน (PCGs),ยีนที่เหลือ putative tRNA และ rRNA ยีนที่ไม่ได้ระบุ โดย tRNAscan SE ระบุโดยลำดับการเปรียบเทียบกับ Galliformes อื่น ๆสายพันธ์ โครงสร้างรองของ rrnS ของ Crossoptilonคาดว่า ตามโครงสร้างของ Gallus gallusและ platyrhynchos อนัสได้จากการเปรียบเทียบอาร์เอ็นเอเว็บ (CRW) [20], และ Pseudopodoces humilis(ตอนนี้เป็นคอมเพล็กซ์ปารัส humilis) โครงสร้าง [16] RrnL รองโครงสร้างถูกทำนายตามโครงสร้างของ Xenopus laevis ได้จากฐานข้อมูลของ CRWราศีพฤษภบอส [21] และโครงสร้าง P. humilis [16] ที่ซอฟต์แวร์ RNAstructure ถูกใช้เพื่อระบุ และวาดโครงสร้างรองเป็นไปได้ในเดียวควั่นภูมิภาคที่ควบคุม จนนิวคลีโอไทด์ของการanalysed mitogenomes และกรดอะมิโนข้อมูลใช้ 4.1 ร็อค [22] จัดลำดับแนวพร้อม mitogenomes ทั้งหมดที่ได้รับนี้ศึกษา มีใช้ลำดับในการ phylogenetic Galliformes 42วิเคราะห์ รวมทั้งสอง outgroups (Numidameleagris ก Alectura lathami) ลำดับดีเอ็นเอของมีชนิดอื่น ๆ ที่ใช้ในวิเคราะห์ phylogeneticดาวน์โหลดจาก GenBank (หมายเลขทะเบียน และคีย์ข้อมูลจะแสดงในแฟ้มเพิ่มเติม 2) ที่ยีนที่ tRNA และ rRNA และ CR ได้แต่ละจัด ClustalX 1.83 [23] ด้วยการตั้งค่าเริ่มต้นทั้งหมด 13 รหัสโปรตีนยีนที่ถูกแปลเป็นกรดอะมิโน และการจัดตำแหน่งด้วย 4.1 ร็อค [22]เริ่มต้นพารามิเตอร์สำหรับแต่ละยีน และสุดท้าย retranslatedเป็นลำดับของนิวคลีโอไทด์วิเคราะห์ phylogenetic ของ PhasianidaeDatasets ที่ประกอบด้วยยีนที่ 13 รหัสโปรตีน (PCG) และมียีนทั้งหมด 37 พร้อมภาคควบคุม (mitogenome)ใช้ในการศึกษาความสัมพันธ์ของ phylogeneticPhasianidae วิเคราะห์ phylogenetic ยึดนิวคลีโอไทด์ลำดับที่ดำเนินการโดยใช้ PAUP * 4.0b10 สำหรับการวิธีสูงสุด parsimony (MP) [24], RAxML 7.0.3ความเป็นไปได้สูงสุด (มล) [25] และ MrBayes 3.1.2สำหรับทฤษฎีข้อ (BI) [26] สำหรับวิเคราะห์ ML และ BIรูปแบบของนิวคลีโอไทด์ต่อลำดับ datasetsถูกประเมินอย่างอิสระใช้ AICc MrModeltest2.2[27] ดีสุดเหมาะสมกับรุ่น GTR + I + G ถูกเลือกโอกาสและทฤษฎีวิเคราะห์ ฉันทามติสร้างแผนภูมิสำหรับการวิเคราะห์ MP ภายใต้ส่วนใหญ่กฎการ ความน่าเชื่อถือของ clades ในต้นไม้ phylogeneticถูกประเมิน โดยการเริ่มต้นระบบกิจกรรม (BSP) คำนวณใช้ 1000 เหมือนกับ สุ่มบวกสำหรับแต่ละ bootstrapทำซ้ำ เริ่มต้นระบบสนับสนุน 1000 เหมือนกับถูกนอกจากนี้ยัง ดำเนินการในการวิเคราะห์มล มีการวิเคราะห์ทฤษฎีMarkov โซ่มอน Carlo สุ่มถูกเรียกใช้รุ่น 1000000 บันทึกต้นไม้ทุกรุ่น 100เย็นที่หนึ่งและสามร้อนโซ่ และเขียนในกำหนดเวลา โดยเวลาบรรจบกันของการคะแนนความเป็นไปได้ กิจกรรมหลังทฤษฎี(BPP) ได้ประเมินในฉันทามติกฎส่วนใหญ่ 50%ต้นไม้ต้นไม้ที่เหลือเราตรวจสอบประสิทธิภาพการทำงานของยีนแต่ละตัว และdatasets ยึดนิวคลีโอไทด์ ดำเนินวิเคราะห์ PBSโปรแกรมรวม TreeRot.v3 [28] และPAUP * 4.0b10 [24] ใช้สำหรับ datasets ดังต่อไปนี้วิเคราะห์: 13 รหัสโปรตีนยีน rrnS, rrnL, CR พาร์ทิ ชันครั้งแรก สอง และสาม codons ของ PCG การสาม tRNA ยีนคลัสเตอร์ (IQM, WANCY และ HSL), ATPค็อกซ์ (atp6 + atp8), (cox1 และ cox2 + cox3) และ NADH(nad1 + nad2 + nad3 + nad4 + nad4L + nad5 + nad6)ใช้ในการคำนวณที่แพร์ไวส์ 4.1 ร็อค [22]ระยะห่างทางพันธุกรรมสำหรับสปีชีส์ Crossoptilon สี่ด้วยค่าเริ่มต้นพารามิเตอร์ Mitogenome การจัดข้อมูลและ 4เดียวยีน (nad2, CR, cytb และ rrnS) ได้รับจากGenBank (เพิ่มเติมไฟล์ 3) ใช้ในการคำนวณการระยะทางพันธุกรรม ยีนเหล่านี้ถูกจัดโดดเดี่ยว และสามารถปรับความยาวลำดับที่สอดคล้องกันด้วยตนเองเวลา divergence Crossoptilon เน้นประเมินพร้อมกับชุดข้อมูล PCG ได้รับในการศึกษานี้ 42ใช้ประเมินการ divergence Galliformes ลำดับเวลาพันธุ์ Crossoptilon การ divergenceเวลา Crossoptilon พันธุ์ถูกคำนวณโดยใช้การทฤษฎีกระบวนการนำมาใช้ในสัตว์ v. 1.7.2[29,30] การใช้นาฬิกาผ่อน ด้วยราคาที่สอดคล้องมีการบันทึกการแจกแจงปกติ [31] GTR ฉัน + Gแบบจำลองและเทศกาลคริสต์มาสที่ก่อนหน้านี้ถูกใช้ในการวิเคราะห์ ที่การปรับเทียบคะแนนถูกใช้แสดงระเบียนฟอสก้านที่แยก Numididae Phasianidae ที่ 50 – 54Mya (ล้านปี) [32]; Arborophila rufipectus divergedจากเชื้อชาติอื่นใน Galliformes สถานMya 39 [33]; Coturnix Gallus แบ่งที่ 35 Mya [34-36]ใช้ผลลัพธ์ของการรันรุ่น 10 ล้านหลังจากการเผาไหม้ใน 100การวิเคราะห์คาและ Ksเพื่อเข้าใจวิวัฒนาการในระดับดีเอ็นเอและบทบาทของตัวเลือกในสายพันธุ์ Crossoptilon 4เราได้ทดแทน nonsynonymous และพ้องราคาที่ใช้ Kaks_calculator 2.0 [37] 6กลุ่ม [C. harmani C. mantchuricum (C.har-C.man),Mantchuricum ซีซี (C.man-C.cro), crossoptilon ค. harmani-C. crossoptilon (C.har-C.cro), harmani ซีซี auritum(C.har-C.aur), mantchuricum ซีซี auritum (C.คน-C.aur), และ C. crossoptilon-c auritum (C.cro C.aur)] อัตราส่วนของอัตราทดแทน nonsynonymous(Ka) เพื่อทดแทนพ้อง (Ks) อย่างกว้างขวางใช้อัตราเป็นตัวบ่งชี้ความดันที่ใช้ในระดับลำดับระหว่างสายพันธุ์ต่าง ๆ มันเป็นที่ยอมรับกันโดยทั่วไปที่Ka > Ks, Ka = Ks และคะ < Ks โดยทั่วไปจะแสดงค่าบวกการเลือก การกลายพันธุ์เป็นกลาง และ เลือกลบ ตามลำดับ[38,39] การคำนวณกา Ks และ Ka/Ks การเลือกรูปแบบวิธีการหาค่าเฉลี่ย วิธีนี้มีรุ่น 14 แตกต่างกันสำหรับการคำนวณ และได้รับค่าเฉลี่ย การกา เอส เอส Ka [37] ในทางพันธุกรรมรหัสที่เลือกถูก ' กระดูกสันหลัง mitochondrialรหัส ' การศึกษาต่อ ความดันเลือกดำเนินการแต่ละยีนโปรตีนรหัสใน Crossoptilonใช้ในการค้นหาเว็บไซต์ CodeML ในซอฟต์แวร์ PAMLX [40]ภายใต้ความดันเลือกที่แข็งแรง โครงสร้างรองทำการวิเคราะห์กรดอะมิโนโดยการออนไลน์ซอฟต์แวร์ TOPCONS [4

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วิธีการเก็บตัวอย่างและการสกัดดีเอ็นเอตัวอย่างHarmani ซีที่ถูกเก็บรวบรวมจาก Nagqu พื้นที่ในทิเบตจีนและตัวอย่างบัตรกำนัลฝากในสถาบันสัตววิทยามณฑลส่านซีมหาวิทยาลัย; ซี mantchuricum และ C crossoptilon ถูกเก็บรวบรวมจากสวนสัตว์ปักกิ่งและกลุ่มตัวอย่างที่ได้รับจากคอลเลกชันตัวอย่างนกของสวนสัตว์แห่งชาติพิพิธภัณฑ์สถาบันสัตววิทยาจีนAcademy of Sciences คอลเลกชันที่อยู่ภายใต้ใบอนุญาตจากกรมป่าไม้และสอดคล้องกับชาติกฎหมายอนุรักษ์สัตว์ป่าในประเทศจีน ไม่มีที่อยู่อาศัยของสัตว์ทดลองในการวิจัยในปัจจุบัน. ทั้งหมดตัวอย่างที่ถูกเก็บรักษาไว้ในเอทานอล 100% และเก็บไว้ที่-20 ° C ดีเอ็นเอจีโนมทั้งหมดที่ถูกสกัดจากตับ / เนื้อเยื่อของกล้ามเนื้อโดยใช้มาตรฐานฟีนอล / วิธีคลอโรฟอร์ม [16]. ขยาย PCR และลำดับPCRs ได้ดำเนินการภายใต้เงื่อนไขดังต่อไปนี้2 นาที denaturation เริ่มต้นที่ 93 องศาเซลเซียส 40 รอบ: 10 denaturation s ที่ 92 ° C, 30 วินาทีหลอมที่ 58-53 องศาเซลเซียสการยืดตัว10 นาทีที่ 68 ° C ในเบื้องต้น 20 รอบและ10 วินาที denaturation ที่ 92 ° C, 30 วินาทีการอบที่ 53 องศาเซลเซียสและ10 นาที การยืดตัวที่ 68 ° C 20 วินาทีต่อรอบเพิ่มไปยังขั้นตอนการยืดตัวที่ประสบความสำเร็จในรอบ20 และในที่สุดก็ขยายเวลา7 นาทีที่ 68 ° C เครื่องขยายเสียงได้ดำเนินการใน 15 ปฏิกิริยาไมโครลิตรที่มี 2.4 ไมโครลิตร 2.5 มิลลิ dNTPs 2.1 ไมโครลิตรของไพรเมอร์แต่ละ 10 μΜ 1.5 ไมโครลิตร 10 × LA PCR บัฟเฟอร์ฉัน (Mg2 + ฟรี) 1.5 ไมโครลิตร25 มิลลิ MgCl2 1 ไมโครลิตรของ แม่แบบดีเอ็นเอ 0.18 ไมโครลิตร 5 U / ไมโครลิตร LA โพลิเมอร์ Taq (Takara ต้าเหลียนประเทศจีน) และ4.22 ไมโครลิตร ddH2O. ลำดับของไพรเมอร์ที่ใช้สำหรับการขยาย PCR และลำดับของยีนยลได้ที่ได้รับจากโซเรน (2003) [17] ที่มีการเปลี่ยนแปลงเล็กน้อย (แฟ้มเพิ่มเติม 1) mitogenome ซี Harmani ถูกขยายในเจ็ดส่วนและช่องว่างที่ถูกสะพานโดยใช้ไพรเมอร์ที่อยู่ใกล้เคียงอื่นๆ ผลิตภัณฑ์ PCR ถูกทำให้บริสุทธิ์โดยใช้เจลAgarose สกัดดีเอ็นเอ Kit (Bioteke, ปักกิ่ง, จีน) หลังจากที่แยกจากอิเล็กบน0.8% agarose เจล หลังจากการแยกและการทำให้บริสุทธิ์ของผลิตภัณฑ์ PCR โดยมีลำดับขั้นตอน Sangon ไบโอเทค (Shanghai) Co. , LTD โดยใช้วิธีการรองพื้น-การเดิน. mantchuricum ซีและซี crossoptilon mitogenomes ถูกขยายใน 12 หรือ 13 ชิ้นและลำดับถูกดำเนินการโดยใช้Illumina Hiseq2000 สูงผ่านระบบการจัดลำดับของเซินเจิ้นHuada ยีนเทคโนโลยีจำกัด ช่องว่างในการชุมนุมหลังจากที่สูงผ่านลำดับที่เต็มไปด้วยลำดับโดยตรงโดยใช้ซีเควนดีเอ็นเอABI 3730 โดย Sangon ไบโอเทค (Shanghai) Co. , LTD. โดยใช้ไพรเมอร์ที่อยู่ติดกัน PCR. บัตรประจำตัวของยีนและการวิเคราะห์จีโนมแพคเกจการวิเคราะห์ลำดับ Staden [ 18] ถูกนำมาใช้สำหรับการชุมนุมลำดับและคำอธิบายประกอบซีHarmani mitogenome ประกอบจีโนมที่สมบูรณ์แบบสำหรับmitogenomes ซี mantchuricum และ C crossoptilon ถูกดำเนินการโดยใช้ซอฟแวร์เดอ SOAP โนโวได้. ยีน tRNA ส่วนใหญ่ระบุการใช้ tRNAscan-SE 1.21 [19] ภายใต้ 'tRNAscan เท่านั้น' โหมดการค้นหาด้วยยลเลี้ยงลูกด้วยนมรหัสพันธุกรรมและ 'โตะ / chloroplast' แหล่งที่มา ยีนโปรตีนเข้ารหัส (PCGS) ยีน rRNA และยีนสมมุติ tRNA ที่เหลือที่ไม่ได้ถูกระบุtRNAscan-SE ที่ถูกระบุโดยเปรียบเทียบกับคนอื่นๆ ตามลำดับรอมส์สปีชีส์ โครงสร้าง rrnS รองของ Crossoptilon เป็นที่คาดการณ์บนพื้นฐานของโครงสร้างของกางเกงกางเกงและ Anas platyrhynchos ที่ได้รับจากการเปรียบเทียบ RNA เว็บ (CRW) [20] และ Pseudopodoces humilis (ตอนนี้เป็น Parus humilis) โครงสร้าง [16] rrnL รองโครงสร้างเป็นที่คาดการณ์บนพื้นฐานของโครงสร้างของXenopus laevis ที่ได้รับจากฐานข้อมูล CRW, ราศีพฤษภ [21] และพี humilis โครงสร้าง [16] ซอฟต์แวร์ RNAstructure ถูกใช้ในการระบุและวาดโครงสร้างทุติยภูมิที่มีศักยภาพในเดียวควั่นภูมิภาคควบคุม องค์ประกอบเบื่อหน่ายของmitogenomes และข้อมูลกรดอะมิโนที่ได้มาวิเคราะห์โดยใช้MEGA 4.1 [22] .Sequence การจัดแนวพร้อมกับทั้งmitogenomes ได้รับในการศึกษา42 รอมส์ลำดับที่ถูกนำมาใช้ในสายวิวัฒนาการการวิเคราะห์รวมทั้งสองoutgroups (Numida meleagris และ Alectura lathami ) ลำดับดีเอ็นเอของสายพันธุ์อื่น ๆ ที่ใช้ในการวิเคราะห์สายวิวัฒนาการที่ถูกดาวน์โหลดจากGenBank (ตัวเลขเข้าและข้อมูลที่สำคัญที่แสดงอยู่ในแฟ้มเพิ่มเติม2) ยีน tRNA และ rRNA และ CR ถูกเป็นรายบุคคลชิดโดยใช้ClustalX 1.83 [23] กับการตั้งค่าเริ่มต้น. ทั้งหมด 13 ยีนโปรตีนเข้ารหัสแปลเป็นกรดอะมิโนและสอดคล้องแล้วใช้MEGA 4.1 [22] กับพารามิเตอร์เริ่มต้นสำหรับยีนแต่ละและในที่สุดก็ retranslated ลงในลำดับเบส. การวิเคราะห์วิวัฒนาการของนกกระทาชุดข้อมูลที่มี 13 ยีนโปรตีนเข้ารหัส (PCG) และทั้งหมด37 ยีนบวกภูมิภาคควบคุม (mitogenome) ถูกนำมาใช้ในการศึกษาความสัมพันธ์ของสายวิวัฒนาการภายในนกกระทา การวิเคราะห์วิวัฒนาการขึ้นอยู่กับเบื่อหน่ายลำดับได้รับการดำเนินการโดยใช้ PAUP * 4.0b10 สำหรับความประหยัดสูงสุด(MP) วิธีการ [24], RAxML-7.0.3 สำหรับโอกาสสูงสุด (ML) [25] และ MrBayes 3.1.2 สำหรับการอนุมานแบบเบย์ (BI) [26] สำหรับ ML และวิเคราะห์ BI, รูปแบบของชุดข้อมูลลำดับเบสตัดแบ่งการประเมินเป็นอิสระในการใช้ AICC MrModeltest2.2 [27] พอดี GTR แบบที่ดีที่สุด + I + G ได้รับการแต่งตั้งให้โอกาสและการวิเคราะห์แบบเบย์ ฉันทามติต้นไม้ถูกสร้างขึ้นสำหรับการวิเคราะห์ MP ภายใต้ส่วนใหญ่กฎ ความน่าเชื่อถือของ clades ในต้นไม้ได้รับการประเมินโดยน่าจะบูต(BSP) คำนวณโดยใช้1000 ซ้ำด้วยนอกเหนือสุ่มสำหรับแต่ละบูตซ้ำ 1000 ซ้ำสนับสนุนบูตได้ยังดำเนินการในการวิเคราะห์ML การวิเคราะห์แบบเบย์ที่มีห่วงโซ่มาร์คอฟสุ่มตัวอย่าง Monte Carlo ถูกใช้สำหรับ 1000000 รุ่นประหยัดต้นไม้ทุก ๆ 100 รุ่นหนึ่งที่หนาวเย็นและสามโซ่ร้อนและการเผาไหม้ในเวลาที่ถูกกำหนดโดยเวลาในการบรรจบกันของความน่าจะเป็นคะแนน ความน่าจะเป็นหลังแบบเบย์(BPP) อยู่ที่ประมาณในเสียงข้างมาก 50% ฉันทามติ. ต้นไม้ของต้นไม้ที่เหลือเราตรวจสอบประสิทธิภาพการทำงานของยีนของแต่ละบุคคลและชุดข้อมูลขึ้นอยู่กับนิวคลีโอ; วิเคราะห์พีบีเอสได้ดำเนินการในโปรแกรมรวม TreeRot.v3 [28] และ PAUP * 4.0b10 [24] ชุดข้อมูลต่อไปนี้ถูกนำมาใช้สำหรับการวิเคราะห์: 13 ยีนโปรตีนเข้ารหัส rrnS, rrnL พาร์ทิชัน CR, ครั้งแรก codons สองและสามของ PCG ที่สามกลุ่มยีนtRNA (IQM, WANCY และ HSL) เอทีพี(atp6 + atp8) , COX (cox1 + + COX2 cox3) และ NADH (nad1 nad2 + + + nad3 nad4 nad4L + + + nad5 nad6). เมกะ 4.1 [22] ถูกนำมาใช้ในการคำนวณจากจำนวนระยะทางพันธุกรรมสี่Crossoptilon สายพันธุ์ที่มีค่าเริ่มต้นพารามิเตอร์ ข้อมูลที่สอดคล้อง mitogenome และสี่ยีนเดียว(nad2, CR, cytb และ rrnS) ที่ได้รับจากGenBank (แฟ้มเพิ่มเติม 3) ถูกนำมาใช้ในการคำนวณระยะทางพันธุกรรม ยีนเหล่านี้ถูกจัดชิดโดยลำพังและได้รับการปรับเปลี่ยนให้สอดคล้องลำดับความยาวด้วยตนเอง. ประมาณการเวลาที่แตกต่างมุ่งเน้นไปที่ Crossoptilon พร้อมกับชุด PCG ที่ได้รับในการศึกษาครั้งนี้ 42 รอมส์ลำดับที่ถูกนำมาใช้ในการประเมินความแตกต่างเวลาของสายพันธุ์ Crossoptilon ความแตกต่างเวลาของสายพันธุ์ Crossoptilon ที่คำนวณโดยใช้ขั้นตอนการดำเนินการในคชกรรมBEAST v. 1.7.2 [29,30] นาฬิกาผ่อนคลายถูกนำมาใช้ที่มีอัตราการปฏิบัติมีการกระจายเข้าสู่ระบบปกติ [31] วิ่ง + I + G รูปแบบและเทศกาลคริสต์มาสก่อนถูกนำมาใช้ในการวิเคราะห์ จุดสอบเทียบอยู่บนพื้นฐานของบันทึกการแสดงฟอสซิลที่ลำต้น Numididae-แยกนกกระทาที่ 50-54 ม (ล้านปีก่อน) [32]; Arborophila rufipectus แยกจากlineages อื่น ๆ ในฟรอมรอบ39 ม [33]; นกคุ่ม-กางเกงแยกที่ 35 ม [34-36]. ผลของการทำงาน 10 ล้านคนรุ่นถูกนำมาใช้หลังจากที่มีการเผาไหม้ใน100 กา Ks และการวิเคราะห์เพื่อทำความเข้าใจวิวัฒนาการในระดับดีเอ็นเอและบทบาทของการเลือกในสี่สายพันธุ์ Crossoptilon, เราคำนวณการเปลี่ยนตัวผู้เล่น nonsynonymous ตรงกันและอัตราการใช้Kaks_calculator 2.0 [37] หกกลุ่ม[ซี Harmani-C mantchuricum (C.har-C.man) ซี mantchuricum-C crossoptilon (C.man-C.cro) harmani- ซีซี crossoptilon (C.har-C.cro) ซี Harmani-C auritum (C.har-C.aur) ซี mantchuricum-C auritum (คคนC.aur) และซี crossoptilon-C auritum (C.cro-C. aur)] อัตราส่วนของอัตราทดแทน nonsynonymous (กา) กับอัตราทดแทนความหมายเหมือนกัน (Ks) ใช้กันอย่างแพร่หลายเป็นตัวบ่งชี้ความดันเลือกในระดับลำดับที่ในหมู่ชนิดต่างๆ เป็นที่ยอมรับกันทั่วไปว่ากา> Ks, Ka = Ks และกา <Ks โดยทั่วไปแสดงให้เห็นในเชิงบวกเลือกการกลายพันธุ์ที่เป็นกลางและเลือกลบตามลำดับ[38,39] ในการคำนวณกา Ks และกา / Ks เป็นวิธีการเฉลี่ยแบบจำลองได้รับเลือก วิธีการนี้รวมถึง14 รูปแบบที่แตกต่างกันสำหรับการคำนวณและการได้มาค่าเฉลี่ยสำหรับกาKs และกา / Ks [37] พันธุกรรมรหัสที่เลือกเป็น'เลี้ยงลูกด้วยนมยลรหัส' เพื่อเป็นการศึกษาความดันเลือกทำหน้าที่ในแต่ละยีนโปรตีนเข้ารหัสในประเภท Crossoptilon, CodeML ซอฟต์แวร์ PAMLX [40] ถูกนำมาใช้ในการค้นหาเว็บไซต์ภายใต้ความดันเลือกที่แข็งแกร่ง โครงสร้างรองวิเคราะห์ของกรดอะมิโนที่ได้ดำเนินการโดยใช้ออนไลน์TOPCONS ซอฟแวร์ [4