Materials and Methods2.1.Materials.

Materials and Methods

2.1.Materials. SclerotiafromaL.rhinoceruscultivar(TM02, supplied by Ligno Biotech, Selangor, Malaysia) which have been positively identified by their internal transcribed spacer (ITS) regions of the ribosomal RNA [9] were freeze-dried and milled into powder using 0.2 mm sieve to yield a light brown, dry fluffy powder with milk-like taste. Four cell lines were used in this study: MCF-7, the human breast carcinoma cell line; A549, the human lung carcinoma cell line; 184B5, the normal human breast cell line; NL 20, the normal human lung cell line. All four cell lines were purchased from American Type Culture Collection (ATCC) and were cultured with different media: RPMI-1640 (Lonza, USA) for MCF-7 and A549 cell lines, MEGM Mammary Epithelial Cell Growth Medium (MEGM Bullet kit) (Lonza, USA) for 184B5 cell line, and Ham’s F12 Medium (Lonza, USA) for NL 20 cell line. Growth media were enriched with 10% fetal bovine serum (FBS) (Sigma-Aldrich, USA) and supplemented with L-glutamine. Cells were grown in a humidified air with 5% CO2 at 37◦C. All other chemicals used were of analytical grade.
2.2 Preparation of Cold Water Extract of L. rhinocerus Scle- rotial Powder. 10g of L. rhinocerus sclerotial powder was dissolved in 100mL of the milli-Q water with continual stirring for 24 h at 4◦ C. The mixture was then centrifuged at 2,500 ×g, and the supernatant was collected and freeze-dried.
2.3. Determination of Total Carbohydrate and Protein Content.
Total carbohydrate content was determined by phenol- sulphuric acid method as described by Dubois et al. [10] using D-glucose as a standard. Protein concentration was determined by the Bradford method [11] using bovine serum albumin (BSA) as standard.
2.4.CytotoxicityAssay. ThecytotoxicactivityofL.rhinocerus cold water extract was determined by MTT (3,(4,5- dimethythiazol-2-yl)-2,3-diphenyl tetrazolium bromide) method. This assay was carried out according to the method described by Ahn et al. [12] with slight modifications. The cells with optimal cell density were seeded in 96-well
plate and incubated overnight for attachment. Different concentrations of the extracts were then added. After 72 hr incubation, MTT solution was added and incubated for 4 hr. All the solutions were then aspirated, and isopropanol was added to solubilize the formazan crystal. The absorbance was then determined by a microplate reader (Bio-Rad, USA) at 595 nm. Each measurement was performed in triplicates. The half-maximal inhibitory concentration (IC50) value was determined from the percentage of the cell viability versus final concentration of the extract curve.
2.5. DNA Fragmentation Studies. DNA fragmentation was used to investigate the mode of cell death induced by the L. rhinocerus cold water extract. Cells treated with IC50 dose of L. rhinocerus extract for 72 hr were harvested and lysed in a lysis buffer containing 1M Tris-HCI, 0.5M EDTA, Triton-X, and distilled water. The DNA was extracted by phenol : chloroform : isoamyl (25 : 24 : 1) mixture and precipitated with equal volume of ice-cold isopropanol. The DNA pellet was then dissolved in appropriate volume of RNase solution (10mg/mL RNase I) and incubated at 37◦C for 30min. DNA was electrophorized on a 1.2% agarose gel containing GelRed. Finally, the apoptotic DNA fragments were visualized under a UV transilluminator and photographed [13].
2.6. Fractionation of L. rhinocerus Extract. The cold water extract of L. rhinocerus sclerotia was fractionated by Sephad- ex G-50 gel filtration column (2.6 × 40 cm) pre-equilibrated with 0.05 M ammonium acetate buffer. Elution was carried out at a flow rate of 2 mL/min using 0.05 M ammonium acetate buffer. Carbohydrate and protein content of each fraction was determined. The cytotoxicity (against MCF-7 and A549 cell lines) of the high-molecular-weight and low- molecular-weight fractions was examined by MTT method.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

วัสดุและวิธีการ2.1.Materials SclerotiafromaL.rhinoceruscultivar (TM02 จัดทำ โดยเทคโนโลยีชีวภาพ Ligno เซลังกอร์ มาเลเซีย) ซึ่งบวกระบุขอบเขตของอาร์เอ็นเอ ribosomal [9] เป็นตัวเว้นวรรคใช้ทับภายใน (ของ) ของตน ถูกอบแห้ง และเป็นผงโดยใช้ตะแกรง 0.2 mm ให้ผลเป็นสีน้ำตาล แห้งนุ่มผงรสชาติเหมือนนมปลาย 4 เซลล์เส้นใช้ในการศึกษานี้: MCF-7 เต้านมมนุษย์ carcinoma เซลล์บรรทัด A549, carcinoma ปอดมนุษย์เซลล์บรรทัด 184B5 บรรทัดเซลล์เต้านมปกติที่มนุษย์ NL 20 รายการเซลล์ปอดมนุษย์ปกติ บรรทัดสี่เซลล์ทั้งหมดซื้อจากอเมริกาชนิดวัฒนธรรมในคอลเลกชัน (ATCC) และมีอ่างกับสื่อต่าง ๆ: RPMI-1640 (Lonza สหรัฐอเมริกา) สำหรับ MCF-7 A549 เซลล์เส้น MEGM ทางหน้าอก Epithelial เซลล์เจริญเติบโตปานกลาง (MEGM กระสุนชุด) (Lonza สหรัฐอเมริกา) สำหรับบรรทัดเซลล์ 184B5 และของแฮม F12 ขนาดกลาง (Lonza สหรัฐอเมริกา) สำหรับบรรทัด NL 20 เซลล์ เจริญเติบโตของสื่ออุดมไป ด้วย 10% ครรภ์วัวซีรั่ม (FBS) (Aldrich ซิก สหรัฐอเมริกา) และเสริม ด้วย L glutamine เซลล์ที่โตในอากาศ humidified กับ 5% CO2 ที่ 37◦C เคมีอื่น ๆ ใช้เกรดวิเคราะห์ได้2.2 การเตรียมของน้ำเย็นแยกของ L. rhinocerus Scle - ผง rotial L. rhinocerus sclerotial ผง 10 กรัมที่ละลายใน 100mL ของน้ำ Q กวนอย่างต่อเนื่องใน 24 ชมที่ค. 4◦ ส่วนผสมถูก centrifuged แล้วที่ 2500 × g และ supernatant ถูกรวบรวม และอบแห้ง2.3 การกำหนดรวมคาร์โบไฮเดรตและโปรตีนคาร์โบไฮเดรตรวมเนื้อหาที่ถูกกำหนด โดยวาง - ซัลฟุริกกรดวิธีอธิบายไว้โดย Dubois et al. [10] โดยใช้ D-กลูโคสเป็นมาตรฐาน ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนด โดยวิธีแบรดฟอร์ด [11] ใช้วัว serum albumin (บีเอสเอ) เป็นมาตรฐาน2.4.CytotoxicityAssay สารสกัดจากน้ำ ThecytotoxicactivityofL.rhinocerus ที่ถูกกำหนด ด้วยวิธี MTT (3,(4,5-dimethythiazol-2-yl)-2,3-ฟีนิลได tetrazolium โบรไมด์) วิเคราะห์นี้ถูกดำเนินตามวิธีการอธิบายไว้โดยอาห์น et al. [12] มีปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เซลล์ มีความหนาแน่นสูงสุดเซลล์ถูก seeded ใน 96-ดีแผ่น และ incubated สำหรับการแนบค้างคืน แล้วมีเพิ่มความเข้มข้นแตกต่างกันของสารสกัด หลังจาก 72 ชั่วโมงบ่ม โซลูชัน MTT ได้เพิ่ม และ incubated ใน 4 ชั่วโมง โซลูชั่นทั้งหมดได้แล้ว aspirated และ isopropanol ที่เพิ่ม solubilize คริสตัล formazan Absorbance ที่ถูกกำหนดแล้ว โดยตัวอ่าน microplate (Bio Rad สหรัฐอเมริกา) ที่ 595 nm แต่ละวัดที่ดำเนินการใน triplicates ค่าความเข้มข้นลิปกลอสไขครึ่งสูงสุด (IC50) ที่ถูกกำหนดจากเปอร์เซ็นต์ของชีวิตเซลล์เทียบกับความเข้มข้นสุดท้ายของเส้นโค้งของสารสกัด2.5 การศึกษาการกระจายตัวของ DNA การกระจายตัวของดีเอ็นเอถูกใช้เพื่อตรวจสอบวิธีการเซลล์ตายเกิดจากสารสกัดจากน้ำ rhinocerus L. เซลล์ที่รับการรักษา ด้วยยา IC50 ของสารสกัด rhinocerus L. สำหรับ 72 ชั่วโมงถูกเก็บเกี่ยว lysed ในบัฟเฟอร์ lysis ประกอบด้วย 1M ตรี hci, 0.5M EDTA ไตรตั้น-X และกลั่นน้ำ ดีเอ็นเอถูกแยก โดยวาง: คลอโรฟอร์ม: isoamyl (25:24:1) ผสม และตกตะกอนกับปริมาตร isopropanol ฉ่ำเท่านั้น เม็ดดีเอ็นเอแล้วไม่ละลายในปริมาณที่เหมาะสมของ RNase (10mg/mL RNase ฉัน) และ incubated ที่ 37◦C สำหรับ 30 นาทีดีเอ็นเอมี electrophorized บนวุ้น agarose 1.2% ประกอบด้วย GelRed สุดท้าย ชิ้นส่วนดีเอ็นเอของ apoptotic มี visualized ภายใต้ UV transilluminator และถ่าย [13]2.6 การแยกส่วนของ L. rhinocerus สารสกัดจาก สารสกัดน้ำของ L. rhinocerus sclerotia ถูกแบ่งตามอดีต Sephad G-50 เจกรองคอลัมน์ (2.6 × 40 ซม.) equilibrated ก่อน ด้วยบัฟเฟอร์ acetate แอมโมเนีย 0.05 M Elution ถูกดำเนินที่อัตราการไหล 2 mL/นาที โดยใช้บัฟเฟอร์ acetate แอมโมเนีย 0.05 M คาร์โบไฮเดรตและโปรตีนเนื้อหาของแต่ละส่วนที่ถูกกำหนด Cytotoxicity (กับรายการเซลล์ A549 และ MCF-7) ของส่วนสูงโมเลกุลน้ำหนัก และต่ำโมเลกุลน้ำหนักถูกตรวจสอบ ด้วยวิธี MTT

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

วัสดุและวิธีการ2.1.Materials SclerotiafromaL.rhinoceruscultivar (TM02 จัดทำโดย Ligno ชีวภาพลังงอร์, มาเลเซีย) ซึ่งได้รับการระบุในแง่บวกโดย spacer ถ่ายทอดภายในของพวกเขา (ITS) ภูมิภาคของอาร์เอ็นเอโซมอล [9] เป็นแห้งและแป้งเป็นผงโดยใช้ตะแกรง 0.2 มมให้ผลผลิต สีน้ำตาลอ่อน, ผงนุ่มแห้งที่มีรสชาติเหมือนนม สี่สายพันธุ์เซลล์ถูกนำมาใช้ในการศึกษานี้: MCF-7, เซลล์มะเร็งเต้านมของมนุษย์ A549, เซลล์มะเร็งปอดของมนุษย์ 184B5, เต้านมมนุษย์ปกติเซลล์; NL 20, ปอดมนุษย์ปกติเซลล์ ทั้งสี่สายพันธุ์เซลล์ที่ซื้อมาจากชาวอเมริกันประเภทวัฒนธรรมสะสม (ATCC) และถูกนำมาเลี้ยงกับสื่อที่แตกต่างกัน: RPMI-1640 (Lonza, ประเทศสหรัฐอเมริกา) สำหรับ MCF-7 และ A549 เซลล์, MEGM เต้านมเจริญเติบโตของเซลล์เยื่อบุผิวกลาง (MEGM ชุดกระสุน) ( Lonza, ประเทศสหรัฐอเมริกา) สำหรับเซลล์ 184B5 และแฮมปานกลาง F12 (Lonza, ประเทศสหรัฐอเมริกา) สำหรับ NL 20 สายพันธุ์ของเซลล์ สื่อการเจริญเติบโตถูกอุดมไปด้วย 10% ซีรั่มวัวของทารกในครรภ์ (FBS) (Sigma-Aldrich สหรัฐอเมริกา) และเสริมด้วย L-glutamine เซลล์ที่ถูกปลูกในอากาศความชื้นที่มี CO2 5% ที่37◦C ทั้งหมดสารเคมีอื่น ๆ ที่ใช้เป็นของเกรดวิเคราะห์. 2.2 การจัดทำน้ำเย็นสารสกัดจากแอ rhinocerus Scle- rotial ผง 10g ของ L. rhinocerus โครงสร้าง sclerotium ผงละลายใน 100mL ของน้ำหนึ่งในพัน-Q กับกวนอย่างต่อเนื่องเป็นเวลา 24 ชั่วโมงที่4◦ C. ส่วนผสมที่ถูกปั่นแล้วที่ 2,500 ×กรัมและใสถูกเก็บรวบรวมและแห้ง. 2.3 การวิเคราะห์ปริมาณคาร์โบไฮเดรตและโปรตีน. ปริมาณคาร์โบไฮเดรตทั้งหมดถูกกำหนดโดยวิธีกรดกำมะถัน phenol- ตามที่อธิบายไว้โดยดูบัวส์และคณะ [10] โดยใช้ D-กลูโคสเป็นมาตรฐาน ความเข้มข้นของโปรตีนที่ถูกกำหนดโดยวิธี Bradford [11] โดยใช้ซีรั่มอัลบูมิวัว (BSA) เป็นมาตรฐาน. 2.4.CytotoxicityAssay ThecytotoxicactivityofL.rhinocerus น้ำเย็นสารสกัดถูกกำหนดโดย MTT (3, (4,5- dimethythiazol-2-YL) -2,3-diphenyl โบรไมด์ tetrazolium) วิธีการ การทดสอบนี้ได้รับการดำเนินการตามวิธีการอธิบายโดย Ahn และคณะ [12] ที่มีการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เซลล์ที่มีความหนาแน่นของเซลล์ที่ดีที่สุดเป็นเมล็ดใน 96 หลุมจานและบ่มในชั่วข้ามคืนสำหรับสิ่งที่แนบ ความเข้มข้นที่แตกต่างกันของสารสกัดจากนั้นมีการเพิ่ม หลังจากการบ่ม 72 ชั่วโมง, การแก้ปัญหา MTT ถูกเพิ่มเข้ามาและบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมง โซลูชั่นทั้งหมดถูกสำลักแล้วและ isopropanol ถูกบันทึกอยู่ในละลายผลึก formazan การดูดกลืนแสงที่ถูกกำหนดแล้วโดยผู้อ่าน microplate (Bio-Rad, ประเทศสหรัฐอเมริกา) ที่ 595 นาโนเมตร วัดแต่ละคนได้ดำเนินการใน triplicates ครึ่งสูงสุดเข้มข้น (IC50) มูลค่าถูกกำหนดจากอัตราร้อยละของการมีชีวิตเมื่อเทียบกับเซลล์เข้มข้นสุดท้ายของเส้นโค้งสารสกัด. 2.5 การศึกษาการกระจายตัวของดีเอ็นเอ ดีเอ็นเอถูกนำมาใช้ในการตรวจสอบรูปแบบของการตายของเซลล์ที่เกิดจากลิตร rhinocerus สารสกัดจากน้ำเย็น เซลล์รับการรักษาด้วยยา IC50 ของสารสกัดจากแอ rhinocerus 72 ชั่วโมงถูกเก็บเกี่ยวและ lysed ในบัฟเฟอร์สลายที่มี 1M Tris-HCI, 0.5M EDTA, Triton-X และน้ำกลั่น ดีเอ็นเอถูกสกัดโดยฟีนอล: คลอโรฟอร์ม: isoamyl (25: 24: 1) ส่วนผสมและตกตะกอนมีปริมาณที่เท่ากันของ isopropanol เย็น เม็ดดีเอ็นเอก็เลือนหายไปแล้วในปริมาณที่เหมาะสมของการแก้ปัญหา RNase (10mg / mL RNase I) และบ่มที่อุณหภูมิ37◦Cสำหรับ 30 นาที ดีเอ็นเอ electrophorized ในเจล agarose 1.2% ที่มี GelRed สุดท้ายดีเอ็นเอ apoptotic ถูกมองเห็นภายใต้ transilluminator รังสียูวีและถ่ายภาพ [13]. 2.6 แยกของสารสกัดจากแอ rhinocerus สารสกัดจากน้ำเย็นของ sclerotia ลิตร rhinocerus ถูก fractionated โดย Sephad- อดีต G-50 คอลัมน์กรองเจล (2.6 × 40 ซม.) ก่อน equilibrated 0.05 M แอมโมเนียมอะซิเตทบัฟเฟอร์ elution ได้ดำเนินการที่อัตราการไหล 2 มิลลิลิตร / นาทีใช้ 0.05 M แอมโมเนียมอะซิเตทบัฟเฟอร์ เนื้อหาคาร์โบไฮเดรตและโปรตีนของแต่ละส่วนถูกกำหนด พิษ (กับ MCF-7 และ A549 เซลล์) ของน้ำหนักโมเลกุลสูงและเศษส่วนน้ำหนักโมเลกุลต่ำได้รับการตรวจสอบโดยวิธี MTT

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

วัสดุและวิธีการ

2.1.materials . sclerotiafromal . rhinoceruscultivar ( tm02 ที่จัดโดย ligno เทคโนโลยีชีวภาพ สลังงอร์ , มาเลเซีย ) ซึ่งได้รับการระบุภายในมีการทับศัพท์ ( PRRSV ) ภูมิภาคของโชเน็นจัมป์ [ 9 ] ถูกแช่แข็งและบดเป็นผง ใช้ตะแกรง 0.2 มม. ให้ผลผลิตแห้งฟูสีน้ำตาลอ่อน , ผงนม เช่น รสชาติสี่เซลล์ที่ใช้ในการศึกษานี้ mcf-7 มนุษย์เต้านมมะเร็งเซลล์บรรทัด a549 มนุษย์มะเร็งปอดเซลล์บรรทัด 184b5 , มนุษย์ปกติเซลล์เต้านมเส้น ; n1 20 , สายปกติเซลล์ปอดมนุษย์ ทั้งหมด 4 เส้น ซื้อมาจากเซลล์ชนิดรวบรวมวัฒนธรรมอเมริกัน ( ATCC ) และถูกเลี้ยงด้วยสื่อที่แตกต่างกัน : rpmi-1640 ( โล้นซ่า สหรัฐอเมริกา ) สำหรับ mcf-7 a549 เซลล์และเส้นmegm เซลล์เยื่อบุผิวเต้านมการเจริญเติบโตปานกลาง ( ชุดกระสุน megm ) ( Power , USA ) สำหรับเซลล์ 184b5 และแฮมปานกลาง F12 ( Power , USA ) เซลล์ผม 20 บรรทัด สื่อที่เติบโต 10% และอุดมด้วยเซรั่มของทารกในครรภ์ ( FBS ) ( ซิกม่า Aldrich , USA ) และเสริมด้วย Glutamine . เซลล์เติบโตขึ้นในอากาศด้วย CO2 humidified 5% ที่ 37 ◦ C ทั้งหมดอื่น ๆใช้ของสารเคมีอิตเทอร์เบียม .
22 เตรียมน้ำเย็น สารสกัดจาก L rhinocerus scle - ผง rotial . 10 . ระยะของ rhinocerus ผงละลายในน้ำ 100 ml ของ milli-q อย่างต่อเนื่องตลอด 24 ชั่วโมง ที่เร้าใจกับ 4 ◦ C ส่วนผสมเป็นระดับที่× 2500 กรัม และนำรวบรวมและแห้ง .
2.3 การหาปริมาณคาร์โบไฮเดรตทั้งหมด และปริมาณโปรตีน .
ปริมาณคาร์โบไฮเดรตทั้งหมดถูกกำหนดโดยกรดฟีนอล - วิธีตามที่อธิบายไว้โดยบัว et al . [ 10 ] ใช้ดี กูลโคสเป็นมาตรฐาน ความเข้มข้นของโปรตีนถูกกำหนดโดย Bradford วิธี [ 11 ] การใช้อัลบูมิน ( BSA ) เป็นมาตรฐาน .
2.4.cytotoxicityassay . thecytotoxicactivityofl.rhinocerus น้ำเย็นสกัดถูกกำหนดโดย MTT ( 3 , 4 , 5 - dimethythiazol-2-yl ) - 23-diphenyl tetrazolium โบรไมด์ ) วิธี การทดสอบนี้กระทำตามวิธีการที่อธิบายโดยอาน et al . [ 12 ] กับการปรับเปลี่ยนเล็กน้อย เซลล์มีความหนาแน่นเซลล์ที่เหมาะสมคือ เมล็ดใน 96 ดี
จานและบ่มค้างคืนสำหรับสิ่งที่แนบมา ระดับความเข้มข้นของสารสกัด แล้วเพิ่ม หลังจาก 72 ชั่วโมงระยะเวลา MTT โซลูชั่นเพิ่มบ่มเป็นเวลา 4 ชั่วโมงโซลูชั่นทั้งหมด แล้วสูดลมหายใจเข้า และไอโซโพรพานอลถูกเพิ่ม solubilize ที่ปฏิบัติการคริสตัล นถูกกำหนดโดยพื้นที่ภาคเหนือของประเทศไทย ( อ่านอเมริกาไบแรด ) ที่ 595 นาโนเมตร แต่ละวัดทำ 3 ซ้ำ . ครึ่ง ( ic50 ) ค่าความเข้มข้นสูงสุดที่สามารถถูกกำหนดจากค่าร้อยละของเซลล์และสารสกัดความเข้มข้นสุดท้ายของโค้ง .
2.5การศึกษาการกระจายตัวของดีเอ็นเอ การใช้ดีเอ็นเอตรวจสอบโหมดของการตายของเซลล์ที่เกิดจาก L rhinocerus น้ำเย็นสารสกัด เซลล์ที่ได้รับการรักษาด้วย ic50 สารสกัด L . rhinocerus 72 ชม. เก็บ lysed ในการสลายบัฟเฟอร์ที่มี 1m หรือกรดไฮโดรคลอริก 0.5 EDTA , triton-x และน้ำกลั่น ดีเอ็นเอที่สกัดด้วยคลอโรฟอร์มในปริมาณฟีนอล : : ( 25 : 24 :1 ) ผสมและตกตะกอนที่มีปริมาณเท่ากันของไอโซโพรพานอลน้ำแข็งเย็น ดีเอ็นเอเป็นเม็ดแล้วละลายในปริมาณที่เหมาะสมของเลส โซลูชั่น ( 10 mg / ml เลส ) บ่มที่ 37 องศาเซลเซียสเป็นเวลา 30 นาที◦ดีเอ็นเอคือ electrophorized บน 1.2 % เจลที่มี gelred . สุดท้าย ชิ้นส่วนดีเอ็นเอในกลุ่มที่มีกำลังมองเห็นภายใต้ยูวี transilluminator และถ่ายภาพ [ 13 ] .
2.6 องค์ประกอบของ Lสารสกัดจาก rhinocerus . เย็นสารสกัดด้วยน้ำของ L . rhinocerus ที่มีถูกพบโดย sephad - อดีต G-50 คอลัมน์เจลฟิล ( 2.6 × 40 ซม. ) ก่อน equilibrated กับ 0.05 M แอมโมเนียมอะซิเตตบัฟเฟอร์ ได้มาดำเนินการที่อัตราการไหล 2 มล. / นาทีใช้ 0.05 M แอมโมเนียมอะซิเตตบัฟเฟอร์ คาร์โบไฮเดรตและโปรตีนของแต่ละส่วนที่ถูกกำหนดไว้ความเป็นพิษกับเซลล์และ mcf-7 a549 ) น้ำหนักโมเลกุลสูงและน้ำหนักโมเลกุลต่ำและถูกตรวจสอบโดยวิธี MTT .