Colonies obtained on MRS agar were

Colonies obtained on MRS agar were extracted and
transferred to 10 mL of broth culture for the enrichment
step. After 24 h of incubation (37°C), screening for isolates
was performed through a primary morphological test
with the use of a fluorescent microscope (BX61; Olympus)
(Olympus, Tokyo, Japan) and biochemical tests,
such as Gram staining and catalase tests. The isolates were
stored in 30% (w/v) glycerol and 10% (w/v) skim milk at

70°C (Mirzaei and Barzgari 2012).
Amplification of 16S rRNA
The amplification of 16S rRNA of Lactobacillus strains
was performed by using one primer pair (16F27 50
-
AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-30 and 16R 50
-TACCTTG
TTAGGACTTCACC-30
), as previously reported by Mirzaei
and Barzgari (2012). These primers are genus-specific
and can directly amplify the 16S rRNA (1500 bp) of Lactobacillus
strains. The amplification was performed with a
25 lL final volume containing 0.4 lmol/L primer, 40 ng
of chromosomal DNA, and master mix (Ampliqon, Herlev,
Denmark). The PCR program cycles were set up as
follows: denaturation at 95°C for 4 min, 32 cycles of
94°C for 1 min, 58°C for 1 min, 72°C for 95 sec, and a
final extension at 72°C for 5 min.
Sequencing of amplified 16S rRNA
The amplified 16S rRNA were purified by using a QIAquick
PCR purification kit (Qiagen, Hilden, Germany) according
to the manufacturer’s instructions and then sequenced by
a Korean sequencing company (Macrogene). The isolates
were then identified and discriminated by blasting their
sequences with BLAST software (http://blast.ncbi.nlm.
nih.gov/Blast.cgi). The strains were then compared with the
sequences deposited in NCBI and GenBank.
Low pH and high concentrations of bile salts
tolerance tests
Bacterial stocks were incubated in 5 mL of MRS growth
medium at 37°C for 24 h. Then, 200 lL of bacterial
media were incubated in 5 mL of fresh medium for
another 24 h. Bacterial cells were suspended by centrifuging
at 2000g for 15 min and then washed twice with PBS
(Phosphate-buffered saline). Thereafter, the cells were resuspended
in adjusted PBS (1 mL) with pH 2.5 or mediaTHIO
(thioglycollate media) broth (37°C) for 3 h. The
media-THIO broth was prepared by mixing MRS broth
with 0.3% (w/v) oxgall and 0.2% (w/v) sodium thioglycollate
(Sigma, St. Louis, MO, USA). The resistant cells
were isolated, and their survival rates were calculated by
using the pour plate technique in agar media; the

ผลลัพธ์ (ไทย) 1:

อาณานิคมที่ได้รับบน MRS agar ถูกสกัด และโอนย้ายไป 10 mL ของซุปวัฒนธรรมสำหรับการเติมเต็มขั้นตอนการ หลังจาก 24 ชมของคณะทันตแพทยศาสตร์ (37° C), การคัดกรองการแยกมีดำเนินการผ่านการทดสอบของหลักด้วยการใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง (BX61 โอลิมปัส)(โอลิมปัส โตเกียว ญี่ปุ่น) และการ ทดสอบชีวเคมีเช่นกรัมย้อมสีและ catalase ทดสอบ แยกได้เก็บไว้ในกลีเซอร 30% (w/v) และ 10% (w/v) skim นมที่70° C (Mirzaei และ Barzgari 2012)ขยายของ 16S rRNAขยายของ 16S rRNA ของสายพันธุ์แลคโตบาซิลลัสทำ โดยใช้รองพื้นหนึ่งคู่ (16F27 50-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-30 และ 16R 50-TACCTTGTTAGGACTTCACC-30), เป็นก่อนหน้านี้ รายงาน โดย Mirzaeiและ Barzgari (2012) ไพรเมอร์เหล่านี้มีเฉพาะสกุลและสามารถขยายได้โดยตรง 16S rRNA (1500 bp) ของแลคโตบาซิลลัสสายพันธุ์ ทำการขยายด้วยการ25 จะสุดท้ายไดรฟ์ข้อมูลรองพื้น lmol 0.4 L, 40 ngของโครโมโซมดีเอ็นเอ และต้นแบบผสม (Ampliqon, Herlevเดนมาร์ก) วงจรโปรแกรม PCR ถูกตั้งค่าเป็นดังต่อไปนี้: denaturation ที่ 95° C สำหรับ 4 นาที 32 รอบของ94 องศาเซลเซียสใน 1 นาที 58 องศาเซลเซียสใน 1 นาที 72° C ใน 95 วินาที และส่วนขยายที่สุดท้ายที่ 72° C สำหรับ 5 นาทีลำดับของขยาย 16S rRNA16S เอาต์ที่ rRNA ที่บริสุทธิ์ โดยใช้การ QIAquickPCR ฟอกชุด (Qiagen, Hilden เยอรมนี) ตามให้คำแนะนำของผู้ผลิต และจากนั้น เรียงลำดับตามบริษัทเกาหลีลำดับ (Macrogene) การแยกได้ระบุ แล้ว discriminated โดยระเบิดของพวกเขาลำดับกับซอฟต์แวร์ระเบิด (http://blast.ncbi.nlmnih.gov/Blast.cgi) สายพันธุ์ถูกแล้วเปรียบเทียบกับการลำดับที่ฝากใน GenBank NCBIค่า pH ต่ำและสูงความเข้มข้นของเกลือน้ำดีทดสอบการยอมรับหุ้นจากแบคทีเรียถูก incubated ใน 5 mL ของนางเจริญเติบโตกลางที่ 37° C ใน 24 ชม แล้ว 200 จะของแบคทีเรียสื่อถูก incubated ใน 5 mL ของสดปานกลาง24 h. อีกเซลล์แบคทีเรียถูกหยุดชั่วคราว โดย centrifugingที่ g 2000 สำหรับ 15 นาที และล้าง ด้วย PBS สองครั้งแล้ว(Buffered ฟอสเฟตน้ำเกลือ) หลังจากนั้น มี resuspended เซลล์ในการปรับปรุง PBS (1 มล) มีค่า pH 2.5 หรือ mediaTHIO(thioglycollate media) ซุป (37° C) สำหรับ 3 h. การซุป THIO สื่อถูกเตรียม โดยผสมนางซุป0.3% (w/v) oxgall และ thioglycollate โซเดียม 0.2% (w/v)(ซิก St. Louis, MO สหรัฐอเมริกา) เซลล์ทนต่อได้แยก และมีคำนวณอัตราการอยู่รอดโดยการใช้เทคนิคจานเทใน agar media ที่

ผลลัพธ์ (ไทย) 3:

อาณานิคมได้รับนางวุ้นสกัดและ
โอน 10 มิลลิลิตร น้ำซุปสำหรับวัฒนธรรมการ
ขั้นตอน หลังจาก 24 ชั่วโมงที่ 1 ( 37 ° C ) , การตรวจเชื้อ
แสดงผ่านหลักของการทดสอบ
ด้วยการใช้กล้องจุลทรรศน์เรืองแสง ( bx61 ; โอลิมปัส ( Olympus )
, โตเกียว , ญี่ปุ่น ) และการทดสอบทางชีวเคมี
เช่นกรัม staining และการทดสอบสามารถ . โดย
ไอโซเลทเก็บไว้ใน 30 % ( w / v ) และกลีเซอรอล 10 % ( w / v ) หางนมผงที่

70 ° C ( mirzaei และ barzgari 2012 )
( ของ 16S rRNA ของ 16S rRNA (

ของแลคโตบาซิลลัสสายพันธุ์ได้ โดยใช้ไพรเมอร์คู่ ( 16f27 50
-
agagtttgatcmtggctcag-30 และ 16r 50
-

taccttg ttaggacttcacc-30 ) ที่รายงานว่า ก่อนหน้านี้ โดย mirzaei
และ barzgari ( 2012 ) ไพรเมอร์เหล่านี้
เฉพาะสกุลและโดยตรงสามารถขยาย 16S rRNA ( 1500 BP ) ของเชื้อ Lactobacillus

การเพิ่มปริมาณได้ด้วย
25 จะสุดท้ายที่มีปริมาณ 0.4 lmol ลิตรรองพื้น 40 ng
ของโครโมโซมดีเอ็นเอ และอาจารย์ผสม ( ampliqon เฮอ
, , เดนมาร์ก ) โปรแกรมโดยรอบถูกตั้งค่าเป็น
ดังนี้ : ( 95 องศา C เป็นเวลา 4 นาที 32 รอบ
94 ° C เป็นเวลา 1 นาที 58 องศา C เป็นเวลา 1 นาที 72 ° C 95 วินาทีและ
สุดท้ายที่ 72 ° C ) เป็นเวลา 5 นาที ลำดับเบส 16S rRNA ของเบส

เบสเบส 16S rRNA เป็นบริสุทธิ์ โดยการใช้เชื้อบริสุทธิ์ชุด ( เพิ่ม qiaquick
,
Hilden เยอรมนี ) ตามคำแนะนำของผู้ผลิต จากนั้นทำการโดย
บริษัทจัดลำดับเกาหลี ( macrogene ) การระบุและจำแนกสายพันธุ์
แล้วโดยลำดับของพวกเขาระเบิด
กับซอฟต์แวร์ระเบิด ( ระเบิดที่ http / / : .ncbi . nlm .
nih gov . ระเบิด / CGI ) สายพันธุ์ที่ถูกเปรียบเทียบกับลำดับฝากไว้ในขนาดและ ncbi
.
pH ต่ำ และความเข้มข้นสูงของน้ำดีเกลือ

ยอมรับการทดสอบแบคทีเรียหุ้น ) 5 มิลลิลิตรอาหารเลี้ยงเชื้อ MRS ที่ 37 ° C
เป็นเวลา 24 ชั่วโมง แล้ว 200 จะของแบคทีเรีย
สื่อ ) 5 ml ) สด
อีก 24 ชั่วโมง เซลล์แบคทีเรียที่ถูกระงับโดยการเซนตริฟิว
ที่ 2000g 15 นาทีแล้วล้างซ้ำด้วย PBS
( ฟอสเฟตบัฟเฟอร์น้ำเกลือ ) หลังจากนั้นเซลล์ก็ resuspended
PBS ( 1 มิลลิลิตร ) ในการปรับ pH 2.5 หรือ mediathio
( thioglycollate สื่อ ) ซุป ( 37 ° C ) 3 H .
สื่อเทียว broth เตรียมโดยการผสมอาหารเหลว MRS
0.3% ( w / v ) และ oxgall 0.2% ( w / v ) thioglycollate โซเดียม
( Sigma , St . Louis , MO , USA ) ป้องกันเซลล์
ถูกแยกและอัตราการอยู่รอดของตนเองได้ โดยการใช้เทคนิคในการเท
แผ่นวุ้นสื่อ