RESULTSInducibility of the peg oper

RESULTS
Inducibility of the peg operon
Six DNA fragments of the genes in the cluster (pegB, C, D, A,
E and R) were used as probes for RNA dot-blot hybridization
analysis. The six genes were expressed in PEG medium, but
not in EG medium, showing that they were inducible by PEG
4000 but not by EG (Fig. 1a). The transcripts of each gene
were also detected by RT-PCR using gene-specific primers
(Fig. 1b). RT-PCRs gave amplified products with the same
size as the normal PCR products using genomic DNA as a
template. Negative controls prepared by omitting the
reverse-transcription step gave no detectable band, showing
no detectable contamination of DNA in the RNA samples.
The RT-PCR products were only found in the RNA samples
from PEG 4000-grown cells. Next, we designed primers to
amplify the intergenic regions of the adjacent genes, using the
RT-PCR technique. Four intergenic regions between
adjacent genes (pegB, C, D, A and E) were amplified
(Fig. 1c) from the RNA samples of the PEG 4000-grown
cells. These results suggest that five of the genes (pegB, C,D, A
and E) form an operon. Comparison of cells grown on EG
and PEG 4000 showed that expression of the pegBCDAE
operon and pegR was induced by PEG.
Transcriptional analysis of promoter regions for
the pegBCDAE operon
In order to study the promoter activity of the pegBCDAE
operon, we cloned the upstream regions of pegB, pegA and
pegR into the broad-host-range vector pQF50. In all media
tested, b-galactosidase activity was detected in both S.
macrogoltabida strain 103 and E. coli K-12 MC4100 without
pQF50. Basal expression levels of a promoterless pQF50
showed 7–15 Miller units in E. coli and less than 84 Miller
units in S. macrogoltabida strain 103 (Table 1). More than
1?9-fold levels of b-galactosidase activity were detected in
the cells harbouring pQF50pB1 grown on all the media
except EG. This result suggests that the transcription of the
pegBCDAE operon starts from the pegB promoter, induced
by oligomers of PEG 4000. Higher activity was also detected
in E. coli harbouring pQF50pB1, implying a highly
functional promoter even in E. coli. In strain 103, expression
of the pegA and pegR promoters carried on pQF50pA and
pQF50pR was induced by PEG 4000, suggesting that these
PEG-responsive promoters might be regulated by PEGresponsive
regulators. In E. coli harbouring pQF50pA, bgalactosidase
activity could not be detected even in the
presence of PEG 4000. This result suggests that a PEGresponsive
regulator for pegA must exist in strain 103 but
not in E. coli.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ผลลัพธ์Inducibility ของ operon ตรึง6 ชิ้นส่วนดีเอ็นเอของยีนในคลัสเตอร์ (pegB, C, D, AE และ R) ถูกใช้เป็นคลิปปากตะเข้ในอาร์เอ็นเอจุดคืนในตา hybridizationวิเคราะห์ ยีนหกถูกแสดงใน PEG แต่ไม่ใน EG แสดงว่า พวก inducible โดย PEG4000 แต่ไม่ใช่ โดย EG (Fig. 1a) ใบแสดงผลของแต่ละยีนนอกจากนี้ยังตรวจพบ โดย RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์ของยีนเฉพาะ(Fig. 1b) RT PCRs ให้ผลิตภัณฑ์เอาต์ ด้วยเหมือนกันขนาดเป็นผลิตภัณฑ์ PCR ปกติใช้ genomic DNA เป็นการแม่แบบ ลบตัวควบคุมโดยละเว้นการขั้นตอนการ transcription กลับให้วงไม่สามารถตรวจสอบได้ แสดงไม่ปนตรวจดีเอ็นเอในตัวอย่างอาร์เอ็นเอเพียงพบผลิตภัณฑ์ RT-PCR ในตัวอย่างอาร์เอ็นเอจากโต 4000 ตรึงเซลล์ ถัดไป เราออกแบบไพรเมอร์เพื่อขยายภูมิภาค intergenic ของยีนที่อยู่ติดกัน ใช้การเทคนิค RT-PCR 4 ภาค intergenic ระหว่างยีนที่อยู่ติดกัน (pegB, C, D, A และ E) ได้ขยายกิน 1c) จากตัวอย่างอาร์เอ็นเอของการตรึง 4000 โตเซลล์ ผลลัพธ์เหล่านี้แนะนำที่ห้าของยีน (pegB, C, D, Aและ E) แบบ operon มี เปรียบเทียบเซลล์ที่เติบโตบน EGและตรึง 4000 แสดงให้เห็นว่าค่าของการ pegBCDAEoperon และ pegR ถูกเหนี่ยวนำ โดย PEGโปรโมเตอร์ภูมิภาคสำหรับวิเคราะห์ transcriptionalpegBCDAE operonเพื่อศึกษากิจกรรมโปรโมเตอร์ของ pegBCDAEoperon เรา cloned แคว้น pegB, pegA ขั้นต้นน้ำ และpegR เป็น pQF50 ช่วงกว้างโฮสต์เวกเตอร์ ในสื่อทั้งหมดทดสอบ บี-galactosidase กิจกรรมพบทั้ง s ได้103 และ E. coli MC4100 K-12 โดยสายพันธุ์ macrogoltabidapQF50 นิพจน์โรคระดับของ promoterless pQF50พบหน่วยมิลเลอร์ 7 – 15 ใน E. coli และมิลเลอร์น้อยกว่า 84หน่วยใน S. macrogoltabida สายพันธุ์ 103 (ตาราง 1) มากกว่า1 ? 9-fold ระดับของกิจกรรม b-galactosidase พบในเซลล์ harbouring pQF50pB1 ปลูกในสื่อทั้งหมดยกเว้น EG ผลลัพธ์นี้แนะนำที่ในการpegBCDAE operon เริ่มจากโปรโมเตอร์ pegB เกิดโดย oligomers ของตรึง 4000 นอกจากนี้ยังพบกิจกรรมสูงใน E. coli harbouring pQF50pB1 หน้าที่เป็นอย่างมากโปรโมเตอร์ทำงานแม้ใน E. coli ในสายพันธุ์ 103 นิพจน์ก่อ pegA และ pegR ที่ดำเนินการใน pQF50pA และpQF50pR ถูกเหนี่ยวนำ โดยตรึง 4000 แนะนำที่นี่อาจควบคุมก่อ PEG ตอบ โดย PEGresponsiveเร็คกูเลเตอร์ ใน E. coli harbouring pQF50pA, bgalactosidaseกิจกรรมไม่พบแม้แต่ในการสถานะของตรึง 4000 ผลลัพธ์นี้แนะนำที่เป็น PEGresponsiveควบคุมสำหรับ pegA ต้องมีอยู่ในต้องใช้ 103 แต่ไม่ใน E. coli

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ผล
Inducibility ของ operon ตรึง
หกชิ้นส่วนดีเอ็นเอของยีนในคลัสเตอร์ (pegB, C, D, A,
E และ R) ถูกนำมาใช้เป็นโพรบสำหรับอาร์เอ็นเอพันธุ์ดอท blot
การวิเคราะห์ หกยีนมีการแสดงออกในสื่อ PEG แต่
ไม่ได้อยู่ในกลาง EG แสดงให้เห็นว่าพวกเขาถูกกระตุ้นโดย PEG
4000 แต่ไม่ EG (รูป. 1a) ใบรับรองผลการเรียนของแต่ละยีน
ถูกตรวจพบโดย RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์ยีนที่เฉพาะเจาะจง
(รูป. 1b) RT-PCRs ให้ขยายผลิตภัณฑ์เดียวกับที่
ขนาดเป็นผลิตภัณฑ์ PCR ปกติโดยใช้ดีเอ็นเอเป็น
แม่แบบ การควบคุมเชิงลบที่จัดทำโดยเลี่ยง
ขั้นตอนที่ย้อนกลับถอดความไม่ได้ให้วงดนตรีที่ตรวจพบการแสดง
ไม่มีการปนเปื้อนที่ตรวจพบดีเอ็นเออาร์เอ็นเอในตัวอย่าง.
ผลิตภัณฑ์ RT-PCR พบเฉพาะในตัวอย่าง RNA
จาก PEG เซลล์ 4000 ปลูก ต่อไปเราได้รับการออกแบบไพรเมอร์เพื่อ
ขยายภูมิภาค intergenic ของยีนที่อยู่ติดกันโดยใช้
เทคนิค RT-PCR สี่ภูมิภาค intergenic ระหว่าง
ยีนที่อยู่ติดกัน (pegB, C, D, และ E) ถูกขยาย
(รูป. 1 c) จากตัวอย่างอาร์เอ็นเอของ PEG 4000 ปลูก
เซลล์ ผลการศึกษานี้แสดงให้เห็นว่าห้าของยีน (pegB, C, D,
และ E) รูปแบบ operon เปรียบเทียบของเซลล์ที่ปลูกใน EG
และ PEG 4000 แสดงให้เห็นว่าการแสดงออกของ pegBCDAE
operon และ pegR ถูกชักนำโดย PEG.
การวิเคราะห์การถอดรหัสพันธุกรรมของภูมิภาคก่อการสำหรับ
operon pegBCDAE
เพื่อศึกษากิจกรรมก่อการ pegBCDAE
operon เราโคลนภูมิภาคเหนือ pegB, PEGA และ
pegR เข้าไปในวงกว้างเป็นเจ้าภาพช่วง pQF50 เวกเตอร์ ในทุกสื่อ
การทดสอบกิจกรรม B-galactosidase ถูกตรวจพบในทั้งสองเอส
สายพันธุ์ macrogoltabida 103 และ E. coli K-12 โดยไม่ต้อง MC4100
pQF50 ระดับการแสดงออกของฐาน pQF50 promoterless
แสดงให้เห็นว่าหน่วย 7-15 มิลเลอร์ในเชื้อ E. coli และน้อยกว่า 84 มิลเลอร์
หน่วยในสายพันธุ์เอส macrogoltabida 103 (ตารางที่ 1) มากกว่า
1 9 เท่าระดับของกิจกรรม B-galactosidase ถูกตรวจพบใน
เซลล์เก็บงำ pQF50pB1 เติบโตในทุกสื่อ
ยกเว้น EG ผลที่ได้นี้แสดงให้เห็นว่าการถอดความจาก
operon pegBCDAE เริ่มจากการก่อการ pegB ชักนำ
โดย oligomers ของ PEG 4000 กิจกรรมที่สูงขึ้นนอกจากนี้ยังได้รับการตรวจพบ
เชื้อ E. coli ในเก็บงำ pQF50pB1 หมายความสูง
ก่อการทำงานแม้ในเชื้อ E. coli ในสายพันธุ์ 103, การแสดงออก
ของ PEGA pegR และดำเนินการเกี่ยวกับการก่อการ pQF50pA และ
pQF50pR ถูกชักนำโดย PEG 4000 แสดงให้เห็นว่าสิ่งเหล่านี้
โปรโมเตอร์ PEG-ตอบสนองอาจจะมีการควบคุมโดย PEGresponsive
หน่วยงานกำกับดูแล ในเชื้อ E. coli เก็บงำ pQF50pA, bgalactosidase
กิจกรรมไม่สามารถตรวจพบได้แม้ใน
การปรากฏตัวของ PEG 4000 ผลที่ได้นี้แสดงให้เห็นว่า PEGresponsive
ควบคุมสำหรับ PEGA ต้องมีอยู่ในสายพันธุ์ที่ 103 แต่
ไม่ได้อยู่ในเชื้อ E. coli

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ผลของหมุดโอเปอรอน

inducibility หกชิ้นส่วนดีเอ็นเอของยีนในกลุ่ม ( pegb , C , D , A ,
e r ) ถูกใช้เป็น RNA dot blot hybridization probes สำหรับ
การวิเคราะห์ 6 ยีนแสดงออกในหมุดกลาง แต่ไม่เช่น
ปานกลาง แสดงให้เห็นว่าพวกเขา inducible โดยตรึง
4000 แต่ไม่ใช่เช่น ( รูปที่ 1A ) ยีนแต่ละยีน
ยังตรวจพบโดย RT-PCR โดยใช้ไพรเมอร์
( รูปยีนที่เฉพาะเจาะจง1B ) RT pcrs ให้ขยายผลิตภัณฑ์ที่มีขนาดเดียวกัน
เป็นปกติโดยผลิตภัณฑ์ที่ใช้ดีเอ็นเอเป็น
แม่แบบ การควบคุมโดยทำการลบเตรียม
ย้อนกลับขั้นตอนให้ถอดความไม่ได้วงดนตรี การแสดง
ไม่ปนเปื้อน DNA RNA ที่ตรวจพบในตัวอย่าง ผลิตภัณฑ์นี้เท่านั้น

พบใน RNA ตัวอย่างจาก PEG 4000 ปลูกเซลล์ เราได้ออกแบบไพรเมอร์

ต่อไปขยายขอบเขตส่าของยีนที่อยู่ติดกันโดยใช้
เทคนิค RT-PCR . สี่ส่าภูมิภาคระหว่าง
ติดกันยีน ( pegb , C , D , และ E )
( รูปเพิ่ม 1C ) จากอาร์เอ็นเอตัวอย่างของ PEG 4000 โต
เซลล์ ผลลัพธ์เหล่านี้ชี้ให้เห็นว่า ห้าของยีน ( pegb , C , D และ E ,
) เป็นโอเปอรอน . การเปรียบเทียบเซลล์เติบโต เช่น
PEG 4000 แสดงว่า และการแสดงออกของ pegbcdae
โอเปอรอน และ pegr ถูกชักจูงโดยตรึง .
การวิเคราะห์ลองการภูมิภาคสำหรับ

pegbcdae โอเปอรอน เพื่อศึกษา ส่งเสริมกิจกรรมของ pegbcdae
โอเปอรอน เราสร้างพื้นที่ต้นน้ำของ pegb PEGA ,
pegr ในช่วงกว้างและโฮสต์เวกเตอร์ pqf50 . ในสื่อทั้งหมด
ทดสอบ กิจกรรม b-galactosidase ที่ตรวจพบใน S .
macrogoltabida ทั้งเครียดและ E . coli ภาคบังคับ mc4100 โดยไม่
pqf50 .พื้นฐานระดับการแสดงออกของ
pqf50 promoterless พบ 7 – 15 มิลเลอร์หน่วยใน E . coli น้อยกว่า 84 หน่วย มิลเลอร์
ใน S . macrogoltabida สายพันธุ์ 103 ( ตารางที่ 1 ) มากกว่า
1 ? 9-fold ระดับกิจกรรม b-galactosidase ถูกตรวจพบในเซลล์ที่กำลังจะเติบโต pqf50pb1

ยกเว้นสื่อทั้งหมด เช่น ผลนี้ชี้ให้เห็นว่า การถอดความของ
pegbcdae โอเปอรอน เริ่มจาก pegb promoter ,โดย
โดยหน่วยของ PEG 4000 กิจกรรมสูงยังตรวจพบ
ใน E . coli กับ pqf50pb1 , หมายถึงการทำงานสูง
โปรโมเตอร์ใน E . coli . ความเครียดใน 103 , แสดงออก
ของ PEGA และโปรโมเตอร์ pegr ดำเนินการ pqf50pa
pqf50pr และถูกชักจูงโดย PEG 4000 , ชี้ให้เห็นว่าเหล่านี้
ตรึงตอบสนองโปรโมเตอร์อาจถูกควบคุมโดย pegresponsive
ควบคุม . กับ pqf50pa ใน E . coli ,กิจกรรม bgalactosidase

จะไม่สามารถตรวจพบได้ในการปรากฏตัวของ PEG 4000 เลย ผลที่ได้นี้แสดงให้เห็นว่าการควบคุม pegresponsive
สำหรับ PEGA จะต้องมีอยู่ในสายพันธุ์แต่
ใน E . coli .