Efficiency of FPNI-PCRFPNI-PCR faci

Efficiency of FPNI-PCR

FPNI-PCR facilitates the rapid identification of target genomic sequences by permitting the use of short-cuts for a number of the steps between tissue isolation and target product sequencing, thereby reducing the input of time and effort compared to other current methods of flanking sequence cloning. For example, FPNI-PCR can be employed to generate target genomic products when cell lysates are used to supply the DNA templates (Figure ​(Figure4).4). For this procedure, we extracted cell lysates from the young leaves of transgenic tobacco, petunia hybrida and Rosa hybrida using the rapid NaOH extraction method. We found no difference in the success of target product amplification from these cell lysates compared to that from the higher quality DNA templates as purified by the CTAB method. In addition, we found no differences between the results of direct sequencing of the FPNI-PCR products compared to indirect sequencing of the cloned products within the PMD18-T vector. FPNI-PCR has the advantage that, after the first step (12-15 cycles), we can proceed to the second step directly, without requiring the prior dilution of the products from the first PCR step. When using such practices, we commonly achieved > 85% positive cloning of target products following the secondary PCR reaction. Thus, we were able to amplify target products using just 42-45 PCR cycles, and this was completed in less than 3 hours from the start of tissue extraction. When proceeding through the third PCR and final sequencing steps, FPNI-PCR was found to provide 100% positive results in our working tests of genomic cloning. In total, the procedure was completed in just 54-57 cycles, taking less than 4 hours.

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

ประสิทธิภาพของ fpni-pcr

fpni-pcr อำนวยความสะดวกในการระบุอย่างรวดเร็วของเป้าหมายลำดับจีโนมโดยอนุญาตให้ใช้ตัดสั้นสำหรับจำนวนขั้นตอนการแยกระหว่างเนื้อเยื่อและการจัดลำดับผลิตภัณฑ์เป้าหมายจึงช่วยลดการป้อนข้อมูลของเวลาและความพยายามเมื่อเทียบกับ ปัจจุบันวิธีการอื่น ๆ ของขนาบลำดับโคลน ตัวอย่างเช่นfpni-PCR สามารถทำงานเพื่อสร้างเป้าหมายผลิตภัณฑ์จีโนมเมื่อ lysates เซลล์ที่ใช้ในการจัดหาแม่ dna (รูป (figure4) 0.4) สำหรับขั้นตอนนี้เราสกัด lysates เซลล์จากใบอ่อนของยาสูบ, เพ็ตทูเนีย hybrida และ rosa hybrida โดยใช้วิธีการสกัด naoh อย่างรวดเร็วเราพบความแตกต่างในความสำเร็จของการขยายผลิตภัณฑ์เป้าหมายจาก lysates เซลล์เหล่านี้เมื่อเทียบกับที่สูงขึ้นจากแม่แบบที่มีคุณภาพเป็น dna บริสุทธิ์โดยวิธี ctab นอกจากนี้เราพบความแตกต่างระหว่างผลที่ได้จากการเรียงลำดับโดยตรงของผลิตภัณฑ์ fpni-PCR เมื่อเทียบกับการจัดลำดับทางอ้อมของผลิตภัณฑ์โคลนภายใน pmd18 t-เวกเตอร์ fpni-pcr มีข้อได้เปรียบที่หลังจากขั้นตอนแรก (12-15 รอบ) เราสามารถดำเนินการต่อไปขั้นตอนที่สองโดยตรงโดยไม่ต้องเจือจางก่อนของผลิตภัณฑ์ที่ได้จากขั้นตอนแรก pcr เมื่อใช้การปฏิบัติเช่นนี้เราประสบความสำเร็จร่วมกัน> 85% โคลนบวกของผลิตภัณฑ์เป้าหมายดังต่อไปนี้ปฏิกิริยา pcr รอง ทำให้เราสามารถที่จะขยายผลิตภัณฑ์เป้าหมายโดยใช้เพียง 42-45 รอบ PCR,และจะเสร็จสมบูรณ์ในน้อยกว่า 3 ชั่วโมงจากจุดเริ่มต้นของการสกัดเนื้อเยื่อ เมื่อดำเนินการผ่าน pcr ที่สามและขั้นตอนลำดับสุดท้าย fpni-PCR พบว่าให้ผลบวก 100% ในการทดสอบการทำงานของเราในการโคลนจีโนม รวมขั้นตอนการแล้วเสร็จในเวลาเพียง 54-57 รอบการน้อยกว่า 4 ชั่วโมง

ผลลัพธ์ (ไทย) 2:

ประสิทธิภาพของ FPNI PCR

FPNI PCR ช่วยรหัสลำดับ genomic เป้าหมายอย่างรวดเร็ว โดยการอนุญาตให้ใช้ทางลัดสำหรับจำนวนขั้นตอนระหว่างการแยกเนื้อเยื่อเป้าหมายผลิตภัณฑ์ลำดับ จึงช่วยลดเวลาและความพยายามเปรียบเทียบกับวิธีอื่น ๆ ปัจจุบัน flanking โคลนลำดับการป้อน ตัวอย่าง FPNI PCR สามารถจ้างงานการสร้างผลิตภัณฑ์ genomic เป้าหมายเมื่อเซลล์ lysates จะใช้ในการจัดหาแบบดีเอ็นเอ (รูป (Figure4) .4) สำหรับขั้นตอนนี้ เราแยกเซลล์ lysates จากใบอ่อนของถั่วเหลืองยาสูบ petunia hybrida และ Rosa hybrida ใช้วิธีแยก NaOH อย่างรวดเร็ว เราพบไม่แตกต่างในความสำเร็จของเป้าหมายขยายผลิตภัณฑ์จาก lysates เซลล์เหล่านี้เปรียบเทียบกับจากแม่แบบดีเอ็นเอมีคุณภาพสูงเป็นบริสุทธิ์โดยวิธี CTAB นอกจากนี้ เราพบไม่มีความแตกต่างระหว่างผลลัพธ์ของลำดับโดยตรงผลิตภัณฑ์ FPNI PCR เปรียบเทียบกับลำดับทางอ้อมของผลิตภัณฑ์โคลนภายในเวกเตอร์ PMD18 T FPNI-PCR มีข้อดีที่ หลังจากขั้นตอนแรก (12-15 รอบ), เราจะสามารถดำเนินขั้นตอนสองโดยตรง โดยไม่ต้องเจือจางก่อนผลิตภัณฑ์จาก PCR ขั้นตอนแรกของการ เมื่อใช้นั้น เรามักสำเร็จ > 85% บวกโคลนของผลิตภัณฑ์เป้าหมายต่อปฏิกิริยา PCR รอง ดังนั้น เราก็สามารถขยายผลิตภัณฑ์เป้าหมายโดยใช้รอบการ PCR เพียง 42-45 และนี้เสร็จในเวลาน้อยกว่า 3 ชั่วโมงจากการสกัดเนื้อเยื่อ ดำเนินการผ่าน PCR ที่สามและขั้นตอนลำดับขั้นสุดท้าย FPNI PCR พบให้ผลบวก 100% ในการทดสอบการทำงานของเราของ genomic โคลน รวม ขั้นตอนเสร็จในรอบเพียง 54-57 ใช้เวลาน้อยกว่า 4 ชั่วโมง

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

ประสิทธิภาพ การทำงานของ fpni - pcr

fpni - pcr เพื่ออำนวยความสะดวกให้อย่างรวดเร็วการระบุตัวตนของกลุ่มเป้าหมายโดยเมื่อ สภาพ อากาศเอื้ออำนวย genomic ลำดับที่ใช้ของในระยะทางสั้นๆเพื่อไป - ตัดสำหรับหมายเลขของขั้นตอนระหว่างเนื้อเยื่อและการแยกตัวออกไปกลุ่มเป้าหมายการจัดลำดับของ ผลิตภัณฑ์ ซึ่งจะส่งผลให้ลดการป้อนข้อมูลของเวลาและความพยายามอื่นๆในปัจจุบันเมื่อเทียบกับวิธีการของขนาบข้างตามลำดับการลอกแบบ. ตัวอย่างเช่นfpni - pcr สามารถนำมาใช้เพื่อสร้าง ผลิตภัณฑ์ genomic เป้าหมายเมื่อ lysates เซลล์จะใช้พาวเวอร์ซัพพลายแม่แบบดีเอ็นเอ(รูปที่ ​ (รูปที่ 4 ) 4 ) สำหรับขั้นตอนนี้เราจะถูกแยกออกมาจากห้องขัง lysates ใบหนุ่มของโรงงานยาสูบข้ามพันธุ์ hybrida Rosa และ hybrida petunia โดยใช้วิธีสกัดโซดาไฟอย่างรวดเร็วเราไม่พบความแตกต่างในความสำเร็จของการขยาย ผลิตภัณฑ์ กลุ่มเป้าหมายจาก lysates เซลล์เหล่านี้เมื่อเทียบกับที่ดีเอ็นเอจากแม่แบบ คุณภาพ สูงขึ้นมากโดยใช้วิธีการ ctab บริสุทธิ์ได้ นอกจากนี้ยังพบว่าเราไม่มีความแตกต่างระหว่างผลที่ได้จากการจัดลำดับโดยตรงของสินค้า fpni - pcr ซึ่งเมื่อเทียบกับการจัดลำดับโดยอ้อมของ ผลิตภัณฑ์ ที่ถูกโคลน ภายใน เวกเตอร์ pmd 18 - T fpni - pcr ได้รับประโยชน์ที่หลังจากทำตามขั้นตอนแรก( 12-15 12-15 12-15 รอบ)เราจะสามารถไปยังขั้นตอนที่สองโดยตรงโดยไม่ต้องมัวหมองก่อนของสินค้าจากขั้นตอนที่ pcr ครั้งแรก เมื่อใช้การปฏิบัติเช่นเราใช้กันอยู่ทั่วไปทำได้> 85% ในเชิงบวกการลอกแบบของตัวสินค้าเป้าหมายต่อไปนี้:ปฏิกริยา pcr รอง ดังนั้นเราจึงสามารถที่จะขยายสินค้าเป้าหมายการใช้เพียง 42-45 รอบ pcrโรงแรมแห่งนี้เป็นที่เรียบร้อยแล้วและในเวลาไม่ถึง 3 ชั่วโมงจากเริ่มที่เนื้อเยื่อของการแยกข้อมูล เมื่อการดำเนินการผ่านขั้นตอนการจัดลำดับสุดท้าย pcr และที่สาม fpni - pcr พบว่าให้ผลการค้นหาในเชิงบวก 100% ในการทดสอบการทำงานของเราของ genomic การลอกแบบ ในขั้นตอนนี้รวมเป็นที่เรียบร้อยแล้วในระยะเวลาเพียง 54-57 รอบใช้เวลาไม่เกิน 4 ชั่วโมง