Endogenous TEV protease comprising

Endogenous TEV protease comprising N-terminal histidine tag and
the MPB-ENLYFQS-PH-G1VCA protein were gifts from the Robinson
laboratory.
2.1. Plasmid construction
Expression cassettes were made by PCR amplification of individual
genes with oligonucleotides incorporating linker extensions
which could then be joined to other genes via Splicing by Overlap
Extension (SOE). Fusion genes were inserted into expression vector
pET22 (Kan) (pET22b with ampicillin resistance cassette replaced
with kanamycin resistance) by infusion cloning. Oligonucleotide
sequences are listed in Supporting Information (Table S1).
2.2. Protease gene constructs
SplB proteases were expressed with a protein A domain fused at
the N terminus, an SplB cleavage site “WELQ” immediately preceding
the first amino acid of the mature SplB protease, and a 6X
histidine tag followed by the ARVCF peptide at the C terminus
(protein A-GGWELQ-mature SplB-His tag-ARVCF peptide). The
protein A is removed by cleavage at the “WELQ” site for a small
minority of fusion proteins during protein expression, forming
active SplB protease, which in turn cleaves more of the fusion
protein, resulting in a rapid chain reaction yielding mature SplB-His
tag-ARVCF peptide.
The Protein A open reading frame (ORF) was amplified using
oligonucleotides oSN684 and oSN1096. oSN1096 appends a
sequence coded as “GGSGKGGWEL” at the 3’ of protein A. SplB was
PCR-amplified with oSN1099 and oSN875. oSN875 appends a partial
His tag to the 3’ of SplB. oSN1099 appends a sequence complementary
to that of oSN1096, enabling SOE PCR of these two
amplicons to yield protein A-WELQ-SplB-partial His tag cassette.
Simultaneously, the pET22b (kan) vector was amplified by inverse
PCR using oSN1183 and oSN1184, which have complementary
5’ ends for infusion cloning, followed by intra-plasmid infusion
cloning (Clontech), creating a vector which has the “PQPVDSWV”
coding ARVCF peptide just downstream of the XhoI site. This vector
was then linearized with NdeI/XhoI, and the fusion ORF protein AWELQ-
SplB-partial His tag was inserted by infusion cloning
yielding protein A-WELQ-SplB-His tag-ARVCF peptide in pET22b
(Kan) vector.
The TEV-AP4 protein expression construct encoded the ORF for a
maltose binding protein (MBP)-optimal TEV cleavage site
(ENLYFQS)-TEV-GGGHHHHHHGGDSWV fusion protein. The ORF
was synthesized (Genscript) and inserted into the NdeI/XhoI sites
in pET22b vector. Note the TEV expressed incorporated the S219V
mutation to reduce autolysis [8]. The TEV protease auto-cleaves
itself from MBP after expression and is purified using the 6-
histidine tag preceding the truncated ARVCF peptide (DSWV,
indicated in bold above). The vector pRK793 [8]was used to express
histidine-tagged TEV comprising the S219V mutation.
2.3. SplB-His tag-truncated ARVCF peptide constructs
These were constructed by doing inverse PCR with the abovementioned
protein A-WELQ-SplB-His tag-ARVCF construct using
the oligonucleotides oSN1225, 1226, 1227, 1228 and 1230 with the
common reverse oligonucleotide oSN1229 to yield constructs
expressing ARVCF peptides PQPVDSWV, QPVDSWV, PVDWSV,
VDSWV and DSWV respectively.
2.4. SplB-truncated His tag-DSWV constructs
The protein A-WELQ-SplB-truncated His tag-DSWV was created

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

โปรติเอส TEV ภายนอกประกอบด้วย N-เทอร์มินัล histidine แท็ก และโปรตีน MPB ENLYFQS PH G1VCA ได้ของขวัญจากโรบินสันห้องปฏิบัติการ2.1. plasmid ก่อสร้างทำเทปนิพจน์ โดยกระบือของแต่ละคนยีนกับ oligonucleotides ที่ผสมผสานเชื่อมโยงข้อมูลส่วนขยายซึ่งสามารถแล้วสามารถเข้าร่วมกับยีนอื่น ๆ ผ่าน Splicing โดยเหลื่อมกันนามสกุล (SOE) ฟิวชั่นยีนถูกแทรกไว้ในเวกเตอร์นิพจน์pET22 (กานต์) (pET22b กับโกคอต้านเทปแทนมีความต้านทานของกานามัยซิน) โดยแช่โคลน Oligonucleotideลำดับระบุไว้ในข้อมูลสนับสนุน (ตาราง S1)2.2. สร้างยีนโปรติเอสSplB โปรตีเอสได้แสดงกับโดเมน A โปรตีนที่หลอมรวมที่เทอร์มินัส N ความแตกแยก SplB เป็นเว็บไซต์ "WELQ" ก่อนทันทีกรดอะมิโนตัวแรกของโปรติเอส SplB ผู้ใหญ่ และ 6 Xแท็ก histidine ตาม ด้วยเปปไทด์ ARVCF ที่ C terminus(โปรตีน A-GGWELQ-แม่พระ SplB แท็ก-ARVCF เปปไทด์) การโปรตีน A จะถูกเอาออก โดยความแตกแยกที่เว็บไซต์ "WELQ" สำหรับขนาดเล็กชนกลุ่มน้อยของฟิวชั่นโปรตีนในระหว่างการแสดงออกของโปรตีน ขึ้นรูปใช้งาน SplB โปรติเอส ซึ่งจะแข็งกระด้างเพิ่มเติมของฟิวชั่นโปรตีน ในปฏิกิริยาลูกโซ่อย่างรวดเร็วส่งผู้ใหญ่ของเขา SplBเปปไทด์ ARVCF แท็กเปิดอ่านโปรตีน A เฟรม (ORF) ถูกขยายโดยใช้oligonucleotides oSN684 และ oSN1096 oSN1096 ผนวกการแก้ไขลำดับเขียนเป็น "GGSGKGGWEL" ที่ 3' โปรตีน A. SplBPCR-ขยาย ด้วย oSN1099 และ oSN875 oSN875 ผนวกเป็นบางส่วนเขาแท็ก 3' ของ SplB. oSN1099 ผนวกลำดับเสริมoSN1096 ที่ทำให้ PCR SOE ของทั้งสองamplicons ให้โปรตีน A WELQ SplB บางส่วนของเขากลักแท็กพร้อมกัน pET22b เวกเตอร์ (กาญจน์) ถูกขยาย โดยผกผันPCR โดยใช้ oSN1183 และ oSN1184 ซึ่งมีความสมบูรณ์ยิ่งขึ้นปลาย 5' สำหรับการแช่โคลน ตาม ด้วยแช่ใน plasmidโคลน (Clontech) การสร้างเวกเตอร์ซึ่งมี "PQPVDSWV"รหัส ARVCF เปปไทด์เพียงปลายน้ำของเว็บไซต์ XhoI แบบเวกเตอร์นี้เป็นเส้นตรงแล้ว NdeI/XhoI และโปรตีน ORF ฟิวชั่น AWELQ-SplB บางส่วนแทรกแท็กของเขา โดยการแช่โคลนผลผลิตโปรตีนเปปไทด์แท็ก-ARVCF A-WELQ-SplB-พระใน pET22bเวกเตอร์ (กาญจน์)ก่อสร้างนิพจน์ของโปรตีน TEV AP4 ORF สำหรับการเข้ารหัสแบบโปรตีนรวม maltose (MBP) -เว็บไซต์คลินิก TEV ที่เหมาะสมโปรตีนที่ฟิวชั่น (ENLYFQS) - TEV - GGGHHHHHHGGDSWV การ ORFถูกสังเคราะห์(เจนสคริปต์) และแทรกลงในเว็บไซต์ NdeI/XhoIในเวกเตอร์ pET22b หมายเหตุ TEV ซึ่งแสดงรวมอยู่ S219Vการกลายพันธุ์เพื่อลด autolysis [8] โปรติเอส TEV แข็งกระด้างอัตโนมัติตัวเองจาก MBP หลังจากนิพจน์ และบริสุทธิ์ใช้ 6 -แท็ก histidine ก่อนเปปไทด์ ARVCF ตัด (DSWVระบุไว้ในตัวหนาข้างต้น) PRK793 เวกเตอร์ [8] ใช้แสดงติดแท็ก histidine TEV ซึ่งกลายพันธุ์ S219V2.3 SplB-พระตัดแท็กเปปไทด์ ARVCF สร้างเหล่านี้ถูกสร้างขึ้น โดยการทำ PCR ผกผันกับการดังกล่าวข้างต้นสร้างโปรตีนแท็ก-ARVCF A-WELQ-SplB-พระใช้oSN1225 oligonucleotides, 1226, 1227, 1228 และ 1230 ด้วยการสร้างทั่วไป oligonucleotide ย้อนกลับ oSN1229 ให้ผลแสดงเปปไทด์ ARVCF PQPVDSWV, QPVDSWV, PVDWSVVDSWV และ DSWV ตามลำดับ2.4. SplB-ตัดทอนเขาแท็ก DSWV สร้างโปรตีน A WELQ SplB ตัดทอนเขาแท็ก DSWV สร้าง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ภายนอกน้ำย่อย TEV ประกอบ n- ขั้วแท็กฮิสติดีนและ
โปรตีน MPB-ENLYFQS-PH-G1VCA ของขวัญจากโรบินสัน
ห้องปฏิบัติการ.
2.1 พลาสมิดก่อสร้าง
เทปการแสดงออกที่ถูกสร้างขึ้นโดยขยาย PCR ของแต่ละ
ยีนที่มีส่วนขยาย oligonucleotides ผสมผสานลิงเกอร์
ซึ่งก็อาจจะเข้ากับยีนอื่น ๆ ผ่านทาง Splicing โดยซ้อน
ส่วนต่อขยาย (SOE) ฟิวชั่นยีนที่ถูกแทรกเข้าไปในการแสดงออกเวกเตอร์
pET22 (กาญจน์) (pET22b ที่มีความต้านทาน ampicillin เทปแทนที่
มีความต้านทานต่อกานามัยซิ) โดยการแช่โคลน oligonucleotide
ลำดับมีการระบุไว้ในการสนับสนุนข้อมูล (ตาราง S1).
2.2 ยีนโปรติเอสสร้าง
โปรตีเอส SplB มีการแสดงออกที่มีโปรตีนโดเมนหลอมละลายที่
ที่อยู่ปลายทางเว็บไซต์แตกแยก SplB "WELQ" ทันทีก่อน
กรดอะมิโนครั้งแรกของน้ำย่อยผู้ใหญ่ SplB และ 6X
แท็กฮิสติดีนตามด้วยเปปไทด์ ARVCF ที่ C ปลายทาง
(โปรตีน A-GGWELQ ผู้ใหญ่ SplB เขาแท็ก ARVCF เปปไทด์)
โปรตีนถูกลบออกจากความแตกแยกที่ "WELQ" เว็บไซต์สำหรับขนาดเล็ก
ชนกลุ่มน้อยของโปรตีนฟิวชั่นในระหว่างการแสดงออกของโปรตีนสร้าง
น้ำย่อย SplB ใช้งานซึ่งในแข็งกระด้างเปิดมากขึ้นของฟิวชั่น
โปรตีนส่งผลให้เกิดปฏิกิริยาลูกโซ่อย่างรวดเร็วยอมผู้ใหญ่ SplB ของเขา
แท็ก ARVCF เปปไทด์.
โปรตีนกรอบเปิดอ่าน (ORF) ถูกขยายโดยใช้
oligonucleotides oSN684 และ oSN1096 oSN1096 ผนวก
ลำดับรหัสว่า "GGSGKGGWEL" ที่ 3 'ของโปรตีนเอ SplB ถูก
PCR-amplified กับ oSN1099 และ oSN875 oSN875 ผนวกบางส่วน
แท็กของเขาไป 3 'ของ SplB oSN1099 ผนวกลำดับประกอบ
กับที่ของ oSN1096 ช่วยให้รัฐวิสาหกิจ PCR ของทั้งสอง
amplicons ให้ผลผลิตโปรตีน A-WELQ-SplB บางส่วนเทปแท็กของเขา.
พร้อมกัน pET22b (กาญจน์) เวกเตอร์ได้รับการขยายโดยผกผัน
PCR โดยใช้ oSN1183 และ oSN1184 ซึ่ง มีเสริม
5 'สิ้นสุดลงแช่โคลนตามด้วยภายในพลาสมิดแช่
โคลน (Clontech), การสร้างเวกเตอร์ที่มี "PQPVDSWV ว่า"
การเข้ารหัส ARVCF เปปไทด์เพียงปลายน้ำของเว็บไซต์ XhoI เวกเตอร์นี้
ได้รับการเชิงเส้นแล้วกับ NdeI / XhoI และฟิวชั่น ORF โปรตีน AWELQ-
SplB บางส่วนแท็กของเขาถูกเขียนโดยแช่โคลน
ผลผลิตโปรตีน WELQ-SplB ของเขาเปปไทด์แท็ก ARVCF ใน pET22b
(กาญจน์) เวกเตอร์.
TEV- AP4 การแสดงออกของโปรตีนสร้างเข้ารหัส ORF สำหรับ
มอลโตโปรตีน (MBP) -optimal TEV เว็บไซต์แตกแยก
(ENLYFQS) -TEV-GGGHHHHHHGGDSWV โปรตีนฟิวชั่น ORF
ถูกสังเคราะห์ (เจนสคริปต์) และแทรกเข้าไปในเว็บไซต์ NdeI / XhoI
ใน pET22b เวกเตอร์ หมายเหตุ TEV แสดงรวม S219V
การกลายพันธุ์ที่จะลดการย่อยตัวเอง [8] TEV น้ำย่อยอัตโนมัติแข็งกระด้าง-
ตัวเองจาก MBP หลังจากแสดงออกและบริสุทธิ์โดยใช้ 6-
แท็กฮิสติดีนก่อนหน้านี้เปปไทด์ที่ถูกตัดทอน ARVCF (DSWV,
ที่ระบุไว้ในตัวหนาด้านบน) pRK793 เวกเตอร์ [8] ถูกนำมาใช้ในการแสดง
ฮิสติดีนที่ติดแท็ก TEV ประกอบการกลายพันธุ์ S219V.
2.3 SplB เขาแท็กตัดทอนเปปไทด์ ARVCF โครงสร้าง
เหล่านี้ถูกสร้างขึ้นโดยการทำสิ่งที่ตรงกันข้าม PCR กับมติ
โปรตีน A-WELQ-SplB ของเขาสร้างแท็ก ARVCF ใช้
oligonucleotides oSN1225, 1226, 1227, 1228 และ 1230 ที่มี
ร่วมกัน oSN1229 oligonucleotide ย้อนกลับไป โครงสร้างอัตราผลตอบแทนที่
แสดง ARVCF เปปไทด์ PQPVDSWV, QPVDSWV, PVDWSV,
VDSWV และ DSWV ตามลำดับ.
2.4 SplB-ตัดทอนของเขาแท็ก DSWV สร้าง
โปรตีน A-WELQ-SplB-ตัดทอนของเขาแท็ก DSWV ถูกสร้างขึ้น

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

โครงสร้างประกอบด้วยกรดอะมิโนฮิสติดีนที วีเอสแท็กการ mpb-enlyfqs-ph-g1vca โปรตีน คือ ของขวัญจากโรบินสันห้องปฏิบัติการ2.1 . การสร้างพลาสมิดการแสดงออกแบบสร้างโดยวิธี PCR แบบบุคคลยีนกับโอลิโกนิวคลีโอไทด์เรียกนามสกุล ลิงเกอร์ซึ่งก็จะเข้าร่วมกับยีนอื่นโดยผ่าน splicing ซ้อนกันนามสกุล ( SOE ) ยีนที่ถูกแทรกลงในฟิวชั่นเวกเตอร์การแสดงออกpet22 ( คัน ) ( pet22b กับเทปต้านทานแอมพิซิลินแทนที่กับปัจจัยต้านทาน ) โดยแช่โคลน . ซึ่งลำดับอยู่ในการสนับสนุนข้อมูล ( ตาราง S1 )2.2 . โครงสร้างยีนโปรติเอสsplb เพื่อแสดงออกกับโปรตีนโดเมนผสมที่n ปลายทาง , splb แยกออกเว็บไซต์ " welq " ทันทีก่อนกรดอะมิโนที่แรกของผู้ใหญ่ splb protease และสองเมื่อแท็กตามด้วย arvcf เปปไทด์ที่ C เทอร์มินัส( โปรตีน a-ggwelq-mature splb ของเขาแท็ก arvcf เปปไทด์ ) ที่โปรตีนจะถูกเอาออกโดยการในเว็บไซต์ " welq " เล็กๆชนกลุ่มน้อยของโปรตีนฟิวชั่นระหว่างการแสดงออกของโปรตีน จัดรูปแบบซึ่งในการเปิดใช้งาน splb โปรคลีฟส์มากกว่าของฟิวชั่นโปรตีน ส่งผลให้ผลผลิตเต็มที่ splb ของเขาอย่างรวดเร็ว ปฏิกิริยาลูกโซ่แท็ก arvcf เปปไทด์ .โปรตีนกรอบเปิดอ่าน ( ORF ) คือขยายโดยใช้โอลิโกนิวคลีโอไทด์และ osn684 osn1096 . osn1096 ต่อท้ายเป็นลำดับรหัสเป็น " ggsgkggwel " ที่ 3 ของโปรตีน splb คือ .และเทคนิคของ osn1099 osn875 . osn875 ท้ายบางส่วนของเขาแท็ก 3 " ของ splb . osn1099 ท้ายลำดับประกอบที่ osn1096 PCR ของทั้งสองให้โซamplicons ผลผลิตโปรตีน a-welq-splb-partial เทปป้ายของเขาพร้อมกัน pet22b ( กาญจน์ ) เวกเตอร์ถูกขยายโดยผกผันและสามารถใช้ osn1183 osn1184 ซึ่งประกอบ5 " สิ้นสุดสำหรับแช่โคลน ตามด้วยฉีดภายในพลาสมิดการโคลนนิ่ง ( clontech ) , การสร้างเวกเตอร์ซึ่งมี " pqpvdswv "รหัส arvcf เปปไทด์เพียงปลายน้ำของ xhoi เว็บไซต์ เวกเตอร์นี้แล้วช่วงที่มี ndei / xhoi และฟิวชั่น ORF awelq - โปรตีนsplb บางส่วนของเขาถูกแทรกโดยการใช้แท็กผักที่มีโปรตีนเปปไทด์ใน pet22b arvcf a-welq-splb-his แท็ก( คัน ) เวกเตอร์การ tev-ap4 การแสดงออกโปรตีนสร้างการเข้ารหัส ORF สำหรับน้ำตาลโปรตีน ( MBP ) เหมาะสม tev แยกออกเว็บไซต์( enlyfqs ) - โปรตีน tev-ggghhhhhhggdswv . โดย ORFสังเคราะห์ ( genscript ) และแทรกลงใน ndei / xhoi เว็บไซต์เวกเตอร์ฟรี pet22b . หมายเหตุ ที วี แสดงรวมอยู่ s219vการลดการส่งผ่าน [ 8 ] วันที วีเอส ออโต้ คลีฟส์ตัวเองจาก MBP หลังจากการแสดงความคิดเห็นและบริสุทธิ์ใช้ 6 -เมื่อแท็กก่อนตัด arvcf ( dswv เปปไทด์ ,ที่ระบุไว้ในตัวหนาข้างบน ) เวกเตอร์ที่ prk793 [ 8 ] ใช้แสดงเมื่อแท็ก tev ประกอบด้วย s219v กลายพันธุ์2.3 splb แท็กของเขาตัด arvcf เปปไทด์โครงสร้างเหล่านี้ถูกสร้างขึ้นโดยการทำ PCR ด้วยดังกล่าวข้างต้นผกผันโปรตีน a-welq-splb-his arvcf สร้างโดยใช้แท็กที่ผม 1227 osn1225 โอลิโกนิวคลีโอไทด์ , , , แล้วตอนนี้กับทั่วไปย้อนกลับ ซึ่ง osn1229 ผลผลิตโครงสร้างแสดง arvcf เปป pqpvdswv qpvdswv pvdwsv , , ,และ vdswv dswv ตามลำดับ2.4 . splb ตัดทอน dswv ของเขาสร้างแท็กโปรตีน a-welq-splb-truncated dswv แท็กของเขาถูกสร้างขึ้น